文摘

化学抗性的发展顺铂方案导致晚期NSCLC患者预后不良。经典之中Wnt信号在肺癌干细胞的调节特性和药物抗性被审问通过访问能力的细胞增殖、迁移、入侵,clonogenicity A549细胞株的凋亡以及有顺铂耐药性A549细胞治疗Wnt5a条件中等或蛋白激酶C (PKC)抑制剂GF109203X。结果表明,经典之中Wnt信号配体,Wnt5a,可以促进增殖,迁移,入侵,在肺腺癌A549细胞集落形成和有顺铂耐药性A549 / DDP细胞和增加的比例ALDH-positive细胞A549 / DDP细胞。细胞的接触Wnt5a导致显著减少A549 / DDP细胞凋亡但不是A549细胞。添加GF109203X可以明显提高基线凋亡和resensitize Wnt5a-inhibited细胞凋亡。有趣的是,一个抑制Wnt / PKC信号通路可以降低肺癌干细胞的特性,促进细胞凋亡,resensitize有顺铂耐药性细胞对顺铂通过半胱天冬酶/ AIF-dependent通路。这些数据从而建议Wnt5a能促进肺癌细胞迁移和顺铂耐药性通过Wnt / PKC信号通路和堵塞信号可能是另一种治疗NSCLC患者抵抗化疗策略。

1。介绍

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。1],其中非小细胞肺癌(NSCLC)占超过80 - 85%的肺癌患者(2,3]。尽管取得了巨大的进步,治疗这种疾病在近二十年来,预后和激进的非小细胞肺癌患者的5年生存率仍差(4,5]。Cisplatin-based化疗一线治疗晚期NSCLC,基于cisplatin-DNA的形成顺序会导致DNA损伤和激活细胞凋亡信号通路在细胞6]。然而,顺铂耐药性的发展导致失败和不良预后与化疗方案治疗非小细胞肺癌患者。然而,潜在的药物抗性的机制目前不完全理解;因此需要阐明顺铂耐药性的分子机制基础为了开发有效的治疗药物和/或治疗NSCLC的策略。

Wnt通路发育信号,调节各种细胞过程中发挥基础作用,包括细胞增殖、存活、迁移和极性,细胞命运规范和干细胞自我更新(7]。除了他们的角色在发展,组织再生,和体内平衡,特异表达Wnt信号也有助于肿瘤发生和复发,以及一个增强的癌症干细胞的潜力(二者)和抵抗抗癌疗法在许多类型的癌症,包括肺癌(8]。基于依赖的关键中介连环蛋白,Wnt信号通路可以再细分标准(-catenin-dependent)通路和经典之中(-catenin-independent)信号通路9]。规范化Wnt /连环蛋白信号是一个最好的途径,和经典之中Wnt通路至少包括平面细胞极性(PCP)通路和Wnt /钙通道(10]。在这种背景下,Wnt3a和Wnt5a代表Wnt配体激活规范Wnt信号和经典之中Wnt信号途径,分别是(10]。在Wnt /钙通道,Wnt受体的配体结合/ coreceptor (s)通过钙浓度的增加导致了蛋白激酶C (PKC);增加细胞内钙还可以激活钙调磷酸酶和calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CaMKII)。钙调磷酸酶可以干扰TCF /连环蛋白在Wnt信号/连环蛋白通路的活化转化生长因子beta-activated激酶1 (TAK1)和nemo-like激酶(NLK)。另一方面,CaMKII能够诱导激活转录因子核转录因子的激活t细胞(NFAT),该功能调节细胞粘附和迁移10]。

