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干细胞国际
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干细胞国际/2016年/文章
特殊的问题

骨微环境、干细胞和骨组织的再生

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2016年 |文章的ID 1934270 | https://doi.org/10.1155/2016/1934270

Fransisca a . s . van Esterik挂Zandieh-Doulabi, Cornelis j . Kleverlaan Jenneke Klein-Nulend, ”增强成骨和Vasculogenic分化潜力的人类脂肪干细胞在纤维蛋白凝胶双相磷酸钙支架”,干细胞国际, 卷。2016年, 文章的ID1934270, 12 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/1934270

增强成骨和Vasculogenic分化潜力的人类脂肪干细胞在纤维蛋白凝胶双相磷酸钙支架

Fransisca a . s . van Esterik,1,2 挂Zandieh-Doulabi,1 Cornelis j . Kleverlaan,2 和 Jenneke Klein-Nulend1

1口腔细胞生物学系、学术中心牙科阿姆斯特丹(ACTA), sccp阿姆斯特丹,阿姆斯特丹大学移动研究所阿姆斯特丹,荷兰阿姆斯特丹

2牙科材料科学、学术中心牙科阿姆斯特丹(ACTA), sccp阿姆斯特丹,阿姆斯特丹大学移动研究所阿姆斯特丹,荷兰阿姆斯特丹

学术编辑器:苏珊廖
收到了 2016年3月01
修改后的 06年6月2016年
接受 2016年6月27日
发表 2016年7月28日

文摘

骨组织工程合成双相磷酸钙(BCP),羟磷灰石/β磷酸三钙(HA /βtcp)的比例60/40 (BCP60/40)临床应用的成功,但高百分比的HA支架改造可能会妨碍有效。是否BCP公顷/较低βtcp比(BCP20/80)更可取的尚不清楚。血管的发展需要在骨生成之前发生。我们旨在测试成骨的和/或vasculogenic分化潜力以及降解的复合材料组成的人类脂肪干细胞(对asc)播种BCP60/40或BCP20/80纳入纤维蛋白凝胶触发新血管化骨再生。ASC附件BCP60/40和BCP20/80 30分钟内相似(> 93%)。经过11天的文化BCP20/80-based复合材料显示,碱性磷酸酶活性和增加DMP1基因表达,但不是RUNX2和骨粘连蛋白表达,而BCP60/40-based复合材料。BCP20/80-based复合材料还显示增强的表达vasculogenic标记CD31和VEGF189,但不VEGF165和endothelin-1。Collagen-1和collagen-3表达类似的复合材料。纤维蛋白降解增加在第七天BCP20/80-based复合材料。总之,BCP20/80-based复合材料显示增强成骨和vasculogenic分化潜力而BCP60/40-based复合材料在体外,这表明BCP20/80-based复合材料可能会更有前途在活的有机体内骨头比BCP60/40-based增强复合材料。

1。介绍

骨组织工程已经成为一个有前途的替代骨重建。它是基于组合支架,(干)细胞,和机械和/或化学刺激1]。自体骨临床骨的黄金标准,例如,上颌窦底高程(MSFE) [2]。另一个黄金标准是两相的磷酸钙(BCP)。bcp骨替代材料用于牙科和骨科应用程序。埃林et al。(1986)是第一个用BCP这个术语来描述生物陶瓷羟基磷灰石(HA)和组成β磷酸三钙(βtcp) [3]。BCP的化学成分相似的无机部分天然骨基质(4]。LeGeros和Daculsi公布1986年第一个基本BCP的制备及其研究在体外属性(5,6]。之后,有一个显著增加生产和使用商业BCP的骨替代品。HA是刚性的,脆弱的,几乎没有应用程序后再吸收,例如MSFE,βtcp降解速度和有不同的吸收模式(7]。为高效的支架改造,HA和BCP的最佳比例βtcp是理想的。BCP公顷/βtcp的比例60/40 (BCP60/40)是成功应用临床4,8,9),但高百分比的HA支架改造可能会妨碍有效。是否BCP公顷/βtcp的比例20/80 (BCP20/80)相比是更可取的BCP60/40尚不清楚。

BCP支持附件、增殖和成骨分化的祖细胞,并可结合regeneration-competent干细胞,如脂肪干细胞(对asc),引入成骨的生物活性(10,11]。临床相关的干细胞增殖能力高的数字可以很容易地从人类脂肪组织中提取(12,13]。对asc multilineage潜力包括成骨的血统(14可能,内皮血统(15]。对asc在骨组织工程领域已经成功地用于骨增强MSFE [16]。

