通过标记CD44、CD19和CD45鉴定心房粘液瘤中的干细胞样细胞

摘要

心房粘液瘤是最常见的肿瘤，主要发生在房间隔，其病因尚不清楚。据报道，良性肿瘤中存在一个类干细胞亚群，负责肿瘤的启动和维持。在本研究中，我们研究了干细胞样细胞是否与心房心脏粘液瘤有关。免疫组织学数据证实，带有表面标记CD19、CD45和CD44的细胞群位于黏液瘤的富含粘多糖的基质中。此外，我们采用相明亮培养法分离了黏液瘤细胞，证实黏液瘤源性细胞表达了强效的CD19、CD45和CD44。此外，该细胞群的多能性也通过心肌细胞和平滑肌细胞的体外分化得到验证。我们的结果表明，原发性心脏黏液瘤可能是由间充质干细胞引起的，这些间充质干细胞具有产生多系分化肿瘤的能力。综上所述，本研究首次证实心房黏液瘤中存在干细胞样细胞，这一细胞群可能具有黏液瘤发生和进展的能力。

1.介绍

心脏粘液瘤是最常见的心脏肿瘤[1]。它的特征是富含粘多糖的细胞外基质的黏液样外观，并与不同的组织病理学病例有质的区别。既往研究表明，黏液瘤细胞来源于卵圆窝和心内膜周围的心内膜下血管形成储备细胞或多能原始间充质细胞的残余物，可分化为内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、腺细胞、神经源性细胞和平滑肌细胞等多种细胞系[1- - - - - -3.]。组织病理学分析资料显示，黏液瘤主要由星状、纺锤状或长形细胞组成，合并入黏液样基质[2表型特征研究表明粘液瘤的起源是多能细胞[1]。

心脏黏液瘤的组织发生尚不清楚，通过免疫组织学可以观察到黏液瘤中不同的细胞表型，包括上皮细胞、内皮细胞、肌原性细胞、肌成纤维细胞和神经细胞[4]。近年研究表明，癌症干细胞是一种能够自我更新并分化为多种细胞类型的癌细胞，对肿瘤的发生、复发和转移起着重要作用[5,6]。虽然心脏黏液瘤的恶性潜力仍不确定，但对黏液瘤组织发生的一种可能解释是一群具有多能性的细胞是其起源。

认为黏液瘤细胞来源于原始的多能间充质细胞[7]。到目前为止，已有许多推测的癌症干细胞标记物被报道，其中CD44是最常见的癌症干细胞表面标记物[5]。心肌中的成体心脏干细胞已经通过多种方法被鉴定，包括生理特性，如形成多细胞球状体的能力[8]。蛋白和基因表达模式表明黏液瘤细胞可能在表型上与更原始的心脏祖细胞或原始心脏干细胞相似[1]。在本研究中，我们采用成球法分离粘液瘤细胞。并对肿瘤干细胞标志物CD44的表达和黏液源性细胞的分化进行了研究。

2.材料和方法

2.1。组织收集

心房黏液瘤来源于天津泰达国际心血管医院心胸外科的手术标本。3例患者均为女性，年龄分别为52岁、55岁和56岁。所有的参与者都给出了书面的知情同意书。

2.2。组织学分析

采用4%多聚甲醛固定，横切，石蜡包埋，苏木精和伊红染色(H&E)，观察粘液瘤的组织学变化。将心房黏液瘤植入OCT复合物(Miles Scientific)，于5时切成横切面，进行免疫组织学检查μ米厚度。用抗CD19、抗CD45、抗CD44抗体(均来自加州山城BD Pharmingen)检测黏液瘤是否CD19、CD45、CD44阳性。适当应用Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594标记的二抗(Invitrogen, Carlsbad, CA)。核反染采用DAPI。

2.3。细胞培养

为了研究是否可以培养粘液瘤细胞，将组织切成1至2毫米的薄片，用Hanks ' balanced salt solution (HBSS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)洗涤，在37℃下用0.1%的胶原酶II孵化期30分钟，频繁摇动[8]。然后细胞被过滤到100μ米网。获得的细胞在Iscove改良的杜尔贝科培养基(IMDM)中培养，培养基中添加10%胎牛血清(FBS) (Hyclone, Logan, UT)， 0.1 mM非必需氨基酸，100 U/mL青霉素G, 100μg/mL链霉素，2 mmol/L谷氨酰胺，0.1 mmol/Lβ巯基乙醇(8]。2 ~ 3周后，黏附成纤维细胞样细胞上出现了一群相明亮的细胞。经两次PBS洗涤和一次细胞溶解缓冲液(Gibco, Grand Island, NY)在室温下显微镜监视下收集这些相明亮的细胞，并用相同的培养基进行继代培养[8]。对于心脏和平滑肌分化，黏液瘤源性细胞在上述条件下培养[8,9]。