与致癌作用的异常激活Wnt /连环蛋白信号,建立在许多癌症,肿瘤发生的生物功能的经典之中Wnt信号远的特点。在这方面,经典之中Wnt信号可以是一个肿瘤抑制或激活肿瘤根据癌症类型(11]。例如,Wnt7a和Frizzled-9——(Fzd9)介导的经典之中Wnt信号显示抗癌活性(12- - - - - -14),但对乳腺癌[Wnt5a表现出矛盾的影响14]。然而,更多的研究表明,经典之中Wnt信号激活,如Wnt5a-mediated信号,在许多上皮异常增强的癌症,包括肺癌(15],乳腺癌[16],卵巢癌[17,18),和胃癌19]。关于Wnt5a信号,它已被证实能促进癌细胞迁移和入侵20.),epithelial-mesenchymal过渡(EMT) [18),和转移(17,21,22),以及提高癌症干细胞具备干细胞(二者)和药物抗性(21]。关于药物抗性,Wnt5a被建议作为一种生物标志物的临床疗效不佳的卵巢癌患者和药物抗性的中介17]。机械化,Wnt5a可以调节腺苷磁带,亚B (ABCB1、P-gp和凋亡)耐多药通过激活肿瘤细胞的表达中的蛋白激酶A (PKA) /连环蛋白通路(22]。肺,Wnt5a被发现与烟吸烟引起的肺癌致癌机制的激活PKC / Akt通路(23),Wnt5a抑制肺癌细胞凋亡(14]。因此,经典之中Wnt信号,如Wnt5a,被认为是潜在的治疗目标在癌症24,25]。

鉴于上述发现,我们因此猜测Wnt5a-mediated不在经典里的Wnt信号通路可能发挥监管作用在非小细胞肺癌细胞的药物抗性。结果提出了报告显示,Wnt5a能够增加乙醛脱氢酶(ALDH)的具备干细胞阳性肺癌干细胞细胞增殖能力增强,迁移,入侵,集落形成和抑制细胞凋亡在肺腺癌A549细胞和有顺铂耐药性A549 / DDP细胞。重要的是,Wnt5a /钙/ PKC途径的抑制PKC抑制剂显示细胞凋亡有顺铂耐药性增加肺癌A549 / DDP细胞。我们因此确定Wnt5a / PKC信号通路在NSCLC细胞负责顺铂耐药性。

2。材料和方法

2.1。细胞系和Wnt5a条件培养基

人类腺癌细胞系A549 ccl(写明ATCC # - 185), Wnt5a生产细胞株,L Wnt5a (overexpressing鼠标Wnt5a,写明ATCC # crl - 2814),及其控制L细胞系(写明ATCC # crl - 2648)从美国购买类型文化集合(写明ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。A549 / DDP细胞,对顺铂耐药,从银行购买的癌症细胞系的中国医学科学院(中国,北京)及其耐药表型是维持在一个中等包含10 nM顺铂(开曼化学公司,威明顿,德,美国)。PKC抑制剂(GF109203X)购买的恩佐生物化学(美国纽约)。顺铂和GF109203X的最终浓度为2.5μ在这项研究中。细胞培养和维持在37°C调湿1640年大气中5%的二氧化碳和95%的空气介质(美国纽约Gibco,大岛)补充10%胎牛血清(的边后卫)和1%笔/喉炎的症状。Wnt5a和控制L细胞增长到80% - -90%与1640/5%刷新的边后卫,培养更多12 h。培养基被收集并用于制备Wnt5a-conditioned介质(Wnt5a-CM)和控制介质(Control-CM),分别为(26]。由于转化细胞系在体外在这项研究中,知情同意并不是必需的,也没有一个民族问题。

2.2。细胞增殖实验

细胞增殖是由使用细胞计数工具包(CCK) (Bio-Rad实验室,Inc .)、欧文、钙、美国)。A549或A549 / DDP细胞分裂和播种密度的96孔板每口井和对待Wnt5a-CM Wnt5a-CM + GF109203X (PKC抑制剂),Control-CM或Control-CM + GF109203X 12 h与顺铂治疗之前额外的24小时。细胞被用于CCK化验。