足够的血管化是关键regeneration-competent干细胞移植细胞存活的细胞骨结构。骨生成和血管生成是紧密耦合的过程,和血管发展需要诱导骨生成之前发生。这种复杂性是一个重大挑战工程可行的和功能性骨移植17,18]。Bioscaffolds,像自然来自人体的细胞外基质支架,加强血管发展(19]。另一个bioscaffold纤维蛋白,不溶性、弹性蛋白在其中扮演着重要的角色在凝血和伤口愈合。细胞骨结构可能结合bioscaffolds诱导血管的发展。

BCP bioscaffolds相结合,如纤维蛋白,填补骨缺损的能力和促进骨愈合在动物和临床研究20.- - - - - -23]。纤维蛋白凝胶提供了细胞功能的生物适合的载体,生存、增殖和分化24]。增强骨形成已被证明在注射间充质干细胞(MSC)播种βtcp在纤维蛋白胶掺合料在老鼠背部皮下空间(24]。msc在细胞纤维蛋白凝胶用作输送系统在活的有机体内迁移的凝胶和入侵陶瓷支架25]。

BCP的比较研究不同的HA / TCP比率在下颌骨缺损minipigs表明BCP20/80导致骨形成类似自体骨52周后(26]。BCP公顷/支架βtcp的比例60/40,总孔隙度70%,50%是大孔隙(直径300 - 600μ米)和微孔隙(直径< 10 30%μ米)结合纤维蛋白胶刺激骨形成在动物和人类20.- - - - - -23]。300 - 400年的孔隙大小μm提高骨形成,促进新血管形成骨可以发生在老鼠(之前是至关重要的27]。因此,在这项研究中BCP生物材料使用90%的孔隙度,孔隙大小的500 - 1000μm。人类msc播种BCP60/40或BCP20/80合并皮下注射的免疫缺陷小鼠显示最高数量的骨充填在孔隙空间和均匀分布在整个多孔结构的植入BCP20/80-loaded复合材料(28]。

因为成骨和vasculogenic分化的潜力对asc regeneration-competent播种BCP60/40或BCP20/80纳入纤维蛋白凝胶是至关重要的细胞骨骨形成的构造,我们旨在测试成骨的和/或vasculogenic分化潜力以及降解复合材料组成的人类对asc播种BCP60/40或BCP20/80纳入为骨再生纤维蛋白凝胶。我们假设BCP60/40——BCP20/80-based复合材料将增强成骨的对asc和vasculogenic分化潜力。我们预计对asc BCP20/80-based复合材料将导致成骨分化而早些时候对asc以来BCP60/40-based复合材料降解速率BCP20/80-based复合材料有望走高。被播种在BCP60/40或BCP20/80也与类似的孔隙尺寸和孔隙度,然后纳入纤维蛋白凝胶或直接纳入纤维蛋白凝胶,并培养了11天。细胞对两bcp评估细胞播种后30分钟,细胞增殖,分化成骨和vasculogenic潜力,和纤维蛋白退化评估了11天的文化。

2。材料和方法

2.1。双相磷酸钙支架

使用了两种不同的磷酸钙支架:(1)Straumann®BoneCeramic 60/40(瑞士巴塞尔Straumann AG)研究所),一种多孔的BCP HA支架组成的60%和40%βtcp (BCP60/40), (2) Straumann BoneCeramic 20/80(瑞士巴塞尔Straumann AG)研究所),一种多孔的BCP HA支架组成的20%和80%βtcp (BCP20/80)。为了避免成骨的差异及对asc vasculogenic分化潜力的种子BCP60/40或BCP20/80纳入BCP制造引起的纤维蛋白凝胶过程,这两种不同的BCP是同一家公司生产的,和有类似的孔隙尺寸和孔隙度(表1)。
脚手架 作文 颗粒大小(µ米) 水晶大小(µ米) 孔隙度(%) 连通孔隙(µ米) SSA (10−3米2/ g) 微孔率(%)
Straumann 60% HA 500 - 1000 0.6 - -6.0 90年 100 - 500 6.9 2。0
BoneCeramic 40%βtcp
BCP60/40
Straumann 20% HA 500 - 1000 1.0 - -6.0 90年 100 - 500 9.5 2。0
BoneCeramic 80%βtcp
BCP20/80
表1
使用不同的bcp的特性。成分、粒度、孔隙度和孔隙宽度Straumann BoneCeramic 60/40和Straumann BoneCeramic 20/80。HA:羟磷灰石;βtcp:β磷酸三钙;BCP:双相磷酸钙;SSA:比表面积。放大50 x 5000 x。
2.2。捐助者

