文摘
背景。线粒体分裂的无节制的主要贡献者之一在缺血再灌注损伤(IRI)和间充质基质细胞(msc)派生细胞外囊泡一直被视为一个潜在的治疗方法。在这里,我们假设细胞外囊泡(EVs)源自人类沃顿果冻间充质基质细胞(hWJMSCs)改善急性肾功能IRI通过抑制线粒体分裂miR-30b / c / d。方法。EVs隔离条件中等的MCS在大鼠静脉注射后立即单边切除肾椎弓根阻塞了45分钟。动物被牺牲在再灌注后24 h和样本收集。MitoTracker红染色法被用来看到线粒体的形态。DRP1的表达是通过免疫印迹来衡量的。miR-30 EVs和鼠肾小管上皮细胞中存在的评估。细胞凋亡通路被免疫染色鉴定。结果。我们发现miR-30在受伤的肾组织的表达下降,线粒体动态转向裂变。但他们都恢复了电动汽车集团与细胞凋亡减少。更重要的是,当miR-30 antagomirs被用来减少miRNA级别,所有电动汽车的相关影响显著减少。结论。单一管理hWJMSC-EVs可以通过抑制线粒体保护肾脏IRI通过miR-30裂变。
1。介绍
肾缺血再灌注损伤(IRI)是一种急性肾损伤(AKI)的主要原因,经常发生在肾移植的上下文中,败血症、休克(1,2]。当损伤严重,不完整的肾复苏可能导致成纤维细胞的增殖和细胞外基质的过度沉积3]。因此,高危AKI患者终末期肾病的发展(4,5]。
在多个致病的机制,如炎症反应、细胞凋亡和氧化损伤(1),证据表明线粒体动力学在IRI的角色6]。线粒体是一种动态的细胞器,不断发生核裂变和核聚变(7]。在内部或细胞外压力,线粒体动力学是转移到裂变的状态,导致线粒体分裂和细胞凋亡7,8]。Dynamin-related蛋白1 (DRP1),线粒体分裂的关键调节器(7,8),据报道迅速被激活后阿基(6,8,9]。值得注意的是,通过显性负突变或抑制DRP1药理抑制剂midivi-1可能会阻止线粒体分裂和防止肾脏缺血或顺铂肾毒性阿基(6,10]。这些研究表明,DRP1缺血可能是一个重要的治疗目标。
小分子核糖核酸(microrna)小守恒的RNA分子与潜在角色在调节基因表达在转录后的水平11]。后绑定到目标mRNA, microrna与他们形成一个复杂和降低蛋白质含量有辱人格的目标基因的信使rna或抑制翻译(11,12]。microrna控制广泛的生物学过程,包括细胞增殖、凋亡、应激反应(13]。microrna参与肾脏疾病的发病机制,有可能操纵microrna的达到治疗效果(14,15]。
间充质基质细胞(msc)是广泛调查他们的肾脏修复财产通过旁分泌/内分泌机制(16,17]。细胞外囊泡(EVs)源自msc被描述为一种新颖的途径的细胞间的相互作用和内分泌的一个关键18]。这些膜结构提供外源性功能mrna和微- rnas序列从IRI靶细胞和保护肾脏15,19]。然而,少了电动汽车的研究专注于他们的microrna的调节功能。鉴于miR-30报道通过DRP1通路调节线粒体分裂在心肌细胞20.),我们假设人类沃顿果冻msc (hWJMSCs)派生EVs可能参与线粒体通过miR-30裂变的调制,从而防止肾脏IRI。
本研究的目的是调查可能的hWJMSC-EVs治疗机制。我们证明了hWJMSC-EVs可能改善急性肾功能IRI的抑制线粒体通过miR-30裂变。
2。实验程序
2.1。细胞培养
新鲜的人类脐带通常在分娩后丢弃得到父母的书面同意。这个实验是研究伦理委员会批准在上海综合医院隶属于上海交通大学(许可证号码:2013 ky018)。人类脐带传递和存储在寒冷的汉克的平衡盐溶液(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),然后细胞隔离开始在4 h。如前所述(标识的hWJMSCs被孤立,21]。简单,消除脐带血管间质组织切成1毫米3块,然后单独坚持文化板块的衬底,紧随其后的是血糖过低的杜尔贝科修改鹰的介质(美国Gibco BRL有限公司DMEM)含10%胎牛血清(美国的边后卫,Gibco BRL有限公司)在37°C在湿润的气氛中公司为5%2。每两天中被改变。大约两周后的文化,贴壁细胞收获0.25%胰蛋白酶(Gibco BRL有限公司美国)治疗和亚文化。只有三到六通道细胞用于进一步的实验。
从SD大鼠肾小管上皮细胞分离(80 - 100 g)肾脏。皮质组织被绞进1毫米3和0.1胶原酶消化我(美国Gibco BRL有限公司)和离心机在32% Percoll介质净化近端小管细胞。细胞被镀在collagen-coated菜肴和维护在DMEM / F-12中补充10%的边后卫。