2.3。流式细胞术测定细胞凋亡分析

细胞培养在不同条件媒体前12 h与顺铂治疗24小时之前被用于分析。流式细胞术测定、细胞分离和标记使用膜联蛋白V-FITC / propidium碘(PI)细胞凋亡检测设备(美国BD Pharmingen)制造商的指令。凋亡和坏死细胞被量化使用流式细胞分析仪(美国BD FACSCalibur,圣何塞,CA)和细胞追求软件。至少10000个细胞对每个样本进行了分析。细胞为阴性膜联蛋白V和π被认为是可行的。细胞被膜联蛋白V + /π−表明早期细胞凋亡,而膜联蛋白V + / PI +细胞被认为是细胞凋亡和坏死的细胞群。

2.4。细胞划痕实验

划痕试验是用于访问细胞迁移能力。细胞对不同条件下12 h 6-well文化板块。细胞与200年被挠μL吸管技巧。合成的细胞被洗了prewarmed PBS了三遍。然后受伤的单层细胞治疗为额外的24小时不同的实验条件。关闭受伤的地区在显微镜下观察20 x放大(德国徕卡)和拍照。闭包是量化和计算面积的百分比与职业+ 6 (IPP6)图像处理程序。这些实验进行了一式三份。每个条件进行重复,每个实验至少重复三次(27]。

2.5。Transwell化验

入侵检测进行transwell迁移钱伯斯(美国BD生物科学)。过滤器(8μ米孔)被涂上一层100μL基底膜基质(美国BD生物科学)被稀释1:1640浓度用无血清培养基,孵化37°C 5%二氧化碳气氛为胶凝30分钟。细胞在100年μL培养基被播种的室,和一个700年μL条件中添加在下院。有条件的媒体包括Control-CM、Wnt5a-CM Control-CM + GF109203X, Wnt5a-CM + GF109203X。细胞被播种在2×10⁴100年μL媒体/心房,在37°C的环境大气二氧化碳5% 12 h。去除介质和使用precold PBS洗两次。修复细胞4%的多聚甲醛20分钟,结晶紫染色和1% 20分钟后固定剂被和PBS的细胞被洗两次27]。

2.6。单独分析

一个单独试验被用于访问具备干细胞A549和A549 / DDP细胞。1000年进行单独分析,单个细胞悬液细胞治疗Wnt5a-CM或Control-CM有或没有Wnt5a-CM + PKC抑制剂(GF109203X)种子6-well板。细胞连续培养10天的点心Wnt5a-CM或者Wnt5a培养基+ GF109203X 3天的间隔。菌落计数,介质被和PBS的细胞被冲洗之前在室温下与4%多聚甲醛固定为5分钟。删除固定解决方案后,细胞被沾0.5%结晶紫溶液,在室温下孵化了30分钟。被小心翼翼地染色的解决方案是,细胞与水冲洗,去除残余染色溶液在室温下用电吹风板之前一天。殖民地的数量从三个6-wells统计和计算在光学显微镜下,用作clonogenicity索引。每个条件进行重复,每个实验重复三次(27]。

2.7。免疫印迹(西方墨点法)分析

完整的细胞提取物是由均质化细胞裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,5毫米EDTA, 150毫米氯化钠,和0.5% NP-40) 60分钟在冰上。溶菌产物被离心机在12000 g×10分钟在4°C,和上层清液收集完整的细胞提取物。细胞提取物(70μg)解决在10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(SDS - page)和前转移到PVDF膜(美国微孔,Billerica的)。膜被阻塞在PBS包含4%的脱脂奶粉0.2% Tween-20和探索使用兔子anti-Wnt5a, Phospho-PKC, CaMKII (pan)抗体(手机信号技术,美国),兔子anti-Bcl2,半胱天冬酶3,伯灵顿,beta-actin抗体(Proteintech,武汉,中国),和兔子anti-AIF(细胞凋亡诱导因子)(武汉博士德,中国)。这些墨迹开发使用增强化学发光(ECL)试剂(Advansta,门洛帕克,CA,美国)后孵化与适当的过氧化物酶标记二次抗体。蛋白表达的水平被光学微semiquantified使用ImageJ软件版本1.46 (https://rsb.info.nih.gov/ij/)。每个样品的净强度的比率除以β肌动蛋白内部控制计算密度测量任意单元(AU)这是作为一个索引的相对利益表达的蛋白质(28,29日]。