从残留的腹壁皮下脂肪组织切除术的五个健康女性捐赠者(33岁,40岁,47岁,50岁和54),接受选择性腹壁校正【Tergooi医院和诊所的Bilthoven荷兰。VU医学中心的伦理审查委员会,阿姆斯特丹,荷兰,批准了这一协议。从所有患者知情同意了。

2.3。人类对asc的隔离和文化

对asc是孤立于切除材料与所述小修改(12]。总之,脂肪组织是切成小块,保持酶的消化与0.1%胶原酶(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)45分钟在磷酸盐37°C (PBS)含1%牛血清白蛋白(罗氏诊断GmbH)连续搅拌。聚蔗糖®(Lymphoprep density-centrifugation一步™;Axis-Shield,奥斯陆,挪威;1000 g×20分钟,ρ聚蔗糖= 1.077克/毫升、渗透性 mOsm)进行清除剩余的红细胞从基质血管分数。离心后,产生的间质血管部分颗粒包含对asc在杜尔贝科resuspended修改鹰的介质(生命技术™欧洲BV、Bleiswijk、荷兰),计算,存储在液态氮冷冻,直到进一步的使用。异质性研究包括细胞特性和多功能分化潜力的这些细胞已报告之前,我们组(12]。

低温贮藏间质血管fraction-containing细胞悬浮液的上述捐助者汇集和培养α最小基本介质(αmem;Gibco,生活技术,沃尔瑟姆,妈,美国)血小板溶解产物为5%(见下图),100 U /毫升青霉素(Sigma-Aldrich,汉堡,德国),100年μg / mL硫酸链霉素(Sigma-Aldrich)和10个国际单位/毫升肝素(利奥制药/ S, Ballerup,丹麦),以防止凝固在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。媒介是刷新三次一个星期。达到confluency后,细胞被孵化收获0.25%胰蛋白酶(Gibco表达载体,沃尔瑟姆,妈,美国)和0.1%乙二胺四乙酸(默克公司,达姆施塔特,德国)在PBS 37°C,山肩,培养直到通道2 (P2),并保存在液氮直到进一步使用。低温贮藏池ASCs-containing细胞悬浮液被解冻,播种0.5×105每辆t - 225细胞培养瓶(他一一Bio-One、Kremsmuenster、奥地利)αmem血小板溶解产物为2%,抗生素,和10个国际单位/毫升肝素。细胞培养,直到P3-P4,用于制备复合材料(见下文)。

2.4。血小板溶解产物

汇集血小板产品从五个捐助者得到Bloodbank Sanquin (Sanquin,阿姆斯特丹,荷兰)。血小板溶解产物是通过溶解血小板通过温度骤变−80°C冻结,解冻,在600×g离心10分钟来消除剩余血小板碎片。上层清液添加在2% (v / v)的媒介。

2.5。纤维蛋白凝胶

人纤维蛋白原plasminogen-depleted蛋白质(酶研究实验室,南本德,在美国是199年溶解在介质(M199;Gibco,生活技术)用抗生素在37°C 1 h。可溶性纤维蛋白原是透过0.2μm过滤器(微孔,阿姆斯特丹,荷兰)和浓度测量与协同HT®分光光度计(Winooski BioTek仪器公司,VT,美国)。准备纤维蛋白凝胶2毫克/毫升纤维蛋白原方案与1.0国际单位/毫升牛聚合α凝血酶(酶研究实验室、南本德、IA,美国)在一个缓冲区包含50 mM柠檬酸钠、氯化钠0.2米,和0.1%聚乙二醇- 8000,在室温下1 h 1 h在37°C,并用于纤维蛋白涂层的聚苯乙烯48-well文化板块(Frickenhausen,蜂星,他一一Bio-One国际GmbH德国),以及制备BCP60/40 BCP20/80-based复合材料,并对asc凝胶(见下文)。

2.6。复合材料的制备和文化

培养对asc和PBS洗了三次取消血小板溶解产物,和播种BCP60/40或BCP20/80然后纳入纤维蛋白凝胶准备BCP60/40 BCP20/80-based复合材料,或直接纳入纤维蛋白凝胶。25到30毫克BCP60/40或者BCP20/80水分在PBS 30分钟。PBS去除后,1×105对asc 100年μlαmem被允许在室温下高度为30分钟。独立的细胞数使用计数室(Optik劳动、切口、英国)。梗塞部位BCP支架被嵌入纤维蛋白凝胶,放在fibrin-coated盘子。后立即准备,一些复合材料被用于光学显微镜显示BCP颗粒在纤维蛋白凝胶(图1(一)),并对asc可视化这些粒子在凝胶cytotracker绿色(英杰公司)根据制造商的说明(图1 (b))。作为一个控制,1×105对asc是嵌入在纤维蛋白和放在fibrin-coated盘子。

