文摘
在过去的几年中,各种各样的在活的有机体内小鼠模型生成为了解开的分子病理慢性粒细胞白血病(CML)和开发和改进治疗方法。这些模型从转基因模型(条件),敲入模型和小鼠骨髓逆转录病毒转导模型移植紧随其后。免疫缺陷的异种移植模型的发展,它已成为人类干细胞/祖细胞可以使用在活的有机体内研究以及细胞直接来源于CML患者。这些模型不仅模仿CML,也一直在帮助揭露各种CML疾病进展的基本机制和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)阻力。iPSC的可用性的技术,它已成为可行的获得,维护和扩大CML积累,至少与病人基因完全相同。以下审查概述了所有小鼠以及人类CML异种移植模型建立了至今为止。
1。介绍
CML是骨髓增殖性疾病,其特征是积累的几种类型的骨髓前体细胞。CML是由之间的相互易位染色体9日和22日也被称为费城(Ph值+)染色体,从而导致bcr - abl融合蛋白的形成取决于精确的断点和拼接的最终bcr - abl mRNA (1]。超过90%的患者诊断在较早阶段的疾病称为慢性阶段(CP)。人们普遍认为收购t (9; 22) bcr - abl易位启动事件在CML CP [2,3]。相信这次收购最初出现在一个收益的HSC增殖优势和/或异常的正常细胞分化能力,导致扩张的粒细胞(4,5]。之前的发现酪氨酸激酶抑制剂(TKIs),所有患者CML-CP发展到先进的疾病治疗后5年的中位数。这一阶段分为加速阶段(美联社)其次是骨髓爆炸危机(BC) (6),尽管过渡到淋巴爆炸危机也可以发生。这个疾病进展的分子机制仍然没有完全理解,但他们很可能涉及致癌因素的激活和抑制的失活是肿瘤。自我更新的表型白血病干细胞维持CML仍然是模糊的。在CML-CP, lsc驻留在林−CD34+38−分数,表明获得的第一个细胞bcr - abl易位是未成熟干细胞或祖细胞(7- - - - - -9]。通过执行移植研究SCID小鼠(重度联合免疫缺陷症),Cobaleda等人表明leukemia-initiating细胞的自我更新和表型属性(SL-ICs) bcr - abl p190 Ph-ALL是类似于正常的干细胞,这表明肝星状细胞作为细胞的起源在CML [10]。许多其他研究也支持这个观点,建立了一个基本的了解CML层次结构(11,12]。此外,相比其他致癌基因MOZ-TIF2和MLL-ENL bcr - abl不能给予承诺祖细胞自我更新属性,再次表明未成熟的干细胞/祖细胞是最有可能在CML细胞的起源13- - - - - -15]。在进展BC-AML,表明leukemia-maintaining干细胞的表型变化,开始像粒细胞/巨噬细胞祖细胞的表型(gmp)。杰米逊等人报道在体外自我更新能力的白血病gmp由于增加核的水平β连环蛋白相比,正常gmp (16]。此外,南等人提供的证据表明,bcr - abl转换达到异常β连环蛋白活动可以作为lsc保持疾病(17]。这些数据表明,lsc稍后启动和维持CML具有多功能特性可以改变在疾病的进展。
伊马替尼治疗CML患者的抑制剂会导致响应率超过95% (18]。然而,leukemia-initiating细胞不针对性的有效12,19,20.),和病人可能需要终身继续治疗。很大比例的患者发展的主要阻力疗法,通常由于突变激活循环,磷酸绑定P-loop或催化bcr - abl激酶结构域(21- - - - - -23]。第二代和第三代TKIs开发如达沙替尼,nilotinib, ponatinib, bafetinib但TKI阻力似乎仍然是一个挑战。此外,获得性耐药治疗过程中由于是否耐药克隆选择防护微环境,增加药物的流出,或bcr - abl信号机制呈现TKI CML治疗无效的(24- - - - - -26]。因此,识别额外的目标,促进bcr - abl的根除+leukemia-initiating细胞是必要的。
评估疾病的原因,目的在于识别特征的残余CML lsc导致疾病进展,TKI阻力,和疾病复发。一个适当的方法集中于建模CML在活的有机体内小鼠模型来研究这种疾病的分子发病机制和发展和改善治疗的方法。本文总结了最近的进展,目前的挑战,和正在进行的研究在建立小鼠以及人类异种移植在活的有机体内模型。即将到来的方法的优点和局限性如iPSC技术和人性化的异种移植小鼠模型将讨论对CML(图1)(表1)。
2。转基因小鼠模型
2.1。传统的模型