2.8。ALDEFLUOR化验

为了访问乙醛脱氢酶(ALDH)阳性细胞的比例,ALDEFLUOR工具包的干细胞技术有限公司(加拿大温哥华)是使用/制造商的协议。总之,细胞治疗表示条件被安置在血细胞计数管包含适当的ALDEFLUOR缓冲区和ALDH衬底,bodipy-aminoacetaldehyde(字样),和在黑暗中孵化了45分钟37°C。酶抑制剂N, N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB)作为消极的控制,从而导致废除ALDH-positive细胞的荧光信号,并被用来补偿流式细胞仪信号(FACSCalibur BD生物科学)。流式细胞术分析进行FACScan流式细胞分析仪(BD生物科学)。分析ALDH-positive细胞,DEAB-treated样本作为消极的控制和ALDH活动存在DEAB被认为是一个基准。数据分析使用FlowJo软件(亚什兰卡温顿,肯塔基州,美国)。

2.9。统计分析

本研究中收集的所有数据是来自每个条件至少三个独立的实验。SPSS17.0分析软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)和棱镜5(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)是用于统计分析。统计数据的评估是由单向方差分析时多与一个单一的控制和两组进行比较t以及比较两组之间的差异。被分配到重要的差异值< 0.05和< 0.01用和,分别。数据提出了均值±标准差(SD)。

3所示。结果

3.1。Wnt5a提高肺癌细胞的特点和能动性

引人注目的研究显示,Wnt5a是正常的增殖的监管机构和许多癌症细胞类型30.,31日]。为了访问的潜在影响Wnt5a转移性肺癌细胞的特性,它对扩散的影响,迁移,并在肺腺癌A549细胞入侵和有顺铂耐药性A549 / DDP细胞被检查的CCK测定细胞生存能力,刮伤愈合细胞迁移试验,transwell测定细胞入侵。正如所料,A549细胞A549 / DDP细胞暴露于Wnt5a条件培养基(Wnt5a-CM)显示增加细胞增殖与那些培养Control-CM相比,无论顺铂(图的存在1)。相比之下,除了Wnt /钙/ PKC抑制剂GF109203X显示信号的抑制A549细胞增殖(图1(一))。有趣的是,Wnt5a-induced也可以抑制细胞增殖的添加GF109203X A549细胞,也不管顺铂(图的存在1(一))。然而,GF109203X没有影响A549 / DDP细胞增殖(图1 (b))。这个结果可能表明Wnt5a-mediated A549细胞细胞增殖而不是A549 / DDP细胞是通过Wnt5a / PKC途径在A549细胞,这意味着Wnt5a可以诱导肺癌细胞增殖cell-context依赖的方式。

同样归纳Wnt5a也观察到细胞迁移的影响(图2)和入侵(图3),由各自的划痕和transwell化验,Wnt5a显示的能力,促进细胞迁移(图2)和入侵(图3在A549细胞(数据)2(一个)和3(一个)(数据)和A549 /民进党细胞2 (b),2 (c),3 (b))()。值得注意的是,Wnt5a也表现出能力促进A549 / DDP细胞迁移在顺铂的存在(图2 (c))()。一致,PKC信号传导抑制剂GF109203X独自没有影响在A549和A549 / DDP细胞迁移,但是它可以有效地抑制A549的Wnt5a-mediated细胞迁移和A549 / DDP细胞在所有测试条件()(数据2(一个),2 (b),2 (c))。此外,Wnt5a还表现出促进细胞入侵的能力在这些肺细胞中观察到transwell试验()(图3),添加GF109203X抑制细胞入侵A549 / DDP细胞(图3 (b)(图),但不是在A549细胞3(一个)),部分显著更高的基线入侵能力A549 / DDP细胞相对于父A549细胞(图3和数据未显示)。同样值得关注,PKC抑制剂GF109203X几乎可以完全抑制Wnt5a-induced细胞A549细胞入侵和A549 / DDP细胞()(图3)。