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(一)
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(b)
图1
BCP-based组成的复合对asc播种BCP支架结合在纤维蛋白凝胶后立即准备。(a) BCP60/40颗粒在纤维蛋白凝胶可视化光缩微复制。黄色箭头,BCP;白色箭头,纤维蛋白凝胶。(b)对asc可视化荧光(绿色)在同一BCP60/40颗粒在纤维蛋白凝胶。白色箭头:对asc。放大40 x。

BCP60/40 BCP20/80-based复合材料,并对asc在凝胶中培养αmem无酚红(Gibco,生活技术,沃尔瑟姆,妈,美国)与血小板溶解产物2%,抗生素,50μg / mL 2-phospho-L-ascorbic酸三钠(Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)和10个国际单位/毫升肝素为11天37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。媒介是刷新后7天。

2.7。人类ASC在复合材料和纤维蛋白凝胶扩散

扩散是通过确定评估细胞数量在BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶天1和11通过alamarBlue®荧光分析(表达载体,弗雷德里克,医学博士,美国),根据制造商的指示。我们发现一个线性alamarBlue荧光和细胞数量之间的关系(数据没有显示)。荧光读取介质样品在530 nm协同HT分光光度计。

2.8。碱性磷酸酶活性

碱性磷酸酶(ALP)活性测定的成骨细胞的表型对asc BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶后1和11天的文化。复合材料和纤维蛋白凝胶都转移到24-well文化板块(本),在300年用PBS、碎μL Milli-Q水,储存在−20°C之前进一步使用。高山活动测量细胞溶解产物使用4-nitrophenyl磷酸二钠盐(默克公司,达姆施塔特,德国)作为底物在pH值为10.3,根据洛瑞(描述的方法29日]。吸光度是阅读与协同HT分光光度计在405海里。高山活动被表示为μM / ng DNA。

2.9。基因表达分析

天1 7和11个文化、BCP60/40——BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶转移至24-well文化板块,用PBS洗净,在750年粉碎μL试剂盒®试剂(美国生活技术,沃尔瑟姆,MA),并存储在−20°C到进一步使用。总RNA分离使用RNeasy®迷你旋转列(美国试剂盒科学,马里兰州)根据制造商的指示,并存储在−20°C到进一步使用。互补DNA(互补)合成了使用上标®很™互补脱氧核糖核酸合成工具包(表达载体,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国),10.5μ在15 L总RNAμ包含3 L反应混合μ混合和1.5 L很反应μL上标酶混合在一个thermocycler GeneAmp®PCR系统9700 PE(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。互补脱氧核糖核酸是储存在−20°C定量实时PCR (qPCR)分析之前,和稀释5 x基因表达分析。使用2 qPCR反应进行μ每个反应(10 L的互补μL反应总额包含10 pmol每个引物)和LightCycler®480 SYBR®绿色我Mastermix(罗氏诊断,曼海姆,德国)在480年LightCycler(罗氏诊断)。qPCR所有基因条件如下:10分钟在95°C预孵化,紧随其后的是35周期放大2 s在95°C, 56°C 8 s, 10 s, 72°C和5 s的82°C,然后融化曲线分析。与光周期计®软件(版本1.2),过境点进行评估和策划与已知浓度的连续稀释的标准(人类初级骨:2.5 -0.004 ng /μL)。一个人小梁骨样本(手术浪费)从股骨头,立即(1 h)为cox-arthrosis臀部手术之后,和作为积极的控制。协议的伦理审查委员会批准的VU大学医学中心。PCR效率( )是通过使用公式 。数据只有在使用 -2.0 = 1.85。对于基因表达分析,目标基因表达被归一化的值YWHAZ管家基因表达来获取相对基因表达。qPCR被用来评估以下基因的表达:KI67runt-related转录因子2 (RUNX2)、骨粘连蛋白(在)、酸性phosphoprotein-1牙质矩阵(DMP1),collagen-1 (COL1),collagen-3 (COL3differentiation-31集群),(CD31)、血管内皮生长因子- 165 (VEGF165)、血管内皮生长因子- 189 (VEGF189)和endothlin-1 (EDN1)。引物序列用于qPCR表中列出2。
目标基因 寡核苷酸序列 产品尺寸(bp) 退火温度(°C)
YWHAZ 向前 3′5′gATgAAgCCATTgCTGAACTTg 229年 56
反向 3′5′CTATTTgTgggACAgCATggA
KI67 向前 3′5′CCCTCAgCAAgCCTgAgAA 202年 56
反向 3′5′AgAggCgTATTAggAggCAAg
RUNX2 向前 3′5′ATgCTTCATTCgCCTCAC 156年 56
反向 3′5′ACTgCTTgCAgCCTTAAAT
在 向前 3′5′CTgTCCAggTggAAgTAgg 233年 56
反向 3′5′gTggCAggAAgAgTCgAAg
DMP1 向前 3′5′TAggCTAgCTggTggCTTCT 375年 56
反向 3′5′AACTCggAgCCgTCTCCAT
COL1 向前 3′5′TCCggCTCCTgCTCCTCTTA 336年 56
反向 3′5′ggCCAgTgTCTCCCTTg
COL3 向前 3′5′gATCCgTTCTCTgCgATgAC 279年 56
反向 3′5′AgTTCTgAggACCAgTAggg
CD31 向前 3′5′AACAggAgggAgAgTATTACTg 236年 56
反向 3′5′TggTACTgCTggCCTggA
VEGF165 向前 3′5′ATCTTCAAgCCATCCTgTgTgC 224年 56
反向 3′5′CAAggCCCACAgggATTTTC
VEGF189 向前 3′5′ATCTTCAAgCCATCCTgTgTgC 289年 56
反向 3′5′CACAgggAACgCTCCAggAC
EDN1 向前 3′5′gTTTgTggCTTgCCAAggA 207年 56
反向 3′5′ACgTgCTCgggAgTgTTgA
表2
引物序列测定成骨的通过PCR和vasculogenic分化潜力。YWHAZ:酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白质、ζ;KI67:增殖标记;RUNX2:runt-related转录因子2;在:骨粘连蛋白;DMP1:酸性phosphoprotein-1牙质矩阵;COL1:collagen-1;COL3:collagen-3;CD31:differentiation-31集群;VEGF165:血管内皮生长因子- 165;VEGF189:血管内皮生长因子- 189;EDN1:endothlin-1;英国石油公司:碱基对。
2.10。纤维蛋白降解

