文摘

基质细胞和最近证实间充质干细胞,OP9细胞支持造血干细胞(HSC)到B淋巴细胞谱系分化,然而Delta-like-1 (DL1) overexpressing OP9 (OP9DL1)细胞促进HSC早期T淋巴细胞的发展。然而,OP9的免疫调节能力或OP9DL1成熟B细胞和T细胞增殖尚未阐明。在这里,我们表明,OP9和OP9DL1有相似的扩散能力和immunophenotypes除了DL1表达式。与OP9相比,OP9DL1显示骨生成,减少脂肪生成在各自的诱导培养基培养。OP9和OP9DL1抑制成熟B细胞和T细胞增殖。此外,OP9显示更强的抑制B细胞增殖和OP9DL1表现出更强的抑制T细胞增殖。刺激,OP9和OP9DL1显示增加硝酸氧化(NO)生产。的没有OP9水平高于OP9DL1与肿瘤坏死因子刺激时α/干扰素γ或有限合伙人/ IL4。综上所述,我们的研究揭示了一个以前从未发现过的角色OP9和OP9DL1成熟B细胞和T细胞增殖。DL1过度单独改变的属性OP9细胞除了在B细胞早期发育中的作用。

1。介绍

淋巴细胞谱系分化和发展的过程,从造血干细胞深受可溶性因子和细胞contact-dependent信号在特定的微环境,支持特定的细胞谱系的发展。骨髓(BM)微环境支持B细胞,但不是T细胞,淋巴细胞增殖1),而胸腺T淋巴细胞早期发育所需环境(2]。在体外,一些BM-derived基质细胞系已应用于多个造血细胞谱系的形成。这样一个细胞系,OP9基质细胞,发现支持多个血统的发展,如B细胞、红细胞、粒细胞(3- - - - - -5];然而,试图从肝星状细胞产生T细胞在体外在没有胸腺微环境的努力均告失败。诺已知信号通路影响多种细胞谱系的发展过程(6- - - - - -8]。逆转录病毒转导OP9细胞系时表达切口配体Delta-like-1(即OP9DL1细胞株),它强烈促进T细胞谱系承诺和发展和抑制B细胞淋巴细胞增殖在体外(9]。

OP9细胞系研究表明OP9真正的间充质干细胞(msc)有多种分化能力和免疫调节能力(10]。msc多功能干细胞能够分化成多种细胞类型,包括成骨细胞和脂肪细胞,也可以调节免疫细胞反应(11,12]。最近,一个证据13- - - - - -17)表明,msc产生各种细胞因子如一氧化氮(NO)和铂族元素2显示的免疫调节特性通过抑制增殖和功能的几个主要类型的免疫细胞,包括自然杀伤细胞、树突状细胞、T和B淋巴细胞(18- - - - - -20.]。然而,潜在的MSC免疫调节机制尚未完全阐明。

迄今为止,研究OP9或OP9DL1对T细胞和B细胞的影响主要集中在家族承诺、分化、和功能(7,21,22]。然而,鉴于msc的免疫调节特性,OP9的角色或OP9DL1成熟的T细胞和B细胞增殖并没有被调查,这可能是高度有不良影响的考虑的可能应用OP9或OP9DL1 T和B淋巴细胞体外再生和扩张。

在这项研究中,我们的研究结果提供了洞察的作用Delta-like-1 OP9 (DL1)的性质。除了不同的角色在促进B或T细胞的发展,OP9和OP9DL1显示不同的能力在抑制成熟B或T细胞增殖。

