文摘

7,12-Dimethylbenz (a)蒽(DMBA)迅速抑制造血祖细胞,衡量集落形成单位(CFU)在小鼠骨髓(BM)导致成熟细胞损失补给失败。这些损失是由Cyp1b1介导的,独立的AhR,尽管Cyp1b1感应。BM间叶细胞祖细胞(MPC)可能调解这些反应由于基底Cyp1b1诱导最小。PreB集落形成单位活动(PreB CFU)是在孤立的细胞失去了在24小时内(BMC)除非cocultured细胞主要来源于MPC (BMS2线)。老鼠胚胎OP9线,它提供了更高效的coculture支持,股票类似induction-resistant Cyp1b1特征。这OP9支持由DMBA压制,然后阻止Cyp1b1抑制剂。OP9-enriched介质部分支撑CFU活动但失去DMBA-mediated抑制,与中介通过OP9 Cyp1b1一致。PreB CFU活动在BMC Cyp1b1-ko老鼠DMBA增强敏感性。BMC基因表达谱识别细胞因子和发育因素大大改变Cyp1b1-ko老鼠。DMBA WT小鼠几乎没有影响,但系统地修改许多集群Cyp1b1-ko老鼠的反应。 Typical BMC AhR-responsive genes were insensitive to Cyp1b1 deletion. TCDD replicated Cyp1b1 interventions, suggesting alternative AhR mediation. Cyp1b1 also diminishes oxidative stress, a key cause of stem cell instability.

1。介绍

人们长期暴露于多环芳烃(多环芳烃)以多种方式从吸烟到柴油烟雾和煤焦油(1]。许多多环芳烃代谢转换的P450细胞色素(cyp)高活性和诱变dihydrodiol环氧代谢物(2]。提供最高水平的代谢在肝脏细胞色素P4501A1 (Cyp1a1),然而,也有高水平的酶,值得注意的是,对这种毒性的谷胱甘肽转移酶提供保护。在骨髓(BM),同样活跃的细胞色素P450 1 b1 (Cyp1b1),在靠近造血干细胞利基(3]。老鼠的大量研究表明,重复多环芳烃导致免疫抑制的日常管理。许多TCDD对免疫系统的影响是由芳基碳氢化合物的直接活化受体(AhR) [4]。这种干预适用于T细胞,在胸腺祖细胞水平和Treg / T17细胞。多环芳烃,如TCDD,激活诱导Cyp1a1和Cyp1b1气道高反应性5,6]。因此,多环芳烃可以通过转换函数通过气道高反应性的激活和活性代谢物。在这里,我们描述的新方法解决的影响多环芳烃代谢产物对造血干细胞和祖细胞谱系在活的有机体内在细胞培养模型。

为了更好地了解这种免疫抑制的机制,我们使用单一的腹腔内或口服剂量。这种方法提供了更好的时间进程的定义和个人抑制免疫细胞的步骤。集落形成单位(CFU)化验表明,适度的单剂量两个多环芳烃,7日12-dimethylbenz (a)蒽(DMBA)和苯并(a)芘(BP),抑制淋巴增殖活动,骨髓,在6小时内红色的祖细胞。成熟的细胞不受影响最小的基因表达所示反应DMBA [5,6]。这些共同的祖抑制反应表明,干细胞分化各自的行被DMBA代谢物。删除这些排除Cyp1b1-ko老鼠AhR的但是非常独立,介导DMBA诱导Cyp1b1的大多数细胞类型。

BM淋巴和髓细胞变得枯竭后24至48小时DMBA管理。在此期间,从胸腺淋巴细胞也同样耗尽(T细胞)和脾细胞(B)。不同剂量和路由DMBA管理生产48小时消逝BM成熟淋巴细胞的胸腺,脾脏,每个与抑制长达BM PreB CFU扩张活动(6]。我们的结论是,初始DMBA对每个组织的淋巴细胞数量的影响是由于抑制BM常见的淋巴祖细胞(CLP)从干细胞及其进展。这一结论支持了CLP流分析和其他祖人群。这导致未能取代出口这三个来源的细胞,尤其是受伤的网站,如肺。

