动态跟踪人类间充质干细胞取向后烟雾吸入伤NOD / SCID小鼠

文摘

多个临床证据支持的潜在价值间充质干细胞(msc)治疗急性肺损伤(ALI)。然而,很少有研究关注的动态取向msc在急性肺损伤的动物。在这项研究中,我们跟踪系统移植人类骨骨髓来源间充质干细胞(hBMSCs) NOD / SCID小鼠烟雾吸入伤(他们)通过生物荧光成像(BLI)。结果表明,hBMSCs系统交付到健康点头/ SCID鼠最初居住在肺部,然后部分把腹部后24 h。与受伤对照组hBMSCs处理相比,高数量的hBMSCs发现孵化器计划NOD / SCID小鼠的肺。在受伤和他们老鼠,劳保局信号在肺部稳步下降随着时间的推移,5天治疗后消失。hBMSCs明显减弱肺损伤,KGF的水平升高,肿瘤坏死因子的水平下降αBALF和抑制炎症细胞浸润与他们的老鼠。总之,我们的研究结果表明,更多的系统注入hBMSCs本地化与他们小鼠的肺部。hBMSC异种移植修复烟inhalation-induced在小鼠肺损伤。这个修复可能是由于抗炎的作用和分泌KGF hMSCs但并不与hBMSCs进入肺泡上皮细胞的分化。

1。介绍

烟雾吸入伤(他们)是由烟雾诱发呼吸道和肺实质的伤害,有或没有额外的热损失越小。他们是一种发病率和死亡率的主要原因在火灾悲剧的受害者1),影响到大约22%的烧伤病人和导致至少30%的所有与火有关的死亡率(2]。此外,80%到90%的与火有关的死亡人数一直归因于烟雾吸入(3]。烟的主要有害成分包括热、系统性毒素(例如,CO和氰化物)和呼吸道刺激4),损伤呼吸道和肺部组织。这导致喉/肺水肿,气道阻塞和通气/灌注不匹配(5]。严重的病例可能出现急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [3]。确定最好的方法治疗烧伤患者,特别是在早期阶段的烟inhalation-induced急性肺损伤(ALI),仍然是一个困难的问题领域的急救药品。目前治疗他们把主要精力集中于氧管理、气道管理、液体复苏,机械通风,和特定的使用药物1,4,6]。虽然很多药物是有效地减少肺损伤动物模型,只有少数药物,包括抗凝血剂,β2受体激动剂、抗氧化剂和炎性介质受体激动剂,目前应用于临床[6,7]。

间充质干细胞(msc)是自我更新,多能祖细胞有可能分化成多个不同的中胚层的血统。许多不同的动物模型所示,msc的定位能力,受伤的网站和施加nonimmunogenic和免疫抑制特性8,9]。基于这些属性,msc是一个很有潜力的来源细胞治疗各种复杂的疾病,如移植物抗宿主病(10,11),有氧运动/脑血管疾病[12),脊髓损伤(13),肝脏疾病(14),和呼吸道疾病15,16]。此外,许多研究表明,msc发挥保护作用对阿里通过分泌多种旁分泌因子,包括内皮和上皮生长因子,抗炎细胞因子,抗菌肽(17- - - - - -20.]。然而,这些研究主要集中在endotoxin-induced阿里和研究专注于msc对烟雾的影响inhalation-induced阿里仍然缺乏。此外,关于定位还不确定和msc体内后管理的持久性与阿里科目。

生物荧光成像(BLI),最近开发的技术,使正在进行的生物过程的非侵入性研究小实验动物,可用于跟踪荧光素酶(Luc)表达细胞植入动物生活在真正的时间。在先前的研究中,基德等人使用BLI跟踪的动态分布萤火虫Luc-expressing人类msc (hMSCs)后系统注入健康的老鼠,老鼠受到炎症侮辱,和老鼠轴承肿瘤。hMSCs被发现最初定位到肺部,后来搬到肝脏和脾脏。此外,吕克·hMSCs下降产生的信号。在受伤的老鼠和老鼠肿瘤,发现hMSCs本地化后受伤的组织或肿瘤系统管理(21]。虽然它已经表明,msc最初定位系统交付后的肺,研究msc静脉注射后的动态分布与他们缺乏小鼠。在当前的研究中,我们修改人类骨骨髓来源msc (hBMSCs)稳定coexpress卢克和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(Luc-GFP-hBMSCs)。然后我们使用BLI跟踪细胞的定位模式的动态后14天系统性管理与他们正常老鼠和老鼠。我们的研究结果提供实验支持使用msc治疗他们。