2。材料和方法

2.1。动物

C57BL / 6小鼠从实验动物中心,购买基本医疗科学研究所,北京,中国。老鼠被维护在一个无菌屏障设施,和所有实验进行按照基本医疗科学研究所实验动物指南。

2.2。细胞

OP9细胞和Delta-like-1 overexpressing OP9 (OP9DL1)细胞系的礼物教授刘必应的中国人民解放军307医院(10)和α最低基本培养基培养(αmem Gibco) 4毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100 U /毫升、和20%胎牛血清(的边后卫)在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C。从股骨和胫骨骨髓细胞,冲洗2 ~质询的老鼠,被40过滤μm细胞过滤器,随后被BD制药溶解去除红细胞。CD34+细胞被选择从骨髓单核细胞CD34+MicroBead工具包(Miltenyi研究)和孵化一起OP9和OPDL1比1:10 (OP9或OP9DL1: CD34+细胞)αmem和5 ng / mL Flt3L 5 ng / mL IL-7,和20%的边后卫。周边T细胞和B细胞分离与CD3小鼠脾脏εMicroBead工具包(Miltenyi研究)或B220 MicroBead工具包(Miltenyi研究),分别。接下来,这些细胞被激活与1640年媒体包含20%的边后卫在不同的刺激器(T细胞:PMA (50 ng / mL) /离子(1μg / mL);B细胞:IL4 (25 ng / mL) /有限合伙人(10μg / mL)) 24 h,然后培养单独或连同OP9或OP9DL1细胞在不同比率36 h。

2.3。细胞增殖实验

细胞增殖是衡量BrdU合并和Ki67化验。为BrdU合并,细胞(1×105在6-well板/)被播种,10毫米BrdU (BD)添加和孵化了3小时,然后根据细胞收集和处理BrdU流的协议套件(美国圣地亚哥BD Pharmingen CA)。Ki67测定、细胞(1×1056-well板/)被播种,2天后细胞收获,并根据协议Ki67的细胞增殖工具包(Miltenyi研究公司,奥本,CA,美国)。流式细胞仪数据采集第二章(BD)和FlowJo软件(TreeStar)进行了分析。

2.4。CFSE染色

外围CD3+T或B220+B细胞被标以5μM羧基荧光素二醋酸盐succinimidyl酯(CFSE英杰公司)在4°C 7分钟。标签是根据制造商的协议终止。洗后,细胞被激活与刺激因素如前所述24 h然后用OP9或OP9DL1培养。细胞分裂,所显示的荧光强度的降低,通过流式细胞术分析。

2.5。流式细胞术

抗体anti-mouse CD29 (BD Pharmingen)、CD31 (BioLegend) CD34 (BD Pharmingen), CD44 (BD Pharmingen)、CD105 (BioLegend)、CD45 (BD Pharmingen) Sca-l (BioLegend) DL1 (BD Pharmingen) B220 (BD Pharmingen)和CD3 (BD Pharmingen)被用于这项研究。Ki67工具包是Miltenyi研究有限公司(奥本、钙、美国)和BrdU流工具包是BD Pharmingen(美国圣地亚哥,CA)。流式细胞仪数据采集第二章(BD)和FlowJo软件(TreeStar)进行了分析。

2.6。在体外分化

为在体外分化,细胞包含0.1毫米地塞米松诱导成骨的感应媒体,50毫米ascorbate-2磷酸盐,10毫米甘油磷酸酯(σ)。诱导脂肪形成的分化,细胞培养的脂肪形成的包含1毫米地塞米松诱导媒体,吲哚美辛200毫米,0.5毫米3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 10μg / mL胰岛素(σ)。碱性磷酸酶(ALP)测定和油红O染色进行如前所述。

2.7。检测不

OP9与TNF和OP9DL1刺激α/正γ有限合伙人/ IL4或PMA /离子6、12和24小时。没有检测到文化上层清液使用修改后的格里斯试剂(Sigma-Aldrich)。简而言之,所有没有3转换成没有2通过硝酸还原酶和总没有2发现了格里斯反应。

2.8。实时聚合酶链反应

总RNA提取试剂盒(σ)和反向转录成cDNA逆转录酶工具包(豆类)。互补脱氧核糖核酸作为模板使用实时PCR与TOYOBO SYBR绿色试剂(上海,中国)来确定特定的基因表达。引物序列如下:β肌动蛋白:CTTCCGCCTTAATACTTC(向前)和AAGCCTTCATACATCAAG(反向);EBF1: ATGAAGAGGTTGGATTCTG(向前)和GCAGTTATTGTGTGATTC C(反向);GATA3: CTGTCAGACCACCACCAC(向前)和CACACTCATTGATGTCAACC(反向)。