BM间叶细胞祖细胞,然而,异常强劲的基底Cyp1b1表达诱导气道高反应性,相对不敏感。我们假设,因此,BM祖活动的抑制是通过间叶细胞祖细胞介导的接近的干细胞利基。BP区别DMBA造血恢复的活动在24小时内,通过一个AhR-dependent过程。这次复苏与大型AhR-mediated增加多个相关细胞因子,我们属性肝脏代谢后的BP广泛的Cyp1a1感应。这种代谢形式BP醌类,它可以激活NF -κB通路,对细胞因子刺激特征明显的路线。刺激细胞因子、白细胞介素6保护造血祖细胞。Cyp1家庭成员也干预炎症调控分子的生成(合格、resolvin) [7]。

我们最初确定Cyp1b1(然后P450EF)作为AhR-induced multipotential小鼠胚胎成纤维细胞的细胞色素P450 (mef) [8]。随后基因克隆,首先从人类角质细胞(9),和并行工作mef (10和大鼠肾上腺11)建立同一Cyp1b1基因有关,建议发展功能。突变的连杆青光眼(12)建立了一个人类的生理作用。这是进一步强调与细胞形态和血管发展endothelia和周13],小鼠女性高血压[14),肥胖和纳什在雄性和雌性老鼠15]。Cyp1b1也被证明在许多肿瘤中表达的高度16]。这个角色是进一步强调内生激活Wnt-induced Cyp1b1-ko小鼠肠道息肉(17]。

为了解剖Cyp1b1新陈代谢的作用的多环芳烃在BM造血,我们已经建立了一个在体外coculture模型主要老鼠BM细胞,胶原酶治疗,孤立的cocultured间叶细胞祖细胞(MPC)线。OP9细胞系,源自aorta-gonadal中肾胚胎(AGM)地区(18),通常用作基质支持干细胞文化。在这里,我们表明,OP9细胞有效维持PreB祖增殖活动24小时,在衡量PreB集落形成单位化验(PreB CFU)。我们使用这个coculture模型表明,DMBA和英国石油公司有效地抑制这种活动。其他MPC行函数以同样的方式但维持CFU活动的效率较低。在这项工作中,我们表明,Cyp1b1 OP9细胞的活动,而不是在BMC,介导CFU的PAH镇压活动。我们表明,OP9-enriched媒体支持CFU活动而且这coculture PAH抑制不再敏感。Cyp1b1-ko BMC证实了该模型的使用也表明Cyp1b1产生在体外稳定的HSC活动,令人惊讶的是,增强了DMBA PreB祖细胞的敏感性。为了解决这个异常,我们检查了BM细胞的基因表达谱WT Cyp1b1-ko BMC,以及在活的有机体内对DMBA的反应。一组Cyp1b1-responsive细胞因子和发展标记标识。

2。材料和方法

2.1。动物

C57BL / 6 j小鼠和(野生型、WT)老鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。Cyp1b1-null (Cyp1b1-ko)小鼠饲养在动物保健设施生物气候室动物保健设施(19]。所有老鼠都安置在AAALAC认证威斯康辛麦迪逊大学兽医、生物气候室动物保健单位和使用按照国家卫生研究院指导实验室动物保健和使用的。

2.2。多环芳烃的治疗在活的有机体内

动物对待PAH, TCDD或车辆控制通过一个单一的IP(橄榄油)注入(DMBA 50毫克/公斤;英国石油(BP) 50毫克/公斤;TCDD, 0.03毫克/公斤(Accustandard;纽黑文,CT))前隔离BMC的分析(1,2]。TCDD曝光都是在12小时内完成,而多环芳烃进行48小时。

2.3。骨髓隔离

小鼠安乐死在有限公司₂。大腿骨立即提取并粉碎提取媒体的边后卫(RMPI + 2%)。骨髓被曝光和细胞矩阵使用了1型胶原酶(1600 U)(沃辛顿,莱克伍德,新泽西)消化为15分钟37°C,用颤抖的在110 rpm (6]。BMC在提取媒体使用离心清洗和收集。

2.4。细胞/细胞培养

从保罗医生Kincade BMS2细胞是一个礼物20.),而C3H10T1/2 [21]和OP9 [18)细胞从写明ATCC购买(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在标准条件下细胞培养(37°C公司5%₂在饱和大气湿度)的边后卫(亚特兰大生物制剂,华丽的分支,GA)补充媒体(RPMI 1640年,BMS2;DMEM C3H10T1/2;MEM OP9)(费舍尔科学,沃尔瑟姆,MA)根据建议,融合与段落在80%。馈线间质文化增长大约100%融合和处理10μg / mL丝裂霉素C(σ,圣路易斯,密苏里州)24小时进一步抑制细胞分裂。丝裂霉素C(2 5毫克/毫升)股价保持在PBS和保持在液态氮冷冻。支线层保持在对待文化长达6周。Cocultures主要是由新鲜的孤立的BMC支线层。条件培养基被定义为媒体从支线层单独培养24小时后恢复过来。多环芳烃和TCDD曝光测试24小时孵化后,除非另有注明。