第一个转基因模型来评估bcr - abl的致癌基因可能是由合成bcr - abl基因引入鼠标生殖细胞系。的融合bcr和v-abl表达的控制下免疫球蛋白重链增强剂(Eμ)或长末端重复的启动子/增强剂(LTR)骨髓肉瘤病毒(MPSV) [27]。增强剂的结构都能在不同的造血细胞的功能包括B / T淋巴细胞以及骨髓细胞株,推理,他们可能还在原始的肝星状细胞功能,这些祖细胞出现。在早期发展转基因的表达导致后代产量下降。此外,12个病人中只有3个老鼠轴承Eμ借bcr - abl表达死于前b和T淋巴瘤,而1除以3老鼠窝藏MPSV LTR-driven bcr - abl表达式发达T淋巴瘤。没有开发与构建骨髓性白血病。另一个缺点是,BCR-v-ABL不同于bcr - abl,它缺少的部分bcr- - -abl派生的地区,它有几个氨基酸替换在后者。因此,获得的结果与p210 BCR-v-ABL转基因老鼠不可能准确反映出原始混合蛋白的生物学性质(27]。
更一致的结果是通过使用三角洲metallothionein-1启动子。这个子由活跃在所有观察组织和用于驱动p190 bcr - abl基因的表达。十的60 p190 / deltaMT转基因小鼠,其中8屈服于死亡由于骨髓(2/8老鼠)和淋巴性白血病小鼠(6/8)10至58天出生的28]。在后续的研究中与一大群老鼠移植/淋巴瘤与相同的构造显示[28,29日]。此外,在动物表达p210 bcr - abl构造控制的太子T细胞白血病发达与没有b的迹象出现在p190 bcr - abl老鼠(30.]。
在另一项研究中,同一组使用tec启动子驱动p210 bcr - abl表达转基因小鼠。tec基因编码的细胞质激酶优先表达造血前体细胞。使用这种转基因模型5的创始人是生成的,其中2开发所有出生后不久,而转基因后代表现出类似人类的mpd CML更长时间延迟后4 - 8飞蛾(31日]。这些结果表明,tec-driven p210 bcr - abl转基因老鼠可以展览CML恶性肿瘤的基本特征。
2.2。有条件的模型
Huettner和他的同事们采取了新的方法通过建立条件CML[转基因小鼠模型32]。转基因小鼠p210 bcr - abl四环素的控制响应元件(过夜)生成和后代等4 transresponder转基因小鼠交配与反式激活因子老鼠MMTV-LTR控制(tTA)在连续政府四环素的饮用水,5天前开始交配。双转基因小鼠获得的频率估计孟德尔在所有4行。四环素撤军,bcr - abl1表达和100%致命的发生率观察b没有骨髓或T细胞恶性肿瘤的迹象。这可能是由于b细胞类型特定的启动子,B220 MMTV-LTR导演tTA的表情+细胞。然而,本研究首次表明胚细胞计数在晚期白血病小鼠减少对四环素政府阻止bcr - abl表达式。这些数据表明,bcr - abl1是重要的感应和维护这些小鼠的疾病。然而,所有老鼠恢复从一个创始人的线是屈服于BCR-ABL1-independent b可能在2 - 4周由于收购二级突变(s)在疾病进展(32]。
后来的研究从同一组进一步修改这个tet-off诱导转基因模型通过将控制tTA表达式3′增强剂的小鼠干细胞白血病(sci)基因33]。sci是造血作用的关键调节器,通常表示在红细胞和巨核细胞的细胞,肥大细胞,多能的干细胞/祖细胞。在这些老鼠,感应bcr - abl导致嗜中性白细胞增多,骨髓增生,和骨髓粒细胞浸润,从而概括CML的许多特征(33]。此外,31%的动物骨髓增殖性疾病发展到b (33]。降级的骨髓和淋巴表型是显示在失去bcr - abl表达式,虽然需要进一步的实验来评估是否可以容忍失去bcr - abl在疾病的晚期。
2.3。同源重组的方法
同源重组是用作另一种方法来创建p190 bcr - abl转基因老鼠bcr - abl cDNA插入到exon1鼠标bcr轨迹。构造electroporated成ES E14灯头细胞,从而生成胚胎干细胞中含有1完整bcr等位基因,另一个重新安排等位基因由于bcr - abl融合。当这些正确修改ES细胞被注入受体C57BL / 6胚细胞,所有嵌合小鼠b。类似白血病的表型观察37 40嵌合小鼠获得在缺乏内生bcr等位基因(35]。这个策略很有用的研究引起白血病的潜在p190 bcr - abl表示在正常转录控制元素。