纤维蛋白降解产物被量化使用酶联免疫吸附试验(描述30.]。简单地说,抗体纤维蛋白降解products-14 (FDP-14;TNO,生活质量,荷兰莱顿)识别不同抗原表位的纤维蛋白降解产物被用来捕获抗体。纤维蛋白降解产物浓度的介质BCP60/40——BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶进行调查后1、4、7和11天的文化,Biopool标准(三一生物技术、威克洛郡、爱尔兰)被用作参考。最后,单克隆抗体D-dimer-13 (DD-13;TNO)用辣根过氧化物酶标记被用来标记抗体。使用3着色反应进行,3′,5、5′-tetramethybenzidine (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和停止1 M H2所以4。光学密度与协同HT分光光度计在450海里。

2.11。统计分析

三个独立实验的数据来自四文化BCP60/40-based复合材料和纤维蛋白凝胶,BCP20/80-based复合材料和两个独立的实验。数据意味着±SEM。双尾未配对 以及用于比较细胞对BCP60/40和BCP20/80。alamarBlue荧光差异、高山活动和基因表达BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶进行了单向方差分析(方差分析)。比较纤维蛋白降解,单向重复测量方差分析。如果认为重要差异 。统计分析了使用IBM®SPSS®版本21统计软件包(SPSS Inc .)、芝加哥,美国)和GraphPad棱镜®5.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。

3所示。结果

3.1。细胞对BCP60/40和BCP20/80

细胞对BCP60/40 BCP20/80相似(BCP60/40: ,意味着细胞数量±SEM, 样品;BCP20/80: , 样本)。合并后梗塞部位BCP纤维蛋白凝胶的微观观察显示迁移的细胞对复合材料的纤维蛋白凝胶在第一天(数据没有显示)。迁移细胞的确切数字无法确定目前化验。未来的研究要揭示细胞的精确贡献BCP和迁移细胞的成骨和vasculogenic分化潜力复合材料。

3.2。增加细胞增殖和高山活动BCP60/40 BCP20/80-Based复合材料

细胞增殖在BCP60/40 BCP20/80-based复合材料相似,和1.4 -1.5倍高于纤维蛋白凝胶(图2(一个))。BCP20/80-based复合材料显示增加1.5倍高山活动BCP60/40-based相比,复合材料在11天(图2 (b))。高山活动相比,复合材料是高纤维蛋白凝胶在天1(4.6 -5.0倍),11(3.1 - -4.6倍;图2 (b))。