2.5。微阵列

微阵列分析完成了一式三份WT, Cyp1b1-ko老鼠用DMBA或TCDD按上面。车辆控制动物服用橄榄油。RNA被隔离使用试剂盒的RNeasy mini-kit(希尔登,德国)和量化使用Nanodrop(热费希尔科学;沃尔瑟姆,MA)和完整性评估使用甲醛琼脂糖凝胶电泳。Cy3和Cy5标签完成使用安捷伦科技的双重颜色基因表达工具和分析完成对整个老鼠基因组芯片4×44幻灯片,使用DNA微阵列扫描仪和特征提取软件(CA)圣克拉拉。分析完成后使用EDGE3软件包[6,22]。

2.6。治疗在体外

新孤立主要BMC镀在密度为1.05×10⁶细胞/厘米²在新鲜培养基(MEM + 20%的边后卫)。Coculture实验完成了利用馈线细胞,而单一栽培完成原发性骨髓细胞在组织culture-treated塑料。多环芳烃,TCDD或DMSO控制治疗被添加到细胞悬浊液在电镀。细胞治疗24小时之前的分析。

2.7。CFU

集落形成单位(CFU)检测完成后按照制造商的指示。总之,BMC被离心分离直接从股骨骨髓提取/隔离或后24小时的治疗。BMC resuspended在新鲜培养基在5×10⁵细胞/毫升PreB祖细胞。1/10的细胞与适当的混合methocult媒体(公元前干细胞技术、温哥华,加拿大)和标准文化孵化条件(37°C公司5%₂在饱和大气湿度)7天。通过光学显微镜殖民地统计的目视检查。统计学意义是由图基的方差分析事后测试多个比较,(GraphPad棱镜,圣地亚哥,CA)。

2.8。qPCR

感应的Cyp1b1决心使用qPCR分析。总RNA是孤立的如上所述。使用随机寡核苷酸和GoTaq逆转录完工,和具体表达决心使用SYBR qPCR大师混合,按照制造商的说明(Promega集团;麦迪逊,WI)。信号检测和综合使用BioRad排名实时PCR检测系统(大力神,CA)。引物获得从IDT(珊瑚镇,IA):Cyp1b1(F: CCACTATTACGGACATCTTCGG, R: CACAACCTGGTCCAACTCAG)和肌动蛋白(F: CAACGAGCGGTTCCATG, R: GCCACAGGATTCCATACCCA)。分析完成后使用GraphPad棱镜(拉霍亚,CA)软件。Ct值被规范化肌动蛋白计算表达式,褶皱变化是供DMBA诱导治疗,和区间范围计算图形演示。褶皱变化数据日志转换和分析方差分析有统计学意义的图基事后测试。

2.9。剩余多环芳烃萃取和高效液相色谱分析

OP9细胞培养24小时与媒体补充3μM DMBA。媒体被收集和处理β葡萄糖醛酸酶(σ)2000 U /毫升优化恢复的脂溶性残留的多环芳烃。样本中掺入提取控制标准(指[a, l]芘)(NCI化学致癌物参考标准库,中西部研究所,堪萨斯城,密苏里州)提取使用前2:1乙酸乙酯:丙酮(σ)有机相,重复提取离心。有机相是干在液氮和提取的化合物储存在−80°C到分析。干样本resuspended 100%甲醇立即注入到高效液相色谱柱前。个人多环芳烃分离使用水(米尔福德,MA) 2695高效液相色谱仪器和C₁₈列,采用紫外检测器(波长254 nm)和水域470扫描花期探测器。数据收集与水域授权3软件。峰分离在50 - 100%甲醇梯度在55分钟(23]。