2。材料和方法

2.1。细胞和动物

hMSCs买来Cyagen生物科学(广州)和生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Cyagen生物科学)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫)(Cyagen) 37°C下5%的股份有限公司₂。

男性NOD / SCID小鼠年龄在6到8周,体重从25到30 g,买来魏通李华实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。按照机构指南和使用的小鼠后批准的协议。

2.2。慢病毒载体建设和MSC转导

慢病毒载体携带卢克和GFP dual-fusion报告基因被上海GeneChem有限公司建造和净化有限公司转导,hMSCs被播种到25厘米²烧瓶包含适当的生长介质和增长到20% -30%融合。然后,GFP-Luc慢病毒载体被添加在感染复数(MOI) 10到2.5毫升包含5整除hMSCs在生长介质μ克/毫升聚凝胺。这些细胞被孵化的病毒8 - 12 h,这新鲜的培养基添加到每个瓶后,和一个额外的细胞被孵化48 - 72 h。这些细胞被通道1:2和融合增长到80 - 100%。三天后传导,细胞被认为在徕卡DMI4000倒置显微镜配备荧光源和电荷耦合器件(CCD)相机。转导效率是由fluorescence-activated细胞GFP表达的排序(流式细胞仪)分析使用先前描述的设置(22]。

2.3。流式细胞术分析

Luc-GFP-hBMSCs收获了0.25% trypsin-EDTA和resuspended磷酸盐(PBS)补充2%的边后卫。约1×10⁶细胞被沾染了1μ在4°C g抗体30分钟,然后在流式细胞仪分析口径流式细胞分析仪(Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西)。人类抗体蛋白质被用于分析如下:CD105, CD29、CD44, CD73, CD90、CD34、CD45、CD11c (BD生物科学)。

2.4。转导hMSCs Multilineage分化

确定multilineage转导hMSCs的分化潜能,我们培养的细胞在各种类型的分化媒体根据制造商的建议(Cyagen生物科学,广州,中国,http://www.cyagen.com/)。诱导脂肪形成的差异化,Luc-GFP-hBMSCs亚文化在six-well板块2×10⁴细胞/厘米²生长培养基中含10%的边后卫,5% penicillin-streptomycin,谷酰胺和2毫米。培养基是每三天更换一次,直到细胞融合达到了100%,之后生长介质被感应介质取代(2毫升/)包含的边后卫,penicillin-streptomycin,谷氨酰胺,胰岛素,罗格列酮和地塞米松。三天后,媒介是替换为维护介质组成的边后卫,penicillin-streptomycin和胰岛素。24小时后,维护媒介改变了回感应介质,和这个循环重复三次。经过五周期的感应/维护,在维护培养基培养细胞为3天。三个星期后,脂肪细胞可视化与油红O染色。

诱导成骨分化,Luc-GFP-hBMSCs培养在生长介质的密度3×10⁴细胞/厘米²1天在37°C的5%的股份有限公司₂湿润孵化器。这之后,生长介质是吸气,取而代之的是成骨分化培养基(2毫升/)包含的边后卫,penicillin-streptomycin,谷氨酰胺,抗坏血酸盐,β甘油磷酸盐和地塞米松。媒介是每三天更换一次。三周后,这些细胞被固定为2毫升4%甲醛溶液和茜素红染色。光学显微镜是用来可视化和捕获的彩色细胞图像。

人类msc诱导chondrogenic分化,subconfluent条件使胰蛋白酶化和2×10的整除⁵细胞每15毫升离心管中加入,和板是400 g×5分钟。分化为软骨细胞,细胞培养在商业化chondrogenic感应媒介在人类TGF - 10 ng / mL重组β3所示。细胞颗粒形成的第一个24小时内自由浮动的总量。中每2 - 3天更换一次,骨料被培养为28天,阿尔新蓝染色后石蜡切片。