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图2
ASC在BCP60/40增殖和成骨分化——BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶的第一天和11文化。(a)总DNA含量在BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶。总DNA含量的增加从1天11个明显高于BCP60/40 BCP20/80-based复合材料相比,纤维蛋白凝胶,表明类似的扩散两种复合材料,但增加复合材料相比,纤维蛋白凝胶扩散。(b)高山活动BCP60/40 BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶。BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料显示出更高的高山活动在11天。高山活动BCP60/40——和BCP20/80-based复合材料相比,高纤维蛋白凝胶在天1和11所示。值意味着±SEM ( -12)。 显著影响BCP60/40——或者BCP20/80-based复合材料的纤维蛋白凝胶相比, 。 从BCP60/40-based复合材料明显不同, 。BCP,双相磷酸钙;高山,碱性磷酸酶。
3.3。增强成骨分化BCP20/80-Based复合材料的潜力

没有观察到基因表达差异的增殖标记KI67在这两种复合材料在所有时间点。KI67基因表达增加BCP60/40 -(3.0倍)以及BCP20/80-based复合材料(4.0倍),而纤维蛋白凝胶在天11(图3(一个))。早期成骨分化的基因表达标记RUNX2在复合材料相似以及纤维蛋白凝胶相比,在所有时间点(图3 (b))。表达式early-to-late成骨分化的标志在在这两种复合材料也在各个时间点上均相似(图3 (c))。BCP60/40-based复合材料导致下降在基因表达与纤维蛋白凝胶在1(0.2倍)和7天(0.1倍)。在表达BCP20/80-based复合材料相比也减少纤维蛋白凝胶在第七天(0.2倍;图3 (c))。基因表达的成骨分化标记DMP1在BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料提高天1(2.1倍),11(9.2倍)。DMP1表达BCP20/80-based相比也增加纤维蛋白凝胶在天1(6.8倍),11(10.4倍;图3 (d))。细胞外基质蛋白COL1和COL3表达在骨生成和血管生成。COL1基因表达是相似的两种复合材料以及纤维蛋白凝胶相比,在所有时间点(图3 (e))。BCP60/40 BCP20/80-based复合材料显示无显著差异COL3在所有时间点检测基因表达(图3 (f))。COL3基因表达在BCP60/40-based复合材料相比,减少纤维蛋白凝胶在第七天(0.2倍;图3 (f))。

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图3
增殖的基因表达标记KI67和成骨分化标记RUNX2,在,DMP1,COL1,COL3BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶在1天,7和11的文化。(一)BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料显示,增加KI67基因表达与纤维蛋白凝胶在11天。(b)RUNX2基因表达相似BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶时间点。(c) BCP60/40 BCP20/80-based复合材料显示出类似的在时间点的基因表达。(d) BCP20/80-based复合材料显示增加DMP1基因表达与BCP60/40-based复合材料相比,纤维蛋白凝胶在天1和11所示。(e, f)基因的表达COL1和COL3BCP60/40——BCP20/80-based复合材料在各个时间点上均相似。值意味着±SEM ( -12)。 显著影响BCP60/40——或者BCP20/80-based复合材料的纤维蛋白凝胶相比, 。 从BCP60/40-based复合材料明显不同, 。BCP,双相磷酸钙;KI67增殖标记;RUNX2runt-related转录因子2;在骨粘连蛋白;DMP1牙本质基质酸性phosphoprotein-1;COL1collagen-1;COL3,collagen-3。
3.4。增强Vasculogenic分化BCP20/80-Based复合材料的潜力

BCP20/80-based复合材料显示增加CD31基因表达BCP60/40-based相比,复合材料在11天(2.8倍),以及相对于纤维蛋白凝胶(6.2倍;图4(一))。CD31基因表达在两种复合材料降低(2.3 -2.8倍)相比,纤维蛋白凝胶在第一天(图4(一))。基因表达的VEGF165在这两种复合材料相似,以及纤维蛋白凝胶相比,在所有时间点(图4 (b))。BCP20/80-based复合材料显示增加VEGF189基因表达在1(3.6倍)和7天(2.6倍)BCP60/40-based复合材料相比,以及纤维蛋白凝胶相比在11天(5.5倍;图4 (c))。基因表达的EDN1在这两种复合材料显示在各个时间点上均无显著差异(图4 (d))。BCP60/40-based复合材料导致下降EDN1基因表达与纤维蛋白凝胶在第七天(0.2倍;图4 (d))。

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图4
vasculogenic分化的基因表达标记CD31,VEGF165和VEGF189,EDN1BCP60/40 - BCP20/80-based复合材料、纤维蛋白凝胶在1天,7和11的文化。(一)BCP20/80-based复合材料显示增加CD31基因表达BCP60/40-based相比,复合材料在11天,以及纤维蛋白凝胶。(b) BCP60/40——BCP20/80-based复合材料表现出相似的VEGF165时间点的基因表达。(c) BCP20/80-based复合材料显示增加VEGF189基因表达与BCP60/40-based复合材料1和7在天。(d) BCP60/40 BCP20/80-based复合材料显示出类似的EDN1时间点的基因表达。值意味着±SEM ( -12)。 显著影响BCP60/40——或者BCP20/80-based复合材料的纤维蛋白凝胶相比, 。 从BCP60/40-based复合材料明显不同, 。BCP,双相磷酸钙;CD31,differentiation-31集群;VEGF165血管内皮生长因子- 165;VEGF189血管内皮生长因子- 189;EDN1,endothelin-1。
3.5。纤维蛋白降解复合材料之间的差异