3所示。结果

3.1。在活的有机体内DMBA和BP对PreB淋巴祖细胞的影响在活的有机体内

我们以前用急性给药动物模型来研究多环芳烃在骨髓造血血统的影响(5,6,24]。在这里,我们使用PreB CFU化验的抑制淋巴祖细胞通过IP管理两个良好的多环芳烃(BP和DMBA 50毫克/公斤)。我们检查的影响6和48小时后,对应,分别主肝间隙和缓慢释放的中点腹膜脂肪(图1(一))[5,6]。主要的间隙由感应增强Cyp1a1的肝脏。DMBA之间的间隙动力学不明显不同,英国石油公司(24,25]。6小时后,DMBA和BP低PreB CFU活动50 - 70。48小时后,这些活动相反的方向变化。抑制DMBA治疗进一步下跌90%,而英国石油(BP)治疗显示了一个完整的恢复(图1 (b))。这种差异是在48小时后的成熟的细胞群,其中有50% DMBA总BMC的镇压行动,但没有抑制由英国石油公司。祖的变化取决于Cyp1b1表达和延伸到B和T淋巴细胞在脾脏和胸腺,来自这些BM祖细胞(6,26]。

在小鼠AhRd DMBA气道高反应性和BP未能激活,这两种多环芳烃在6小时内达到相同的抑制峰值水平(图1 (b))。英国石油(BP)与DMBA相比,对BMC祖活动展览AhR-mediated复苏影响,可能由于准备英国石油公司形成醌类(5]。在其他地方,我们已经表明,这些影响DMBA依赖Cyp1b1 [5,6,24]。Cyp1a1删除也可以防止这次复苏(25,27]。

3.2。调整的在体外模型

为了更好地评估PAH的机制对BM干细胞和祖细胞的影响,我们已经建立了一个在体外模型。第一步是维持足够的曝光时间的BMC活动看到多环芳烃的影响(24小时)。BMC孤立通过胶原酶治疗时提供广泛的CFU活动化验在甲基纤维素中直接支持媒体的祖克隆扩张试验。然而,24小时仅在媒体,文化转移CFU分析媒体之前,导致几乎完全丧失的CFU活动(典型的示例,图2(一个))。维持祖活动24小时,我们测试的能力与间充质coculture multipotential基质。BMS2细胞,来源于不断的文化附着鼠标BM祖细胞(20.),保留40%的活动。OP9细胞,来源于小鼠胚胎的AGM区18),被广泛用于维持干细胞活动(28,29日]。OP9细胞完全持续祖活动(图24小时2(一个))。C3H10T1/2细胞,来源于小鼠胚胎成纤维细胞(21),也明显持续PreB CFU祖细胞活动(数据未显示)。由OP9细胞培养基富集(OP9-EM) 24小时之前,文化是相对有效BMS2细胞在维持BMC祖活动缺乏OP9支持(图2 (b))。

我们也使用CFU化验为granulocyte-monocyte(通用汽车)和红细胞(E)祖数量(图2 (c))。红细胞祖CFU活动持续几乎以及PreB CFU活动。相比之下,通用汽车祖细胞失去了大部分的活动。这可能是解释这一事实OP9细胞不表达巨噬细胞集落刺激因子(mCSF) [30.]。这个因素,然而,导致损失的其他造血血统(31日]。

这个OP9 / BMC coculture模型被用来测试的影响多环芳烃在BMC祖活动(图3(一个))。BMC要么是培养与OP9-EM OP9细胞和血清媒体或媒体。OP9 / BMC coculture模型也同样敏感,多环芳烃(BP和DMBA,每1μ米)和TCDD (10 nM)治疗,导致重大损失的PreB祖活动(数据3 (b)和3 (c))。然而,当OP9-EM使用BMC OP9细胞本身,而是对DMBA低(图3 (b))。DMBA的响应,因此,获取,主要来自OP9细胞,和新陈代谢的DMBA AhR-inducible Cyp1b1在造血BMC是无效的。然而,这个实验并不排除影响由OP9细胞诱导气道高反应性抑制因素。

可能可能是DMBA代谢活性代谢物OP9细胞。因为BMS2细胞表达基底Cyp1b1耐诱导气道高反应性,我们测试了OP9细胞类似的表达式。图4(一)表明Cyp1b1信使rna存在于基底OP9细胞比BMS2上级。摘要:10 t1/2细胞水平低于正常基底,但被DMBA诱导十倍。BMS2诱导气道高反应性和OP9共享相同的阻力(图4 (b))。这个基底Cyp1b1表达,诱导气道高反应性较低,是典型的大英博物馆主要对手(3]。DMBA产品高效液相色谱配置文件中未解决的10,11 -(主要)和8、9 -(小)dihydrodiols(峰值)和混合酚类化合物(B)峰值,通常看到的Cyp1b1与DMBA[3小时孵化后32)(图4 (c))。这个活动DMBA OP9强烈表明,细胞代谢的这些细胞有助于他们要求DMBA CFU活动的抑制。