2.2。转染的microrna Antagomir
antagomirs旨在抑制内源性miR-30成员的表达,从Ribobio Antagomir -得到了控制。msc的浓度与antagomir cocultured 50 nM 24 h。在那之后,我们改变了文化另一个24小时之前使用的解决方案。
的顺序miR-30b antagomir 5′-AGCUGAGUGUAGGAUGUUUACA-3′;miR-30c antagomir 5′-GCUGAGAGUGUAGGAUGUUUACA-3′;miR-30d antagomir 5′-CUUCCAGUCGGGGAUGUUUAGA-3′。
2.3。隔离的电动汽车
电动汽车得到的上层清液hWJMSCs像之前描述的21,22]。简而言之,hWJMSCs在DMEM培养没有的边后卫和添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)在一夜之间(Sigma-Aldrich)。细胞的生存能力培养过夜是> 99%台盼蓝排斥,没有探测到检测凋亡细胞通过末端脱氧核苷转移酶介导dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定。条件培养基收集和储存在−80°C。媒介在2000×g离心20分钟删除碎片,然后离心器在100000×g SW41摆动转子(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)一小时在4°C。电动汽车用无血清M199清洗一次(Sigma-Aldrich)包含25毫米玫瑰(pH = 7.4),报第二次超速离心法在相同的条件下。电动汽车被储存在−80°C的实验。量化蛋白质含量,布拉德福德蛋白质分析工具包(P0006、Beyotime生物技术研究所、中国)是布拉德福德试验中使用。我们量化的间接根据5×105msc释放约100μg EVs过夜。RNA提取EVs利用试剂盒试剂分光光度计进行了分析。
2.4。ATP耗竭治疗
肾小管上皮细胞在glucose-free叠氮化处理10毫米,glutamine-free DMEM(美国Gibco) 2小时。然后,媒介改变了正常的DMEM / F12 2小时再灌注。EVs治疗组,20μg EVs被添加到中等再灌注。在孵化后,细胞分离或固定在接下来的分析。
2.5。动物模型的单边肾IRI
所有的工作涉及动物是按照动物使用协议制定的制度动物保健和使用委员会的医学院,上海交通大学。在雄性SD大鼠动物模型进行(180 - 200 g),右肾切除,缺血45分钟。Sham-treated动物以类似的方式处理,除了肾血管没有夹紧。总共有100μg EVs 1毫升的车辆(M199 Gibco BRL有限公司美国)或共1毫升的车辆只有通过尾静脉注射后立即再灌注。动物们被分成不同的组根据不同的治疗程序。我们使用至少6为每组大鼠:(1)虚假的();(2)车辆();(3)电动汽车();(4)电动汽车+ antagomir控制();(5)EVs + antagomir miR-30b ();(6)EVs + antagomir miR-30c ();(7)EVs + antagomir miR-30d ();(8)EVs + antagomir miR-30b / c / d ()。老鼠被牺牲在24小时。血液和肾脏样本收集和提交相应的考试。
2.6。线粒体染色和成像
肾小管上皮细胞poly-L-lysine镀在盖玻片上涂上0.01%。治疗后,他们沾了20分钟和0.02毫米MitoTracker红CMXRos(分子探针)。然后,他们用多聚甲醛固定另一个20分钟,与DAPI染色。线粒体是用激光扫描共焦显微镜成像(徕卡SP8)。对于每一个样本,几个随机领域的细胞(≥100细胞/字段)对线粒体形态进行了评估。
2.7。肾功能
均获得血液样本测量等离子体包和肌酐。血清肌酐和包被贝克曼分析仪测量II(贝克曼仪器,Inc .)。
2.8。免疫组织化学和TUNEL分析
肾组织的一个部分是固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡。4嗯厚部分用鼠标抗体标记大鼠半胱天冬酶9(稀释1:250;罗氏)其次是辣根过氧化-(合)共轭二次抗体使用diaminobenzidine (DAB)作为底物,然后用苏木精复染色试剂。在400 x放大,得分为半胱天冬酶9-positive细胞是由计算的平均数量在30个随机领域积极的管状细胞从随机选择为每个动物肾脏部分(老鼠,每组)。