2.5。建立烟雾吸入小鼠模型

在这项研究中使用的所有动物收到人道关怀符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院。研究实验动物伦理委员会批准的协议的附属医院,中国人民武装警察部队后勤学院。戊巴比妥钠麻醉下进行手术,所有的努力都是尽量减少痛苦。

他们建立了模型使用先前描述的设备,构建了内部(23]。为此,清醒男点头/ SCID小鼠燃烧所产生的烟雾暴露阴燃木刨花smoke-generating容器连接到一个20 L透明曝光室。受到烟的老鼠为0,3,5,7,9分钟。建立严重他们评估了血液中碳氧血红蛋白(COHb)浓度,血气分析,测量湿/干重量比(W / D)肺组织和肺组织病理学。血液收集从老鼠被杀的一个子集1 h后烟雾暴露测量COHb浓度与血氧计(482 CO-Oximeter) (24)和血液气体分析内容用辐射计ABL 625血液气体分析仪(丹麦哥本哈根)[25]。另一个子集的老鼠被杀后3 d烟雾暴露,和肺部孤立的测量W / d比率和组织学分析。

2.6。Luc-GFP-hBMSC管理和生物荧光成像

100年,在烟雾吸入后24 hμL整除Luc-GFP-hBMSCs (3×10⁵细胞)的尾静脉注入控制和他们NOD / SCID小鼠。老鼠然后提交BLI形象化的本地化Luc-GFP-hBMSCs为1.5,2.5,5,7.5,10,注射后24 h和3和5天(21]。

监控Luc-GFP-hBMSC本地化到肺部,我们提交的小鼠异氟烷麻醉,然后腹腔内注射用D-luciferin萤火虫盐钾衬底(150毫克/公斤体重在100年μL PBS)。然后,我们把动物分成一个新系统在仰卧位(马卡尺生命科学、数据)。这些动物成像在10分钟时间内每隔1分钟收购(26]。量化光发射,一个感兴趣的区域(ROI)手动选择基于信号强度。ROI的面积保持不变,而信号强度记录平均光子每秒每平方厘米每球面度如前所述[21]。

2.7。分析肺组织湿/干重比

治疗后如上所述,老鼠被杀死,他们的左肺孤立。吸水后血液和其他污染物,湿肺组织样本的权重衡量。然后,肺部干在70°C的烤箱72 h,并测量他们的干重量。肺的W / D重量比率然后计算如前所述[25]。

2.8。组织学和免疫组织化学

上述对小鼠的肺被孤立,和他们的上部和中部叶固定在10%福尔马林24 h。组织样本被脱水,石蜡嵌入式,切成5毫米厚的部分。这后,样本与苏木精和伊红染色后())deparaffinization和评估在光学显微镜下观察(日本奥林巴斯BX51)。

Luc-GFP-hBMSCs肺组织中检测到GFP的疣状。deparaffinization和补液后,石蜡切片被放入压力锅,包括抗原检索缓冲区(0.01 M柠檬酸缓冲,pH值6.0)在全压力2分钟揭开抗原。疣是由孵化的部分与一只兔子anti-GFP单克隆抗体(Abcam 1: 100年,MA)在一夜之间在4°C,其后孵化biotin-conjugated二级抗体(ZSGB-bio,中国)37°C 1 h和辣根peroxidase-conjugated链霉亲和素(ZSGB-bio,中国)37°C为30分钟。部分是沾轻拍装备,这与苏木精复染色可视化细胞核。图像得到BX51奥林巴斯显微镜,并积极染色细胞的比例决定使用Image-Pro + 5.1版本。组织学和免疫组织化学分析,幻灯片是用数字标记,双盲检查是由两个独立的病理学家。

2.9。半定量的聚合酶链反应

提取总RNA PCR使用RNeasy工具包(Solarbio,北京),其中包括一个DNase消化步骤消除污染的DNA。半定量逆转录聚合酶链反应进行了使用热循环(热),并使用琼脂糖凝胶放大产品可视化。以下引物被用于PCR:荧光素酶转发:ACTGGGACGAAGACGAACAC。荧光素酶相反:GGCGACGTAATCCACGATCT。β肌动蛋白转发:GTGGGGCGCCCCAGGCACCA。β肌动蛋白逆转:CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。