2.9。统计分析

数据是平均数±标准差。统计学意义被未配对的双尾学生的评估 以及。

3所示。结果

3.1。Immunophenotypes OP9的扩散性能和OP9DL1

它已经证明了OP9细胞系是真正的msc (10]。检查是否OP9细胞overexpressing DL1显示不同immunophenotype比传统OP9细胞,我们分析了表面标记显示在图1(一)。流仪数据显示DL1 OP9DL1细胞中的表达明显高于OP9细胞。MSC表面分子包括CD29、CD44和Sca-l阳性OP9和OP9DL1细胞,而MSC表面分子CD105、CD34造血谱系标记和CD45和内皮细胞标记CD31几乎缺席OP9和OP9DL1细胞系。接下来,我们检查OP9的扩散能力和OP9DL1 Ki67 BrdU标记分析,分别。增长率OP9和OP9DL1之间没有显著差异(数字1 (b)和1 (c))。

(一)
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(c)
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图1
对比OP9 OP9DL1细胞对immunophenotype和扩散。(一)表示OP9或OP9DL1细胞的表面标记显示通过流式细胞仪分析,分别。((b) - (c))的增长率OP9 OP9DL1细胞被Ki67或BrdU公司化验,化验。
3.2。不同的OP9和OP9DL1分化能力

最近,有一些辩论的影响等级/受体配体相互作用对MSC分化为骨细胞和脂肪细胞谱系(23,24]。调查DL1在OP9分化的影响,我们研究了脂肪形成和骨生成OP9和OP9DL1在不同时间间隔数据表示2(一个)和2 (b)。油红O染色显示OP9细胞的脂肪细胞的分化率的速度比OP9DL1在每个指定的时间点(图2(一个))。相反,骨OP9DL1与OP9相比是更健壮的细胞,由高山染色(图2 (b))。

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图2
分化OP9或OP9DL1脂肪细胞和成骨细胞的能力在体外。(一)分化成脂肪细胞被油红O染色显示在指定的时间点,分别。(b) OP9骨生成和OP9DL1在不同的时间被高山化验染色,分别。
3.3。OP9支持* BM CD34的发展+细胞B细胞,而OP9DL1促进CD34的分化+细胞对T细胞

检查的能力OP9和OP9DL1支持BM CD34+细胞分化B或T淋巴细胞系,coculture CD34的实验+细胞与OP9或OP9DL1进行。CD34+细胞被隔绝的股骨和胫骨2 -或质询老鼠和与OP9或OP9DL1培养。收集细胞,流式细胞仪分析coculture在12天。如数据所示3(一个)和3 (b),有B220+CD34细胞+OP9 coculture和CD3细胞+CD34细胞+细胞与OP9DL1 coculture。实时PCR用于确定EBF1的表达式(B细胞因子)或GATA3 (T细胞因子)。正如所料,高EBF1 OP9 coculture组的表达被发现而高GATA3表达式被发现OP9DL1 coculture集团(数字3 (c)和3 (d))。类似于先前的报道(5,9),我们的研究结果表明,从CD34 OP9支持B淋巴细胞谱系早期发育+虽然OP9DL1促进早期T细胞生长。

(一)
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图3
OP9效果或OP9DL1骨髓CD34的分化+细胞。OP9或OP9DL1细胞(5×104/)镀在12-well板块αmem培养基加20%的边后卫的前12 h BM CD34+(5×105/)。coculture开始αmem培养基加20%的边后卫包含5 ng / mL的最终浓度因为flt - 3 IL-7和(Flt-3L)。12天后,流式细胞仪分析细胞收集((a)和(b)),和EBF1 GATA3基因表达是由实时PCR coculture五天之后,分别为((c)和(d))。(误差存在的SD平均值, 。)
3.4。OP9的影响和OP9DL1成熟B细胞的扩散