TUNEL检测进行评估使用原位细胞凋亡在肾组织中细胞死亡从罗氏应用科学检测设备。肾组织和4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。组织部分4μ米被暴露于TUNEL反应混合物末端转移酶核苷酸,包括tetramethylrhodamine-labeled dUTP (TMR-labeled)。幻灯片被荧光显微镜检查。肾脏部分的管状细胞筛选阳性细胞核在400 x放大。凋亡的分数是通过计数阳性细胞核的平均数量在30个随机选择的照片为每个动物肾脏部分(老鼠,每组)。
2.9。线粒体隔离
线粒体分离利用热费希尔的线粒体隔离设备(美国)根据制造商的指示。短暂,肾脏匀浆加入线粒体隔离剂。通过几次的差速离心,我们收集了线粒体下分析。细胞质蛋白质分离利用热费希尔•瑞帕裂解以及提取缓冲(美国)。蛋白质变性和免疫印迹分析。
2.10。免疫印迹
与BCA蛋白质测定蛋白质浓度测定;30μ克总蛋白在5%到15% sds - page凝胶电泳,然后转移到硝化纤维素膜(美国微孔)。膜被封锁在TBS 5%脱脂牛奶含有0.1%渐变20在室温下1 h,然后每个膜孵化兔抗体鼠DRP1(稀释1:1000;春秋国旅)或一只兔子抗体压敏电阻器阴离子通道(VDAC)(稀释1:1000;春秋国旅)一夜之间在4°C。VDAC抗体作为加载控制。在TBST洗后,每个膜与二次孵化了一到两个小时过氧化物酶抗体结合的37°C,检测到ECL试剂(美国微孔)。分析了每个乐队的密度Image-Pro + 6.0软件。DRP1微数据的规范化VDAC和相对DRP1水平得到每组。
2.11。定量实时聚合酶链反应
总RNA隔绝hWJMSC-EVs和肾脏样品试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)提取方法。RNA浓度和RNA完整性DU800 UV / Vis分光光度计测定(美国贝克曼库尔特,CA)。总RNA加工使用三个互补脱氧核糖核酸通过逆转录Thermocycler (Biometra,德国)。执行中存在与SYBR green-based PCR大师混合工具包(豆类、志贺、日本)Mx3000p™(美国STRATAGENE)。miR-30家庭成员的水平分析中存在的U6规范化。MiR-30水平指每个实验组的褶皱变化。
向前miR-30b引物的序列是:5′-TGTAAACATCCTACACTCAG-3′;反向:5′-AACTGGTGTCGTGGAG-3′;RT: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCTGAGT-3′。向前miR-30c引物的序列是:5′-AAACATCCTACACTCTCAG-3′;反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTC-3′;RT: 5′-CTCAACTGAATTGCCGACTCCACGACACCAGTTGAGGCTGAGAG-3′。向前miR-30d引物的序列是:5′-TAAACATCCCCGACTG-3′;反向:5′-AACTGGTGTCGTGGAG-3′;RT: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3′。
2.12。统计分析
数据表示为手段±标准差(SD)从三个独立的实验。使用SPSS v19.0进行了统计分析。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。hWJMSC-EVs减轻线粒体分裂和IRI DRP1激活模型中
我们之前证明hWJMSC-EVs对肾脏保护作用IRI (21,22]。研究线粒体形态变化在这种情况下,MitoTracker红色用于标签线粒体与红色荧光后大鼠肾小管上皮细胞受到叠氮化诱导2 h ATP耗竭和2 h再灌注IRI体外模型。20μ克电动车被加入到培养基EVs治疗组再灌注。然后,细胞共焦激光扫描显微镜成像。如图1(一),正常细胞的线粒体丝状或外观和线型通常是相互联系,形成一个网络。叠氮化处理后,线粒体网络破裂,线粒体被分散成许多不同大小的圆的碎片。然而,EVs治疗保留线粒体网络形态。量化的线粒体碎片如图1 (b)。EVs治疗减轻了线粒体碎片造成的IRI。
(一)
(b)
(c)
(d)