2.4。流式细胞术分析

流式细胞术对黏液瘤源性细胞和传代细胞进行分析。本研究使用的抗体为藻红素(PE)偶联抗cd44和异源藻蓝素(APC)偶联抗cd45和抗cd19(均来自BD Pharmingen)。染色细胞用流式细胞仪(FACS LSR, Becton-Dickinson, MA)分析。经碘化丙染色(PI)的死亡细胞被排除在分析之外。同型抗体作为对照(BD Pharmingen)。后续数据分析使用FlowJo软件(Tree Star Inc.， Ashland, OR)。

3.结果与讨论

3.1。心房粘液瘤的病理

采用苏木精和伊红(H&E)染色及免疫荧光显微镜观察心房粘液瘤的组织学变化。H&E染色显示粘液瘤细胞分散在粘液瘤区域内的粘液样基质中(图)1(一)，补充图1在补充材料可在网上http://dx.doi.org/10.1155/2016/2059584)。以往的研究表明，黏液瘤起源于一种多电位的心内膜或心内膜下储备间充质细胞，该细胞可分化为纤维细胞、肌细胞或内皮细胞[10]。到目前为止，已经报道了许多间充质干细胞的假定标记，包括CD44 [11]。我们的免疫组织学数据证实了CD44在粘液瘤中的表达。CD44作为一种广泛应用的肿瘤干细胞标志物，其表达表明了心脏黏液瘤的恶性潜能[12]。有报道称黏液瘤主要由细胞成分组成，包括数量可变的血细胞[2和无定形黏液样基质结构[13]。此外，黏液样基质丰富淋巴瘤细胞更容易表达pan-B细胞标记物CD19和常见白细胞抗原CD45 [14]。我们进一步的组织学结果证实了CD45和CD19在粘液瘤中的强表达(图)1 (b)，补充图1)。

3.2。粘液瘤细胞的分离和培养

先前的研究结果表明，黏液瘤细胞表达一系列与原始心肌细胞表型相关的转录因子，并表明心脏黏液瘤的发生源于具有心肌增生谱系的多潜能间充质祖细胞[2]。我们已经描述了从小鼠心脏中分离出相明亮细胞的心脏干细胞，并采用类似的方法分离粘液瘤细胞[9]。酶解心房粘液瘤，培养2 ~ 3周后从粘液瘤标本中自然分离出相明亮的球形细胞(图)2(一个))。这些细胞表现出高核-细胞质比率(图)2(一个)流式细胞术分析进一步表征其细胞表型，结果显示该细胞群间充质干细胞标记物CD44、pan-B细胞标记物CD19和造血细胞标记物CD45表达较高。细胞增殖分析显示，在大约7天的时间内，细胞增殖呈线性增长(数据未显示)。三个样本的结果都相似。

3.3。粘液瘤源性细胞的体外分化

为了研究心脏黏液瘤干细胞的多能分化，我们研究了黏液瘤细胞向不同类型细胞的分化。与心脏干细胞相似，这些细胞可以分化为心肌细胞和平滑肌细胞，心肌肌钙蛋白T (cTnT)、连接蛋白43、心肌细胞增强因子2C (MEF-2C)和α-平滑肌肌动蛋白(αsma)(图3.)，与以往的研究相似[1]。

在本研究中，心肌黏液瘤细胞的特征是，黏液瘤细胞是一群带有表面标记CD19、CD45和CD44的细胞，这表明这些细胞来自具有间充质干细胞特性的造血细胞。此外，我们采用相明亮培养法分离了黏液瘤细胞，证实黏液瘤源性细胞表达了强效的CD44、CD19和CD45。此外，该群体细胞的多能性也通过心肌细胞和平滑肌细胞的体外分化得到验证。

癌症干细胞是一种具有正常干细胞相关特征的癌细胞，特别是具有在肿瘤中产生异质细胞群的能力[5]。已有文献报道良性肿瘤中存在肿瘤干细胞样细胞[15]。对心脏黏液瘤肿瘤发生的重要认识可能来自黏液瘤的发展和细胞分化的研究。我们对粘液瘤中干细胞样细胞的鉴定结果表明，干细胞样细胞作为肿瘤起始细胞可能是这些良性肿瘤的一个普遍主题。

总之，我们的研究是第一个通过标记CD44、CD19和CD45分离并在表型和功能上表征心脏粘液瘤干细胞样细胞的研究。同时，我们也验证了它们的多能分化能力。本研究可能有助于阐明心脏黏液瘤的致癌机制，并为黏液瘤的研究提供新的见解。

相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

作者的贡献

宋祥河和刘丹妮对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金(81371620、81573089、81671734)和大学长江学者与创新研究团队计划(IRT13023)的部分资助。

补充材料

参考文献

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