OP9的影响或OP9DL1成熟B细胞增殖尚未定义。脾B220+B细胞被沾染了CFSE然后孵化单独或连同OP9或OP9DL1在不同比率(OP9或OP9DL1与B细胞)的有限合伙人+ IL4,分别。如图4OP9和OP9DL1抑制成熟B细胞增殖减少CFSE表示的强度。与OP9DL1相比,OP9表现出更强的免疫抑制活动,和B细胞增殖受到明显抑制OP9比率低至1:80 (OP9 B)。

(一)
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(b)
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图4
OP9的影响以及OP9DL1成熟B细胞的增殖。B细胞(B220+)从小鼠脾脏分离沾CFSE,然后用25 ng / mL暴露IL4 + 10μg / mL有限合伙人24 h,随后培养单独或连同OP9为36 h或OP9DL1细胞在不同的利率。36小时后,B细胞的形态学观察每个好显微镜下(一个),然后通过流式细胞仪分析了B细胞,增殖是衡量CFSE强度降低。细胞增长率(b)的百分比表示。数据是代表三个实验。
3.5。OP9的影响和OP9DL1成熟T细胞的扩散

如前所述,OP9DL1促进T细胞早期发育,但其对成熟的T细胞增殖的影响是未知的。澄清OP9DL1在成熟的T细胞生长的作用,CD3+T细胞染色与CFSE培养单独或连同OP9或OP9DL1细胞比率(图表示5)。成熟的T细胞增殖是由CFSE标记直接评估和监测CFSE稀释。出乎意料,显著降低T细胞增殖OP9DL1文化观察的价格相比coculture OP9在每个层次结构(图成比例5)。与T细胞的增长速度相比,OP9DL1抑制T细胞增殖更明显增加比率(OP9DL1与T细胞),而OP9仅禁止T细胞生长在最高比率。

(一)
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(b)
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图5
OP9和OP9DL1抑制成熟的T细胞增殖在体外。CD3+从小鼠脾脏T细胞CD3εMicroBead工具包和CFSE标记。T细胞刺激了PMA (50 ng / mL) + ionomycin (1μg / mL) 24 h,然后培养独自或与OP9或OP9DL1在不同比率(OP9或OP9DL1细胞对T细胞)。36小时后,所有的细胞进行了分析通过显微镜(a)和流式细胞术(b)所表示的T细胞增殖减少CFSE强度。数据是代表三个独立的实验。
3.6。没有生产OP9 OP9DL1在存在不同的刺激器

涉及任何已被证明是在骨髓间充质多种免疫细胞的免疫调节11]。检查是否没有相关的影响OP9和OP9DL1成熟的T细胞和B细胞增殖,我们从OP9化验无水平文化上层清液与TNF OP9DL1刺激α/干扰素γ有限合伙人/ IL4或PMA /离子6、12和24小时(图6)。我们的数据显示,没有生产确实是增加培养基从每组的刺激因素,不管刺激持续时间OP9或OP9DL1,相比与没有刺激组。的没有OP9水平高于OP9DL1与肿瘤坏死因子刺激时α/干扰素γ或有限合伙人/ IL4(图6)。


图6
没有生产OP9 OP9DL1在存在不同的刺激器。OP9与TNF和OP9DL1刺激α/干扰素γ(每个2 ng / mL),有限合伙人(10μ25 g / mL) / IL4 (ng / mL),或PMA (50 ng / mL) /离子(1μ分别24 h g / mL)。上层清液收集在6、12和24 h和用于测定,分别。

4所示。讨论

它已被广泛证明OP9促进B淋巴细胞谱系发展和OP9DL1有助于发展的T细胞B细胞的早期发展(5,9,21,25]。然而,目前还不清楚什么样的角色OP9和OP9DL1细胞成熟的T细胞和B细胞增殖,分别。我们的研究结果首次证明OP9表现出强烈的免疫抑制活性的成熟B细胞增殖,而OP9DL1显示增强的抑制能力成熟的T细胞增殖。