DRP1是最重要的一个决定因素在线粒体形态、免疫印迹分析DRP1在大鼠肾脏线粒体分数和全细胞溶菌作用。我们证明DRP1激活和IRI和EVs治疗24小时后转移到线粒体被激活(数字1 (c)和1 (d))。我们观察到的低表达线粒体DRP1 EVs治疗组。这些数据表明,IRI激活DRP1并触发线粒体碎片。然而,他们都是预防EVs治疗,这可能是一个机制,为肾IRI提供治疗效果。
3.2。HWJMSC-EVs交付和恢复miR-30在受伤的老鼠肾脏的表达
我们接下来探索miR-30 IRI体内期间大鼠肾脏的表达。定量逆转录酶聚合酶链反应(存在)表明,IRI造成miR-30b的低表达,miR-30c, miR-30d (miR-30a和miR-30e并不存在于大鼠肾脏)和电动汽车的治疗完全逆转减少(图2(一个))。为了进一步探索miR-30降级的机制,我们使用特定miR-30 antagomir治疗msc。msc与具体的浓度antagomir cocultured 50 nM 24 h。之后,我们改变了文化的另一个解决方案隔离EVs前24小时。数据显示,miR-30b / c / d,分别在缺席EVs来自msc(图2 (b))。同时,antagomir-treated EVs组显示低miR-30表达式以及汽车集团(图2 (c))。没有miR-30 EVs取消miR-30恢复正常EVs治疗组效果。此外,成熟的人类miR-30b序列/ c / d和老鼠的一样。同样的现象也可以观察到肾小管上皮细胞在体外(补充1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2093940)。此外,在3小时后注射到受伤的老鼠,发现了一些电动汽车内小管(补充2)。总之,hWJMSC-EVs外生microrna的可能会受伤的肾小管上皮细胞,这可能是电动汽车的一个重要途径的影响。
(一)
(b)
(c)
3.3。通过DRP1 EVs-Derived miR-30成员调节线粒体分裂
了解hWJMSC-EVs对线粒体裂变产生的影响,我们测试是否EVs-derived miR-30家庭起着至关重要的作用在调节线粒体通过DRP1裂变。在大鼠肾脏,执行DRP1表达和激活antagomir-treated电动汽车集团,尤其是miR-30b / c / d cotreated EVs组(图3(一个))。线粒体DRP1显示高表达,分别在汽车集团和antagomir-treated EVs组。
(一)
(b)
(c)
正如我们所料,线粒体碎片也增加antagomir-treated EVs组体外(图3 (b))。肾小管细胞的线粒体丝状或出现在正常的线型和EVs治疗组。然而,antagomir-treated组显示更圆的碎片线粒体的汽车集团。量化的线粒体碎片如图3 (c)。这些数据表明miR-30b / c / d的作用EVs IRI。
3.4。线粒体凋亡通路抑制了EVs-Derived miR-30
线粒体分裂一直在观察阿基模型,这有助于产生的细胞凋亡过程。然后,我们评估线粒体凋亡通路在我们阿基模型。如数据所示4(一)和4 (b)免疫组织化学显示半胱天冬酶9表达增强汽车集团在电动车还减少了治疗组。然而,microrna antagomir废除了效果。
(一)
(b)
(c)
(d)
TUNEL分析下执行进一步证实肾小管细胞凋亡(数字4 (c)和4 (d))。TUNEL-positive细胞数量显著增加在24 h后IRI骗局组相比,虽然EVs治疗组表现出TUNEL-positive细胞比汽车少组和microrna antagomir减轻这种影响。综上所述,看来EVs-derived miR-30可以阻止线粒体凋亡通路。
3.5。保护作用肾功能的电动汽车
我们评估的影响hWJMSC-EVs在IRI模型(肾功能的恢复数据5(一个)和5 (b))。与sham-operated动物相比,老鼠接受肾脏IRI显示显著升高血清肌酐和血尿素氮(BUN)测定。EVs治疗废除了伤害和microrna antagomir没有阻止这种效应在miR-30b / c / d单一抑制组。这可能是由于残余肾单位可以暂时维持肾功能。
(一)
(b)
4所示。讨论
这里我们已经确定了miR-30-related凋亡途径涉及DRP1和线粒体,这可能是一个hWJMSC-EVs减轻肾缺血再灌注损伤的机制。我们的数据表明,hWJMSC-EVs能够增强miR-30b / c / d的肾小管细胞的激活和减轻DRP1和线粒体碎片导致凋亡的影响。