2.10。分析肿瘤坏死因子-α和KGF水平在支气管肺泡灌洗液

支气管肺泡灌洗(BAL)是由灌输和退出无菌生理盐水(1毫升)通过气管插管使用20量度Surflo输液导管。这个过程重复了三次,三个BAL流体(BALF)样本汇集。BALF离心机(300 g×5分钟),和上层的部分存储在−80°C进行进一步的检查。的检测TNF -α角质细胞生长因子(KGF), BALF的上层清液进行了分析通过使用鼠标TNF -α酶联免疫试剂盒(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)和KGF酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国)制造商的指示。

2.11。统计分析

所有数据使用SPSS 13.0统计软件进行处理。数据显示为平均值±标准偏差。样本测量数据组间比较采用独立样本测试和组数据使用成对比较测试。被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。hMSC转导

Lenti-GFP-Luc 2.00 E + 8你/毫升浓度测定用的莫伊10感染hMSCs。转导效率大约是90%基于荧光和相差显微镜检查(48 h后的数字1(一)和1 (b))。GFP表达保持稳定不变的文化条件下至少30 d(数据没有显示)。体外Luc活动评估后使用BLI D-luciferin的应用。只有转导细胞显示Luc活动而不是控制细胞(图1 (c))。

3.2。表征Luc-GFP-hBMSCs

与Lenti-GFP-Luc转导后,流式细胞仪分析表明Luc-GFP-hBMSCs表达高水平的CD105, CD29、CD44, CD73, CD90和低水平的CD34、CD45、CD11c。这些蛋白质的选择进行分析,因为他们代表的表型标记hMSCs(图2(一个))[23]。表达模式是一致的在所有hMSCs测试,以及测试hMSCs被用于以下实验。此外,我们接受转导hMSCs脂肪形成的和成骨细胞的分化化验。在所有情况下,细胞积极油红O和茜素红染色检测文化分化培养基后,表明细胞分化潜力无论慢病毒转导(数据维护2 (b)和2 (c))。此外,chondrogenic分化转导hMSCs染色证实了软骨细胞的酸性粘多糖与阿尔新蓝(图2 (d))。

3.3。建立烟雾吸入性损伤的小鼠模型

他们建立小鼠模型,利用烟雾发生器内部构造,如前所述[23]。优化实验条件,诱导他们,老鼠受到烟为0,3,5,7,9分钟。85%的小鼠暴露于吸烟9分钟死于缺氧,所以这个时间点在以下检测排除。COHb浓度和血液气体含量测定后立即暴露和1 h后再次吸烟。随着烟雾暴露时间的增加,COHb浓度增加,而PaO₂和PaO₂/ FiO₂血液减少(图中的内容1(一))。西藏扶贫办₂/ FiO₂比率低于300在他们组的7分钟,这是在温和的ARDS根据柏林定义标准(27]。

W / D重量比作为一个索引的水积聚在肺部,这是一个指标的肺部水肿。在3 d烟雾暴露后,肺W / d比率在7分钟他们组相对于对照组明显升高;然而,没有差异,指出在孵化器计划组织(图3 - 5分钟3(一个))。因此,组织病理学结果显示暴露于烟雾7分钟导致最严重的肺部病变,包括肺泡空间缩小、肺泡和细支气管内膜增厚,炎性细胞浸润在气道(图3 (b))。基于这些结果,我们使用7分钟烟雾暴露协议以下研究。

3.4。hMSC动力学分布与他们注入小鼠后

Luc-GFP-hBMSCs (3×10⁵细胞/动物)静脉注入NOD / SCID小鼠有或没有他们。买卖BLI被用来监控Luc-GFP-hBMSC本地化模式随着时间的推移。如图4肺部,荧光素酶表达最初发现在控制和他们加上Luc-hBMSC组(图4(一))。与对照组相比,强BLI孵化器计划组织产生的信号。肺部BLI信号峰值为7.5 h后注入hBMSCs然后随时间逐渐减少(图4 (b))。hBMSCs输液后24 h,发光信号开始转移到腹部。然而,信号仍然主要在肺部与他们的老鼠。注入hBMSCs五天后,从肺部BLI信号完全消失,腹部的对照组小鼠显示只有微弱的光点信号。注射后14天,没有检测到信号在对照组或他们组(数字4(一)和4 (b))。