降低纤维蛋白降解产物浓度的介质BCP20/80-based复合材料相比,纤维蛋白凝胶1天(0.02倍;图5)。的降解产物浓度增加BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料(1.7倍)和纤维蛋白凝胶在7天(1.8倍),但在11天达到类似水平。


图5
纤维蛋白降解的差异BCP60/40 BCP20/80-based复合材料和纤维蛋白凝胶。BCP60/40——和BCP20/80-based复合材料退化是相似的在11天。BCP20/80-based复合材料纤维蛋白降解产物浓度的增加导致BCP60/40-based复合材料相比,在第七天的文化,以及纤维蛋白凝胶。值意味着±SEM ( -12)。 显著影响BCP60/40——或者BCP20/80-based复合材料的纤维蛋白凝胶相比, 。 从BCP60/40-based复合材料明显不同, 。BCP,双相磷酸钙;累积,累积;心房纤颤,纤维蛋白;度,退化。

4所示。讨论

本研究旨在测试成骨的和/或vasculogenic分化潜力以及降解复合材料组成的人类对asc播种BCP60/40或BCP20/80纳入为骨再生纤维蛋白凝胶。我们发现,(我)ASC依恋bcp相似;(2)扩散在BCP60/40 BCP20/80-based复合材料相似,但高于纤维蛋白凝胶;(3)BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料显示出更高的高山活动;(iv)的基因表达成骨的标记DMP1BCP60/40-based相比BCP20/80-based复合材料是提高复合材料以及纤维蛋白凝胶;(v)更高的vasculogenic标记基因表达CD31和VEGF189在BCP20/80-based复合材料相比,BCP60/40-based复合材料和纤维蛋白凝胶。因此,我们的结果显示增强成骨和vasculogenic分化潜力BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料在体外,这表明BCP20/80-based复合材料可能会更有前途在活的有机体内骨头比BCP60/40-based增强复合材料。

我们发现ASC附件bcp相似,如图所示(早些时候31日),表明不同的HA /βtcp BCP的比率并不影响ASC附件。确保细胞生存、增殖和分化移植梗塞部位的支架植入后,足够的营养和氧气供应是至关重要的。一个复合植入体内后容易缺氧。对asc培养纤维蛋白gel-coated板块节目增强扩散严重缺氧条件下(1%氧气)相比,传统的氧(20%氧气)条件(32]。因此,增强扩散两种复合材料可能被解释为刺激效应的BCP支架(33),和/或低氧微环境,这也有可能发生在活的有机体内植入。

退化的副产品可以影响干细胞的概念功能,包括细胞命运的决定,是新兴34]。TCP支持细胞的生成和促进成骨分化osteoprogenitor细胞(35]。解散BCP的程度取决于公顷/βtcp比率;比率越低,越解散(36]。我们发现高高山活动,表明增强成骨分化BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料。这可以解释为HA /低βtcp比例BCP20/80 BCP60/40相比,表明更高的Ca2 +离子释放在BCP20/80-based复合材料对骨形成是至关重要的。周围材料的降解,纤维蛋白凝胶,可以导致cell-traction部队,这是至关重要的成骨分化的人类msc在三维环境中,可能解释成骨分化的加速复合材料和纤维蛋白凝胶(37]。这个设想是符合我们纤维蛋白降解产物数据显示纤维蛋白降解增加BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料在第七天。我们发现后期的高表达成骨分化标记DMP1,但类似的早期表达和early-to-late成骨分化标记BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料,表明BCP20/80-based后期复合材料的成骨的承诺而BCP60/40-based复合材料以及纤维蛋白凝胶。因此,BCP20/80-based复合材料植入看起来有前途在活的有机体内为增强骨形成。