人们普遍认为msc政府的治疗效果是由于内分泌或旁分泌机制(17,23]。细胞外囊泡来自msc是信息交流的重要工具19,24- - - - - -27]。EVs携带蛋白质,细胞因子,趋化因子,生长因子,和RNA含量的靶细胞,调节增殖,血管生成和细胞凋亡26,28]。我们组还发现hWJMSCs-EVs可以减轻急性和慢性肾损伤通过抗炎和抗氧化途径(15,21,22]。小分子核糖核酸,其中一个关键基因的信息来自电动汽车,越来越强调这些天29日,30.]。Lindoso等人表明,电动汽车不仅直接转移microrna PTECs受伤但也有转录调制函数(31日]。目前的研究表明,hWJMSCs-EVs可以携带microrna鼠肾脏,参与肾脏损伤修复。
miR-30家族参与了几个细胞过程,包括心肌细胞暴露于氧化应激或缺血损伤和细胞凋亡的II型肺泡上皮细胞(20.,32,33]。在目前的研究中,我们使用单边IRI的老鼠模型来确定microrna治疗EVs发挥核心作用。我们的数据表明,miR-30b / c / d减少肾小管细胞在IRI和hWJMSCs-EVs可能增加miR-30b / c / d的表达在受伤的管状细胞在体外和体内。EVs受伤的肾小管细胞的转移效应不仅支持了体外细胞培养和体内动物实验25,34),还有我们之前发现(21]。然后,我们对待hWJMSCs miR-30 antagomir。它成功地消除了相应microrna hWJMSCs-EVs和肾功能恢复的效果,进一步证实了microrna的转移及其治疗效果。
线粒体分裂IRI中观察到,与肾损伤的发生和发展密切相关。探索IRI电动汽车的潜在机制,我们发现线粒体分裂相关蛋白DRP1。我们的研究结果表明,DRP1迅速被激活后急性肾细胞损伤和转移到线粒体导致线粒体分裂,这是按照公布的数据(35]。EVs治疗抑制DRP1的激活和线粒体分裂。线粒体分裂的初始因素引发细胞凋亡通路。此外,EVs治疗显示antiapoptosis效应和保护受伤的肾脏。正如我们所料,miR-30 antagomir减轻这种效果,特别是在miR-30b / c / d antagomir cotreated组。我们观察到几乎相同程度的伤害作为车辆群体,包括激活DRP1,线粒体分裂,TUNEL染色,半胱天冬酶9染色和肾功能。因此,microrna的可能有多个目标和不同的microrna可能有相同的目标。更重要的是,有时治疗专注于一个目标microrna可能有限的功能。我们认为电动汽车的功能可能是依赖microrna的协同效应。
5。结论
我们的研究揭示了之间的联系电动车、miR-30 DRP1凋亡程序的肾脏。未来的研究需要阐明这个途径是如何集成到复杂的凋亡级联,阐明其与线粒体的关系裂变。我们的研究结果表明,调制的miR-30 EVs可能代表一个治疗方法治疗apoptosis-related肾缺血再灌注损伤。
缩写
| IRI: | 缺血再灌注损伤 |
| 电动汽车: | 细胞外囊泡 |
| hWJMSCs: | 人类沃顿果冻间充质基质细胞 |
| 阿基: | 急性肾损伤 |
| DRP1: | Dynamin-related蛋白质1。 |
信息披露
迪古和象屿邹co-first作者。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Di顾和象屿邹参与执行细胞培养动物实验,收集数据和概念和设计,数据分析和解释,并编写和修订手稿。(居进行动物实验,帮助和概念设计,手稿修改。广元张先生与手稿修改。盈江朱镕基和Erdun保参与获得金融支持,在概念和设计,在手稿修改。所有作者阅读和批准最终的手稿。迪古和象屿邹同样对本文亦有贡献。盈江朱镕基和本文Erdun包同样的贡献。
确认
本研究基金的赠款支持上海通用人民医院(12 rc04)和中国国家自然科学基金(81470919)。
补充材料
S1 MiR-30b / c / d水平在肾小管上皮细胞在不同的实验条件,包括正常、车辆、电动汽车和MiR-30b / c / d antagomir EVs治疗组。没有miR-30 EVs取消miR-30恢复正常EVs体外治疗组效果。S2我们执行一个电动汽车跟踪器实验显示更多的证据表明,电动汽车可以将其内容传输到肾小管上皮细胞。在本文描述的IRI模型。EVs注入之前,我们使用PKH26红色荧光细胞EVs链接器(σ)标签。在第一次超速离心法在短暂,我们使用1嗯resuspend降水和标签解决方案在室温下孵化20分钟。然后EVs提交第二超速离心法在相同的条件。下一步是我们之前提到的一样。我们收集了肾脏冰冻切片为12和24小时。EVs管状上皮细胞中检测到3个小时,这可能会进一步证明EVs肾脏修复的转移。