3.5。PCR和免疫组织化学检测hBMSC移植

注入Luc-GFP-hBMSCs 14天后,老鼠注入牺牲,PCR用于检测Luc表达肝脏和肺组织。与上述BLI结果一致,没有Luc表达式在对照组或发现他们组接受hBMSC政府(图5(一个))。因此,没有发现GFP-positive细胞在肺组织样本收集的这些老鼠(图5 (b))。

3.6。在他们小鼠保护作用的hBMSC异种移植

14天与他们注入hBMSCs到老鼠后,我们评估产生的效应细胞通过测量肺W / D重量比率和评估病变在肺组织样本。没有明显差异的W / D重量比对照组前后注入。肺W / D比他们+ hBMSC组明显低于未经处理的他们组(),这表明预处理hBMSCs可以减少肺部水肿的程度所产生的烟雾吸入(图6(一))。此外,PaO₂和PaO₂/ FiO₂hBMSCs治疗后明显改善与他们相比集团()(数据6 (b)和6 (c))。

如图6 (d)没有明显的差异,从小鼠肺组织样本收集处理hBMSCs而未经处理的小鼠。他们组肺泡壁破裂,肺泡空间缩小。此外,多形核白细胞(中性粒细胞)有明显的渗透在气道。管理hBMSCs明显减少烟吸入肺损伤的严重程度。在肺部的老鼠,他们+ hBMSCs集团肺泡空间扩大,减少中性粒细胞浸润,有薄比未经处理的小鼠的肺肺泡隔着他们。这些结果表明,hBMSC异种移植保护小鼠免受伤害与他们有关。

3.7。KGF和肿瘤坏死因子的分析α水平BALF

先前的研究已经报道,msc可以修复ALI-induced受损肺泡液体间隙(AFC)分泌KGF [20.]。我们下一个测量的浓度KGF hBMSCs BALF和文化上层清液。符合几项研究,发现hBMSCs KGF的秘密的文化上层清液。此外,注入hBMSCs后1天,BALF中KGF含量增加而控制和他们组()(图7(一))。

MSC可以下调促炎因子的表达非凡保护宿主免受炎症损伤(18]。我们的研究结果发现与hMSCs全身治疗可以显著降低肿瘤坏死因子的水平α在BALF(图7 (b)),这可能导致下调炎症反应和组织损伤。

4所示。讨论

在中国,阿里烟雾吸入造成的死亡的最常见原因火灾悲剧的受害者。至少有85%的人死于火灾灾害发生因为吸入过多的烟和有毒气体(28]。表现为急性发病,迅速发展,严重的疾病,和高死亡率,严重呼吸道疾病造成烟雾吸入是临床实践中常见29日]。

阿里是一个严重的病理临床表现为呼吸窘迫,难治性低氧血症,noncardiogenic肺水肿。许多因素可以导致阿里的发展;这些包括败血症、肺炎、创伤,胃内容物的愿望,接触大量的烟雾从火灾30.]。烟inhalation-induced阿里独特的病理生理特征,不同引起的败血症、肺炎。组件发现在吸烟,包括颗粒材料,系统性的毒素,和呼吸道刺激,引发一连串的生产在气道粘膜和肺实质炎症介质,导致损伤粘膜衬里,导致支气管旁炎症,最终会导致肺水肿和通气/灌注不匹配(1,3- - - - - -5]。在这个过程中,肺内的白细胞聚集活化后的经典补体级联释放更多的趋化因子和细胞因子,导致气道铸形成和广泛的堵塞。此外,合成诱导一氧化氮(NO)合成酶在呼吸道上皮细胞和肺泡巨噬细胞导致没有生产,从而增加支气管血流,减少缺氧性肺血管收缩在通风不良的地区在肺内,并导致通气/灌注不匹配。还没有形成过氧亚硝基(ONOO⁻)结合超氧化物(中性粒细胞产生的),从而导致DNA损伤和肺泡上皮细胞死亡(4,5]。