3.3。Cyp1b1的角色在维持PreB CFU BMC

测试的贡献Cyp1b1 PreB CFU活动,我们cocultured Cyp1b1-ko BMC OP9细胞(图24小时5(一个))。Cyp1b1-ko BMC的CFU活动,直接胶原酶治疗后,显示下降25%后24小时coculture WT BMC(相比)。治疗的coculture 1μM DMBA表明,祖活动Cyp1b1-ko DMBA更敏感比WT BMC(抑制62%和> 90%)(图5 (b))。这加强了DMBA灵敏度的概念BMC coculture模型主要来源于OP9细胞,可能从转换Cyp1b1活性环氧dihydrodiol代谢物。因此,OP9-enriched媒体(OP9-EM)部分有效支持PreB CFU WT Cyp1b1-ko BMC(图5 (c))。在每种情况下,没有缺席的DMBA OP9细胞的影响。

多增强灵敏度Cyp1b1-ko BMC表明Cyp1b1提供稳定通过调节本构祖/干细胞支持造血细胞本身的过程。我们曾表明Cyp1b1防止氧化应激,这是剧毒,这些造血细胞(13]。

3.4。Cyp1b1 OP9细胞的作用

TCDD的活动在这个coculture系统留有余地:DMBA可能直接在BMC在OP-9细胞祖细胞通过激活气道高反应性。Tetramethoxystilbene (TMS)每个强有力地抑制Cyp1b1 nf。AhR nf也是一个对手。我们使用这些抑制剂试验Cyp1b1参与DMBA-mediated PreB CFU抑制,我们现在只能显示来自OP9细胞。一个问题是,DMBA结合Cyp1b1非常有说服力地,因此,很难竞争性抑制。在工作要描述的其他地方,我们已经表明,DNA修复基因的引入缺陷,XPC (XPC−−) (33),BMC大大增强了力量的PAH抑制(Rondelli,未发表的观察),目前在20 nM DMBA有效。这种力量增加允许完全抑制a-NF或经颅磁刺激(1米每)。OP9细胞,因此,通过Cyp1b1功能(图6)。

3.5。影响Cyp1b1-ko本构和DMBA-Induced BM基因表达

检查基因阵列BM的变化,在活的有机体内12和24小时后,表示对DMBA很少,尽管规范的目标等于气道高反应性的刺激,由英国石油公司或TCDD和广泛的趋化因子和细胞因子刺激英国石油公司(5,6]。我们解释低响应DMBA小人口的祖细胞的特定目标而不是主要的成熟细胞。理解的异常影响Cyp1b1和DMBA coculture模型中,我们确定了基因表达差异WT和Cyp1b1-ko BMC(局部代谢的低水平)。我们还比较了在活的有机体内TCDD的影响以确定是否删除Cyp1b1可以激活在大英博物馆的气道高反应性。这12小时的治疗期对应于最大PreB CFU抑制附近。

表1显示的例子从BM细胞信使rna的基因表达水平Cyp1b1-ko小鼠相比WT老鼠。我们表明,基因,它无法回应DMBA WT老鼠,现在回应Cyp1b1-ko老鼠,要么——或者表达下调。这里显示的所有更改由TCDD在某种程度上共享。四组(模拟)代表刺激;一组(E)代表抑制。

A组基因,典型Cyp1a1、Ahrr Cyp1b1,经典反应气道高反应性,DRE元素显示类似的峰值upregulation每个PAH在12小时5]。DMBA强烈诱导表达Cyp1b1-ko老鼠。

B组的例子包括基因参与炎症压力,刺激在WT TCDD老鼠,但显示更大的增加与BP(6小时内)5]。在WT老鼠,B组基因与DMBA没有刺激,即使在12小时之后,因此这些基因与经典的组织反应者区分开来。令人惊讶的是,每个基因的表达在Cyp1b1-ko老鼠被DMBA明显增强。这个额外的反应相比WT老鼠可能出现由于DMBA浓度增加或肝脏代谢,当由Cyp1b1大英博物馆缺乏新陈代谢。