3.2。单独使用Wnt5a提高肺癌细胞的能力

集落形成能力是癌症干细胞的标志(二者)。Wnt信号已被广泛认可,在CSC扮演关键角色自我更新,增殖,分化8,32,33]。为了探索Wnt5a-activated Wnt / PKC信号是否影响肺癌细胞的特点,A549的集落形成能力和A549 / DDP细胞是评估一个单独试验。曝光的A549细胞A549 / DDP细胞Wnt5a-CM导致明显增强集落形成能力与细胞培养相比Control-CM ()(图4)。相比之下,Wnt5a-induced clonogenicity可以显著抑制PKC抑制剂的添加GF109203X A549和A549 / DDP细胞()(图4),这意味着Wnt5a能够提高肺癌干细胞的潜能激活Wnt5a / PKC途径。此外,ALDEFLUOR化验显示分数高(> 90%)的ALDH-expressing有顺铂耐药性细胞,细胞和细胞培养在Wnt5a-CM ALDH细胞频率略有增加但无统计差异是观察与Control-CM相比(图5(一个))。感兴趣的,一个抑制PKC信号由GF109203X导致显著降低ALDH-positive分数A549-DDP细胞()(图5 (b)),这意味着Wnt5a / PKC信号具备干细胞可能参与了肺癌干细胞。

3.3。在肺癌细胞Wnt5a激活PKC信号

一些证据表明,Wnt / PKC信号通路被激活在某些异常的癌症类型,Wnt5a可能激活这个信号和负责转移和化学抗性的癌症通过激活Wnt /β-cateinin信号(34- - - - - -37]。以上在体外研究已经清楚地表明,PKC抑制剂GF109203X能充分抑制Wnt5a-induced细胞迁移、入侵和clonogenicity A549肺癌细胞A549 / DDP,暗示Wnt5a能促进肺癌细胞流动性Wnt / PKC中的通路的激活。免疫印迹分析表明Wnt5a可能增加磷酸化PCK的表达(phos-PKC), CaMKII和NFB在Wnt / PKC信号级联,PKC抑制剂GF109203X phos-PKC的表达减少,CaMKII和NFB在A549(数字6(一)和6(b))和肺癌A549 / DDP细胞(数字6(c)和6(d))。

这一结果进一步证实Wnt5a促进肺癌细胞转移/ PCK Wnt信号通路的激活。

3.4。影响Wnt / PKC信号在肺癌细胞的凋亡与顺铂耐药性

由于Wnt5a涉及几个上皮癌细胞的药物抗性,我们接下来试图调查Wnt5a / PKC信号的影响在肺癌细胞的细胞凋亡和顺铂耐药性。流仪分析的结果表明,Wnt5a和PCK抑制剂GF109203X对A549细胞凋亡(图没有影响7(一))。然而,PCK抑制剂GF109203X可以显著促进细胞A549细胞凋亡在顺铂的存在,细胞和一个接触Wnt5a导致显著降低cisplatin-induced细胞凋亡()(图7(一))。有趣的是,Wnt5a展出一个细胞凋亡的抑制作用有顺铂耐药性A549 / DDP细胞,无论顺铂()(图7 (b))。抑制Wnt / PKC信号通过GF109203X可以显著提高cisplatin-induced细胞凋亡在A549 / DDP细胞,但只有适度增长的观察凋亡细胞在有顺铂耐药性细胞PKC抑制剂没有顺铂处理(图7 (b))。重要的是,PKC inhibitor-mediated增加可以减少细胞凋亡的存在Wnt5a-CM A549 / DDP细胞(图7 (b))。免疫印迹试验进一步确定Wnt5a-inhibited凋亡和GF109203X-mediated增加细胞凋亡的减少和表达增加有关伯灵顿proapoptotic蛋白质、半胱天冬酶3和凋亡诱导因子(AIF)在肺癌细胞,分别(图8)。这些结果符合函数Wnt5a报道的其他人类癌症类型,包括鼻咽癌(NPC) [21和胰腺癌30.),建议针对Wnt / PKC信号可以resensitize有顺铂耐药性肺癌细胞化疗方案在临床的设置。