众所周知,Notch1订婚的切口配体DL1可以激活Notch1信号(7,26,27],Notch1通路调节T细胞和B家族承诺和发展(25,28,29日]。它已经表明,抑制Notch信号减少CD4和CD8 T细胞增殖(30.),但对成熟B细胞生长没有影响(31日]。迄今为止,OP9的影响和OP9DL1成熟的T细胞和B细胞增殖尚未阐明。令人惊讶的是,我们的数据表明,OP9DL1成熟T细胞增殖抑制和延缓成熟B细胞增长(数字4和5),这是不同于它的角色在T细胞和B细胞早期发育9,25]。此外,鉴于OP9 B细胞早期发展的贡献,OP9也应该支持成熟B细胞增殖;然而,我们发现OP9阻碍了成熟B细胞的增殖(图4)。这些不可预见的结果可能与成熟T / B细胞的不同反应OP9或OP9DL1免疫调节。按照以前的报告(10),我们的研究表明,OP9和OP9DL1具有相同的扩散能力和表型相似的msc(图1)和脂肪细胞和骨细胞(图也分化能力2),这表明OP9和OP9DL1都msc。值得注意的是,我们的数据表明,OP9DL1比OP9成骨的强和弱的脂肪形成的能力,这有助于澄清争议(23,24),切口受体/配体相互作用影响msc的分化能力。

msc具有免疫调节作用的T细胞和B细胞等免疫细胞通过直接细胞间contact-dependent机制(32,33)和/或可溶性的生产因素,如吲哚胺2,3-deoxigenase [34)、前列腺素E2 (16- - - - - -18),(11,35,36),TGFβ(37),肝细胞生长因子(37),il - 10 (38),干扰素γ(39)、肿瘤坏死因子α(15]。据报道,DL1激活Notch信号(7]和切口的激活可能会增加生产(40]。我们的数据表明,OP9DL1没有生成比OP9没有,更没有产生OP9或OP9DL1刺激组比无模拟组。这些结果表明,不可能参与调节成熟B细胞和T细胞的生长期间coculture OP9或OP9DL1。然而,OP9DL1抑制成熟T细胞和成熟B细胞小于OP9,这可能表明DL1有助于细胞contact-dependent方式占主导地位的免疫调节作用。

类似于之前的研究,在我们的研究中,越来越多的B细胞和T细胞CD34的生成+细胞相比OP9 coculture OP9-DL1 coculture组。与成熟的T / B细胞不同,信息联系可能有一个主要角色在T / B早期发育coculture OP9或OP9DL1。当然,潜在的免疫调节机制OP9 OP9DL1成熟T / B细胞中定义还有待进一步的研究。

5。结论

我们的研究阐明,DL1改变骨髓间充质免疫细胞的免疫调节,显示出强大的成熟的T细胞增殖和抑制略有延迟成熟B细胞增长。这些发现提供了重要的洞察msc的免疫调节特性,以及成熟的T细胞和B细胞的大规模改造使用OP9或OP9DL1体外。

利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

Xiao-Xia江泽民和方南珠的构思和设计实验。Lei张Rui-Jie见鬼,杨Yan-Mei Dian-Chao崔,Ping Li烟鹂倪,通豪进行实验。Lei张Rui-Jie见鬼,杨Yan-Mei Dian-Chao崔,Ping Li烟鹂倪,通,Changyong Wang Xiao-Xia江,南珠方分析数据。江Xiao-Xia Changyong Wang,南珠方造成试剂/材料/分析工具。Lei张Rui-Jie见鬼,江Xiao-Xia南珠方舟子写的论文。Lei张和Rui-Jie见鬼了一样工作。

确认

作者感谢刘必应提供有价值的试剂和林赛•琼斯(Keck医学院的大学(University of Southern California)为她阅读论文的关键。本研究支持由中国国家自然科学基金(81271936,31200733)和项目的中国国际科技合作与交流。2013 dfg30680)。