像在B组的基因,基因C和D组也对TCDD WT老鼠,但不要DMBA。每个显示增加表达Cyp1b1-ko老鼠。B组的炎症反应增强Cyp1b1-ko小鼠的治疗DMBA和C组反应抑制DMBA治疗Cyp1b1-ko老鼠,而D组增加DMBA待遇不受影响。E组基因表现出减少表达在Cyp1b1-ko WT老鼠接受TCDD和老鼠在没有治疗的情况下,这也是受DMBA影响。从本质上讲,E组的抑制与D组,每个响应Cyp1b1-ko TCDD D和E是一组匹配的WT老鼠,但不是DMBA。这些反应是匹配在同一家族相似的基因,如表所示1传奇。大多数基因在群体汉英,特点是Cyp1b1-ko老鼠调节发展的反应,包括造血作用。

4所示。讨论

最近在活的有机体内研究多环芳烃在大英博物馆对造血细胞分化的影响表明,单剂迅速抑制淋巴,骨髓,和红色的祖活动,当测量与相应的CFU化验。共享的抑制过程和直接测量早期祖细胞和干细胞的数量表明,造血干细胞活动是有针对性的。抑制效应的关系在BM成熟细胞的损失,脾脏、胸腺表明,这些细胞性损失出现,最初,从PAH-induced未能从大英博物馆补充成熟细胞造血干细胞(6]。这些组织提供成熟的B和T淋巴细胞对血管和淋巴循环。祖抑制由Cyp1b1,气道高反应性的独立,尽管明显的感应Cyp1b1表达式在大英博物馆。我们假设这是因为异常关键Cyp1b1活动是由一个BM间充质祖族群,其中Cyp1b1不是诱导。

在目前的研究中,我们描述一个coculture模型,再现了在活的有机体内多环芳烃BM祖细胞的抑制在体外。这个模型建立了潜在的参与BM间充质Cyp1b1抑制。值得注意的是,我们表明,多环芳烃抑制可能出现的Cyp1b1支持OP9间充质细胞而不是从Cyp1b1 BMC的表达。分享multipotential OP9细胞间质祖活动BM-derived, BMS2细胞系(29日,34- - - - - -39]。其他间充质线来源于胚胎的AGM区收益率OP9细胞表现出相当大的选择性对这种干细胞支持能力(35]。OP9 BMS2细胞也有明显的基底Cyp1b1表达式,如相当于初级BM细胞,几乎没有响应诱导气道高反应性(图4)。C3H10T1/2细胞,另一个multipotential间充质来源于小鼠胚胎成纤维细胞,也支持PreB CFU祖活动。然而,他们显示Cyp1b1 AhR-mediated感应高。

Cyp1b1活动的起源最明显的证明了发现OP9-enriched媒体仅维持在BMC PreB祖活动但是在很大程度上是对DMBA,尽管在BMC Cyp1b1的表达。TCDD也抑制PreB CFU BMC / OP9 coculture模型(图3 (c)),从而表明AhR的贡献从直接激活,这可能会延长DMBA。因此,TCDD不是代谢,并且可能会转移到CFU化验。的有效逆转DMBA活动Cyp1b1抑制剂,a-NF和经颅磁刺激(图6),表明新陈代谢Cyp1b1比激活气道高反应性更重要。

令人惊讶的是,coculture Cyp1b1-ko BMC OP9细胞大大增加了对多环芳烃的敏感性。这可能增强敏感性是因为Cyp1b1也防止oxygen-induced氧化应激(牛)endothelia和周都出现在BM血管细胞(13]。牛在Cyp1b1-ko BMC的增加可能达到祖细胞,提高对多环芳烃代谢产物。初步研究表明,在BMC人口减少DNA修复,通过XPC损失的活动,同样增加淋巴祖对这些代谢物(图6)[33]。

这DMBA祖细胞的抑制最可能来源于代谢物从OP9细胞转移。还有待确定为什么Cyp1b1 BMC是无效的在OP9 DMBA激活Cyp1b1相比细胞。解决这个问题的第一种方法是在这些分数比较DMBA的新陈代谢。Cyp1b1 DMBA代谢物生成的OP9细胞也可能删除祖支持由这些细胞分泌的因素。DMBA之外,在浓缩预处理,相对在减少无效的活动丰富媒体(EM因素)(没有显示)。这些因素似乎取代大约一半的祖OP9细胞(图支持活动3 (b))。剩下的支持来自不稳定因素,OP9-EM不保留。