4所示。讨论

Wnt信号通路的责任人,尤其是规范化Wnt通路在癌症发展和进展,已经确立,Wnt /β连环蛋白信号主要具有致癌作用在癌症发展,转移,治疗抗性(7,8,14,33,39]。然而,最近的研究结果还指出,经典之中Wnt信号通路,比如Wnt5a-mediated不在经典里的信号,也可能成为致癌基因或肿瘤抑制癌细胞泛型类型的方式40,41]。在肺癌,异常表达和/或变更的Wnt信号组件也观察到50%的人类非小细胞肺癌细胞系和肺癌切除样本(42],Wnt信号与增加的扩散和转移性肺癌细胞的性质,预后不良,抵抗常规化疗和靶向治疗在肺癌患者14,33,43- - - - - -45]。感兴趣的,经典之中Wnt信号和癌症特异表达的含义与类型相关的致癌或肿瘤抑制Wnt信号在肿瘤发生中的作用最近引发的越来越多的关注转移和治疗肺癌的抗性14,22,23,25,31日,36,45- - - - - -47]。

在目前的研究中,所扮演的角色Wnt5a-mediated不在经典里的信号调节的特点,具备干细胞,顺铂耐药性在肺腺癌A549和有顺铂耐药性A549细胞检查在体外。结果表明Wnt5a可以增强扩散的能力,迁移,入侵和集落形成,但降低肺癌细胞的细胞凋亡,通过激活Wnt /钙/ PKC信号通路。重要的是,PKC抑制剂GF109203X可以减少一部分ALDH-positive肺癌干细胞细胞A549 /民进党和扭转Wnt5a-inhibited细胞A549细胞凋亡。此外,GF109203X显著诱导Wnt5a-inhibited细胞凋亡在有顺铂耐药性细胞至少部分通过半胱天冬酶/ AIF-dependent通路。这些结果被斯图尔特[同意一项研究14],作者还发现,多个Wnt配体、受体,和其他关键部件,包括Wnt-1 Wnt-2, Wnt-3,和Wnt-5a Frizzled-8和Wnt通路的组件,使头发凌乱,豪猪,TCF-4高架在NSCLC组织中(14]。这样一个激活Wnt信号与非小细胞肺癌预后不良有关。Wnt-7a,相反,他们还发现另一个不在经典里的配体,起到了在非小细胞肺癌的肿瘤抑制作用,从而抑制非小细胞肺癌发展和往往是表达下调在这种类型的癌症14]。与我们的研究结果,这些研究提出Wnt信号的复杂角色,特别是在非小细胞肺癌中的Wnt信号。因此这些数据还表明,Wnt / PKC信号通路可能是小说发展的目标治疗肺二者和逆转顺铂耐药性在肺癌细胞(17,18,21,23,25,46- - - - - -48]。