与其他因素导致阿里、高效和特定疗法需要烟inhalation-induced阿里。开发这些疗法,还需要更多的研究,因为阿里病理机制仍知之甚少,和当前支持的方法用于治疗条件,包括基本的机械通风,液体复苏,和氧气,不那么有效所需的1,4,6]。不同类型的细胞疗法预计将有能力治愈多种疾病,大大改善目前常规疗法应用于临床[31日]。由于其低表达水平的免疫抗原,msc是一个有吸引力的细胞资源各种复杂、难治性疾病的治疗(32]。临床前研究小型(老鼠和老鼠)和大型(羊)动物模型,以及使用人类肺灌注体外研究,展示了MSC的潜在疗效和安全性管理治疗ALI / ARDS [17- - - - - -20.,33]。在目前的研究中,我们表明,hMSCs产生一种保护作用对小鼠烟inhalation-induced阿里,这表明这些细胞可能为他们提供治疗策略。

尽管最近的兴趣使用成人干细胞疗法由于骨骨髓来源干细胞的多功能特性,发现关于系统的移植过程管理hBMSCs肺损伤模型的变化。大多数研究实验性肺损伤了MSC移植率小于1 - 5% (34- - - - - -36]。在最近的研究中,使用BLI,我们追踪系统的分布动态管理hBMSCs与他们在免疫缺陷小鼠。结果表明,更多的hBMSCs他们小鼠的肺组织中发现了与控制老鼠相比,这一发现类似于先前的研究[21小鼠暴露于创伤或轴承的肿瘤。我们的结果进一步证实,hBMSCs与生俱来的网站流量的炎症,与先前的研究整合MSC本地化模式的创伤,癌症,和辐射后37- - - - - -39]。然而,我们没有发现hBMSC肺移植,这是证明了BLI信号的完全消失在14天后hBMSC管理。这个结果表明,移植的细胞进入肺并不是一个主要驱动力的有利影响。

越来越多的证据表明,msc对肺组织修复的影响并不是由于这些细胞的分化能力,而是他们的保护机制的激活和刺激内源性因素(再生18,40]。msc产生可溶性生物活性因子减少alveolocapillary膜透性,抑制细胞凋亡和纤维化,减少炎症,增强组织修复。亚足联受损(肺泡液体清除)是常见的ALI / ARDS患者并导致肺水肿。bmsc也产生一些上皮生长因子,包括血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)和肝细胞生长因子(HGF)。KGF已经显示出改善肺泡液体运输部分移植aENaC基因表达(41)和Na-K-ATPase活动(42]。因此,KGF肺损伤的决议很重要。在体外实验中,一组Matthay马和学院发现siRNA-mediated抑制KGF表达降低的有利影响msc在受伤恢复亚足联,人类肺灌注大约80% (19]。在当前的研究中,我们发现msc显著减毒烟吸入引起的肺水肿。KGF的旁分泌分泌导致恢复亚足联这项发现可能是一个可能的机制。

msc的免疫调节作用是行之有效的,对炎性损伤和msc施加保护表达下调促炎因子的表达,如IL-1b,引发,干扰素(正)γ和肿瘤坏死因子-α(43]。msc还秘密消炎药如il - 4和il - 10对肺部炎症的发展44),减少中性粒细胞浸润到肺,减少促炎细胞因子的数量在流通,共同维护一个平衡炎症和抗炎反应(45]。我们的研究结果表明,hMSCs可以显著降低肿瘤坏死因子的水平α在BALF注射后1天。相应地,烟雾吸入导致气道炎性细胞浸润,明显减毒的hBMSCs的管理。因此,免疫调节中发挥着重要作用表达下调炎症反应和衰减在他们组织损伤。

总之,我们的研究表明,系统管理主要hBMSCs本地化与他们肺部的老鼠。hBMSCs减毒的烟雾吸入,引起的肺损伤,这可能是由于抗炎的作用,分泌KGF hMSCs但不与细胞的分化潜能。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

前的歌声,气Lv同样对本文亦有贡献。

确认

这项研究部分由中国国家自然科学基金(81202105和81202105)和天津科技项目(15 jcybjc28500, 13 jcqnjc12900 - 2013和14 zcdzsy00033)。作者感谢提供的帮助中国医学科学院和天津医科大学的基础医学院。

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