在活的有机体内,BP-mediated抑制祖活动大约6小时后恢复。我们已经表明,这种逆转来源于代谢生成的激活AhR-mediated Cyp1a1的感应5]。最有可能的是,英国石油公司生产的醌类肝脏移植细胞因子和趋化因子在BM NF-kB激活。细胞因子白细胞介素6一样,或者凋亡NF-kB效应可以选择性地反向BP在祖细胞毒性。这种逆转的CFU抑制与英国石油(BP)治疗未见OP9 coculture模型,在英国石油公司DMBA相当的影响。看到这个平行在活的有机体内在AhRd老鼠,对多环芳烃感应(图1)。

基因表达分析表明,Cyp1b1删除在BMC比去除多环芳烃代谢。在活的有机体内,效果因内源性或饮食基质Cyp1b1 BMC删除后很明显。此外,删除Cyp1b1介绍在活的有机体内影响缺席的DMBA WT老鼠。这种效应出现在大英博物馆增加了DMBA或新的替代代谢物,可以删除的每个结果Cyp1b1新陈代谢。趋化因子和细胞因子的设置增加了英国石油公司,在较小程度上,TCDD高架结构上在Cyp1b1-ko BM。这个活动是增强用DMBA cotreatment在WT老鼠没有这样的效果。Cyp1b1删除就不会增加气道高反应性规范/ ARNT-directed转录。AhR-type活动在Cyp1b1-ko BM,因此,并不来自AhR / ARNT复合物。我们以前认为急性细胞因子/趋化因子对BP的反应,由TCDD只是部分复制,实际上源于AhR和NF-kB转录因子之间的伙伴关系。一个鼓舞人心的伙伴关系和Rel B细胞因子表达增加(气道高反应性40]。

Cyp1b1-deletion表造成的基因表达的变化1源于内生和饮食的影响化合物的损失影响BM基因表达和比率的变化大英博物馆造血细胞数量。干细胞和造血系祖细胞存在于较低的比例,因此,将直接导致了基因表达。生理干预Cyp1b1删除发生通过切除雌二醇和代羟基产品,各种目标核(ER,呃)和膜相关的受体(ER、医生)和影响越来越多的过程,包括血压和癌症(41)和色氨酸二聚产品(42]。我们发现许多Cyp1b1删除对发育的影响因素。即使在低水平表达,这些基因只能检测到如果明显表达更丰富的细胞类型中许多礼物隔绝BM(也许>总额的5%)。到目前为止主要反应类型观察是Cyp1b1-ko小鼠的增加或减少相应减少反应Cyp1b1-ko老鼠DMBA处理。Creb3l3、Hoxb6 Hoxb9、Sox15 Sox19都明显增加Cyp1b1-ko老鼠通过共享机制,TCDD和BP在WT老鼠但被DMBA Cyp1b1-ko老鼠。一些DMBA Cyp1b1-ko反应不受影响,包括刺激Socs3 Nr4a1,这也同样增加了TCDD,减少Rag1和Spp1 /骨桥蛋白。这些基因变化点小说之间的串扰的影响内源性Cyp1b1-ko信号和选择性的AhR DMBA影响。

附加分

突出了。造血祖细胞增殖的选择性抑制DMBA (CFU活动)是由在BM基质细胞的新陈代谢,这表现出强劲的基础表达Cyp1b1但最小的感应。OP9老鼠胚胎间质细胞分泌的因素支持BM淋巴扩散和红色的祖细胞至少24小时。这种支持是大幅复制OP9-enriched媒体和BMS2和C3H10T1/2细胞。Cyp1b1表达足够的水平在OP9细胞生成活性DMBA代谢物抑制祖细胞扩张。Cyp1b1在孤立的BMC水平要低得多,不足以产生抑制性代谢物。Cyp1b1提供基本的保护在BM祖细胞,通过去除氧化应激或观察到抑制气道高反应性的/ NF-kB趋化因子和细胞因子的刺激。这些分泌蛋白可以保护祖细胞或前体造血干细胞的活性。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢Chenkai毛在帮助准备为他的贡献在体外这项工作的研究。工作在美国国立卫生研究院的资助DK072749, DK090249, ES007015。