异常激活规范和经典之中Wnt信号已经被证明可以促进肺癌的肿瘤发生,特别是在非小细胞肺癌(14,49]。虽然不在经典里的Wnt信号被发现抑制规范化途径在某些类型的非小细胞肺癌如鳞状细胞癌,这样一个表达下调规范Wnt信号并不是与改善预后,但导致减少细胞粘附和EMT的潜力增加43]。这些结果表明,经典之中Wnt信号能够增加转移,作为关键的潜在生物标志物的诊断和预后,以及治疗的目标发展新颖和有效的治疗在肺癌14,23,45,50]。在这方面,Wnt5a是代表配体激活经典之中Wnt信号调控细胞迁移和极性在胚胎形态发生过程中,通常在成人组织中表达下调。然而,组成型表达或增加Wnt5a及其受体的表达Ror2参与增强许多癌症的侵袭性和转移性属性类型,建议一个致癌Wnt5a / Ror2信号在肿瘤发生中的作用[17,21,40,51- - - - - -54]。在癌症,除了其致癌作用Wnt5a也已经发现抑制Wnt /规范β连环蛋白信号Ror2-dependent的方式,在一些癌症肿瘤抑制作用,如结直肠癌(CRC) (55),甲状腺癌(56],以及也许乳腺癌[34,36,57]。对其抗肿瘤活性,Wnt5a能够抑制肿瘤浸润和转移的得罪Wnt /β连环蛋白信号通路,诱导退化β连环蛋白(32]。例如,Wnt5a经常沉默是因为crc的启动子甲基化。一个执行表达式Wnt5a导致退化β连环蛋白和降低的细胞周期蛋白D1和集落形成能力的表达,表明Wnt5a充当了CRC通过抑制肿瘤抑制作用规范化Wnt信号通路(55]。然而,矛盾的影响Wnt5a在乳腺癌,已报告的损失Wnt5a表达式与high-histological年级,high-mitotic指数,和消极的雌激素和孕激素受体的表达在乳腺癌的浸润性导管57]。然而,另一份报告发现,Wnt5a可能诱发肿瘤细胞的侵袭性和生产矩阵metalloproteinase-7 (MMP7)和肿瘤坏死因子-(肿瘤坏死因子-在巨噬细胞),这是必不可少的macrophage-induced侵袭性乳腺癌(58]。然而,更多的证据表明,激活Wnt5a-mediated信号与恶性许多癌症类型的能力,表现出矛盾的致瘤性的影响,耐治疗代理和/或转移癌细胞泛型类型的方式(47,51,53]。对于肺癌,Wnt5a表现出促进细胞迁移和入侵的能力在体外和转移在活的有机体内,这是许多癌症类型的恶性特征显著相关(23,51,53,59]。始终与先前的研究结果,我们也证明了Wnt5a可以提高肺癌细胞的迁移和具备干细胞,包括迁移、入侵、集落形成,和药物抗性,通过Wnt / PKC途径。

事实上,早期的微阵列分析基因表达分析表明,Wnt5a可以直接促进黑色素瘤细胞入侵和能动性通过蛞蝓的诱导表达,进而促进EMT PKC-dependent方式基因表达(60,61年]。这样一个Wnt5a / PKC-promoted EMT还发现在卵巢上皮癌(18)和口腔鳞状细胞癌(OSCC) [20.]。在卵巢癌上皮,Wnt5a和PKC的表达增加α与转移密切相关的疾病,和PKCα抑制剂能降低转移能力(18];在OSCC Wnt5a被发现通过激活促进癌细胞的迁移和入侵的经典之中Wnt /钙/ PKC途径(20.]。此外,最近的高通量基因表达分析进一步表明,Wnt5a信号调节高转移性鼻咽癌(NPC)细胞和组织,在其中Wnt5a能够激活PKC信号,形成一个积极Wnt5a和磷酸化PKC循环促进NPC细胞具备干细胞的特征,导致一个增强转移特性和致瘤性在体外和在活的有机体内(21]。在肺癌、皮鞭等人还发现,暴露人类支气管上皮细胞(HBE)细胞烟冷凝物显示激活Wnt5a / PKC / Akt信号和增加细胞增殖和clonogenicity。Wnt5a的高表达在肿瘤组织的吸烟者还发现相对于正常组织。堵塞Wnt5a / PKC导致显著降低细胞生存和clonogenicity,以及细胞凋亡增加通过Bcl2和差别,对这些基因的诱导裂解poly-ADP-ribose聚合酶(23]。此外,Wnt5a转录是基于多种机制,包括等级、刺猬、TGFβ和NF -κB信号级联(62年]。同意这些发现,我们的结果也表明Wnt5a / PKC-mediated caspase-dependent细胞凋亡信号通路和NF -κB信号级联参与转移潜力,具备干细胞和药物抗性A549和有顺铂耐药性A549 / DDP NSCLC细胞。重要性的抑制PKC信号ALDH-expressing GF109203X导致显著降低分数的细胞A549 / DDP细胞顺铂的存在。ALDH已经公认的癌症干细胞标记在多种癌症类型,包括肺癌(63年- - - - - -68年]。这一发现意味着针对PKC途径可能逆转药物抗性部分具备干细胞通过减少CSC在肺癌细胞。