血管发展需要诱导骨生成之前。CD31表达在细胞表面内皮细胞和造血细胞。BCP20/80-based复合材料显示增加CD31表达BCP60/40-based复合材料相比,表明vessel-forming效力越高。在培养过程中,CD31表达减少,而VEGF165,VEGF189,EDN1表达增加复合材料随着时间的推移。这些vasculogenic基因的高表达表明增加vasculogenic分化潜力的两种复合材料,虽然CD31表达减少,这表明内皮祖细胞的数量减少。VEGF可能功能作为一个低氧诱导血管生成因子(38]。我们发现增加vasculogenic标记的表达VEGF189在BCP20/80-based复合材料相比,纤维蛋白凝胶。因此,BCP20/80-based复合材料可能提供对asc的缺氧微环境,导致增加VEGF表达。Endothelin-1最初是一个强有力的血管收缩剂,已被确认在血管内皮细胞。在成骨细胞,刺激无机磷酸盐运输,这是重要的骨基质钙化(39]。EDN1文化中表达增加两个BCP60/40 BCP20/80-based复合材料,这表明增强vasculogenic和成骨分化潜能。未来的研究需要验证可能的差异对asc血管和骨形成使用复合材料,与不同的HA / bcpβtcp比率和纤维蛋白凝胶在活的有机体内。

阀杆cell-matrix接口是一个复杂的、动态的微环境细胞材料合作规定彼此的命运和调控干细胞分化37]。纤维蛋白成分的变化将创建不同的刚度矩阵和建筑属性,这将会对细胞反应的影响。干细胞是极其敏感的周围弹性矩阵,通过mechanosensitive离子通道、局部粘连,细胞表面受体,肌动蛋白细胞骨架,在天堂,和粘连,他们反应强烈的矩阵(40]。理解细胞的机制对asc的感官功能将有关我们的复合材料在组织工程中的应用。纤维蛋白BCP20/80-based改造增加复合材料与BCP60/40-based复合材料相比,但年底达到类似水平的文化。纤维蛋白重塑的差异可能是导致细胞行为的差异。纤维蛋白降解产物的增加在文化表明纤维蛋白的溶解。植入后BCP60/40 BCP20/80-based复合材料在体内,解散三维生物基质纤维蛋白会发生。在骨折愈合,通过三维生物细胞迁移矩阵和可能直接或间接地指示通过细胞因子或生长因子释放41]。我们观察到从BCP对asc迁移到纤维蛋白凝胶,也可能发生复合材料植入后在活的有机体内。后,纤维组织将取代形成纤维蛋白,从而持有梗塞部位BCP到位。因此,我们对骨增强复合材料看起来有前途的候选人在活的有机体内。

BCP-based复合材料可能适合用一步手术。我们使用了一个扩展干细胞池组成的均匀混合的细胞。然而,只有一个新孤立基质血管部分适合用一步手术(42]。基质血管部分由一个细胞不均匀混合物包括内皮细胞和lineage-committed祖细胞特征,而不是当我们干细胞池特点是(14,43]。确定新孤立基质血管分数给BCP-fibrin复合材料相似的结果,有必要测试复合材料的成骨的和/或vasculogenic分化潜能与新鲜孤立基质血管分数播种与不同的HA / bcpβtcp比例纳入纤维蛋白凝胶。

总之,BCP20/80-based复合材料显示出高山活动增加以及DMP1,CD31,VEGF189基因表达而BCP60/40-based复合材料(图6)。此外,BCP20/80-based复合材料显示,增加纤维蛋白降解。因此,我们得出这样的结论:BCP20/80-based复合材料显示增强成骨和vasculogenic分化潜力而BCP60/40-based复合材料在体外,这表明BCP20/80-based复合材料可能会更有前途在活的有机体内骨头比BCP60/40-based增强复合材料。


图6
BCP60/40-based复合材料和BCP20/80-based复合材料的发展。人类脂肪干细胞被播种在BCP60/40或BCP20/80纳入纤维蛋白凝胶。BCP20/80-based复合材料显示增强成骨分化和vasculogenic BCP60/40-based相比,复合材料的潜力在体外。=、相似的两种复合材料;<、高BCP20/80-based BCP60/40-based复合材料相比,复合材料;哈,羟磷灰石;βtcp,β磷酸三钙;KI67增殖标记;RUNX2runt-related转录因子2;在骨粘连蛋白;DMP1牙本质基质酸性phosphoprotein-1;COL1collagen-1;COL3collagen-3;CD31,differentiation-31集群;VEGF165血管内皮生长因子- 165;VEGF189血管内皮生长因子- 189;EDN1,endothelin-1。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

Fransisca a . s . van Esterik工作由阿姆斯特丹大学的资助支持的刺激口腔再生医学领域的研究重点。作者感谢Henk-Jan普林斯,b。Naaijkens Jolanda Hogervorst脂肪干细胞隔离,酯Weijers Pieter Koolwijk提供纤维蛋白原、凝血酶,和建议,狮子座van Ruijven microcomputed断层扫描评估,研究所Straumann AG提供Straumann BoneCeramic 20/80。

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