除了Wnt信号的致癌作用在癌症转移和入侵,Wnt信号通路的失调,特别是规范化Wnt通路,被证实为治疗抗性在许多癌症类型(31日,37,44,69年- - - - - -72年]。在这方面,Wnt5a也发现调节细胞周期进展,有助于药物抗性在胰腺癌细胞(70年种代号为ABCB1的)和调节表达在耐多药乳腺癌细胞的激活经典之中PKA /β-连环蛋白通路(48]。在非小细胞肺癌细胞,激活Wnt通路之前证明与电阻以铂为基础的化疗(37,50,73年]。有顺铂耐药性NSCLC细胞Wnt通路基因的表达增加。这些细胞的接触Wnt抑制剂导致抑制细胞增殖和敏化非小细胞肺癌细胞化学治疗剂多西他赛(74年)、顺铂(75年),以及一个Wnt信号目标基因的表达下调表达。在这项研究中,我们表明,堵塞的Wnt / PKC信号可能会增加基线细胞凋亡和cisplatin-induced细胞凋亡在非小细胞肺癌A549细胞和有顺铂耐药性A549 / DDP细胞,这表明针对Wnt / PKC不在经典里的Wnt信号可能是一个潜在的治疗策略来规避在治疗肺癌药物抗性。

5。结论

总之,在目前的研究中,我们审查的潜在Wnt5a-mediated不在经典里的Wnt信号在非小细胞肺癌细胞的迁移和药物抗性和肺二者具备干细胞。结果表明Wnt5a能促进增殖、迁移,入侵和集落形成,以及抑制细胞凋亡在A549和有顺铂耐药性A549 / DDP NSCLC细胞。此外,堵塞Wnt5a信号通过GF109203X PKC抑制剂可以明显减少流动性,增加基准细胞凋亡和cisplatin-induced A549和A549 / DDP细胞凋亡和反向Wnt5a在细胞凋亡的抑制作用。机械化,Wnt5a Wnt5a /激活PKC信号级联,导致激活内质网(ER)释放Ca^{2 +}、PKC和CaMKII,进而激活NFκB,随后具备干细胞促进和抑制细胞凋亡在非小细胞肺癌细胞(图9)。本研究因此表明Wnt5a / PKC信号可能转移中发挥重要作用,药物抗性,和肺二者具备干细胞,这可能提供新线索理解经典之中Wnt信号的关键作用在肺部致癌作用和治疗抗性。

缩写

ABCB:	磷酸腺苷磁带,亚B
ALDH:	醛脱氢酶
字样:	Bodipy-aminoacetaldehyde
CaMKII:	Calmodulin-dependent蛋白激酶2
CSC:	癌症干细胞
DEAB:	N, N-Diethylaminobenzaldehyde
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
NLK:	Nemo-like激酶
NFAT:	核转录因子激活的t细胞
非小细胞肺癌:	非小细胞肺癌
卡式肺囊虫肺炎:	平面细胞极性
PKC:	蛋白激酶C
TAK1:	转化生长因子beta-activated激酶1。

信息披露

作者仅负责的内容和写作本文。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

刘锦溪他和小明的构思和设计实验;秦文君杨Kangjian张,小君魏分析数据和起草的手稿;秦文君杨Kangjian张静雪君,Jing,胡安·史Yongzhao朱、陈和胡安进行实验,获得数据;秦文君杨、锦西他和小明刘解释数据和批判性的修订手稿。所有作者阅读和批准了最终版本的手稿。秦文君杨和Kangjian张同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作是宁夏自然科学基金的赠款支持NZ15277锦溪他和NZ16155秦文君杨,开始从宁夏医科大学授予(XM2015090)特征,并从中国的国家自然科学基金资助(31472191)小明刘。