总之,转基因模型首次验证的致癌潜力的bcr - abl和支持表达bcr - abl的主要CML感应启动事件p190 bcr - abl [29日]。此外,有条件的模型很大程度上有助于理解人类CML的过程以及研究CML白血病干细胞。这是使用这种诱导sci / p210 bcr - abl转基因小鼠模型,研究从群森古普塔等人证实BMI1与bcr - abl合作的角色转变慢性淋巴祖细胞诱导阶段连续移植b (34]。使用转基因(条件)模型可以发挥重要作用在理解二次合作事件CML的进展。然而,一代新创始人转基因老鼠每次bcr - abl毒性和沉默建立CML转基因模型仍然是一个繁琐的和具有挑战性的工作。
3所示。转导/移植模型
小鼠骨髓转导途径由达利和他的同事们用逆转录病毒编码p210 bcr - abl为了CML模型(5]。转导细胞被移植到30致命辐照同源的接受者。13的30(43%)移植小鼠发达3不同的血液恶性肿瘤后5个月内调整:CML-like骨髓增生综合征平均延迟大约9周,平均延迟时间约为14周,含有巨噬细胞和肿瘤细胞类型平均延迟约16.5周(5]。从一个受影响的老鼠骨髓移植进致命辐照二级接受者也开发了一种CML-like综合症(5]。
Kelliher和他的同事们也从研究者用转导骨髓细胞治疗小鼠v-abl逆转录病毒和移植或p210 bcr - abl这些致命辐照老鼠。一半的老鼠发达CML骨髓增殖性疾病类似慢性阶段,而其余动物发达pre-B-cell淋巴瘤(36]。19个老鼠收到Abelson小鼠白血病病毒(Ab-MLV)感染细胞被4到10周后,由于myelomonocytic白血病和pre-B-cell淋巴瘤,而11种老鼠收到bcr - abl转导细胞死亡9 - 12周后调整由于myelomonocytic白血病,粒细胞性白血病,pre-B-cell淋巴瘤(36]。一个伟大的资产的传导模型是单克隆可以评估利用独特的集成网站克隆标记。
后续研究的几组,转导效率进一步提高导致逆转录病毒转导/移植模型,导致快速感应CML-like骨髓增殖性疾病(MPD)在100%的情况下,可能是因为高效bcr - abl表达适当的靶细胞。这种疾病的特点是增加粒细胞增多,脾肿大,传播到其他器官(肺),和高效的二次移植37- - - - - -40]。然而,在病毒滴度变化还影响了这种模式的再现性。同时,使用强启动子驱动bcr - abl表达受阻建模的白血病较长的延迟。
转导/移植模型被证明是更有效的比转基因老鼠的快速而简单的方法促进容易测定单克隆白血病和二次移植以及合作学习活动协同bcr - abl诱发疾病。Bousquet等人的研究显示,mir - 125 b超表达独立诱导淋巴或骨髓白血病以及作为次要事件通过加速发展p210 bcr - abl诱导白血病(41]。张等人的研究强调了Vav3 GEF一样重要的角色在p190 bcr - abl介导激活RAC GTPase proapoptotic信号白血病生成所需的差别,对这些42]。虽然目前小鼠转导/移植模型无法模拟人类CML的时间延迟和可移植的骨髓中学,它是极其重要的验证结果使用适当的异种移植小鼠模型的模型。
4所示。异种移植模型
最早的人类试图模型CML在免疫缺陷小鼠模型可以追溯到70年代末bcr - abl的地方+细胞系K562注入裸小鼠增长是坚实的血管肿瘤包含细胞类似的病人和文化(43]。类似的观察与K562细胞株后来被Caretto和他的同事报道(44]。索耶斯和他的同事注意到,细胞株和BM CML患者骨髓样本爆炸危机可以被注入的细胞移植到SCID小鼠局部区域,通过腹腔内(i.p)注射或肾小囊内(45]。有效的观察白血病移植和传播在BM和PB。有趣的是,微分脾脏的增长被认为在这些爆炸骨髓细胞与淋巴细胞。移植慢性阶段CML患者样本罕见,只有有限的观察骨髓生长(45]。Sirard等人也提供了证据表明移植正常和白血病CML患者的造血细胞亚致死的辐照SCID小鼠没有外源性细胞因子治疗(46]。然而,高细胞数据移植和罕见的和有限的淋巴以及在这些SCID小鼠骨髓结果仍是一个缺点,或许是由于残留这些SCID小鼠的先天免疫。
多年来,随着更好的免疫缺陷模型的发展,如重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型,移植人类正常和白血病细胞的显著改善。特别是,提高淋巴细胞的移植。然而,移植骨髓(恶性)细胞仍具有挑战性和许多研究人员聚焦于发展一个系统能够允许高效的人体细胞及其微环境之间的相互作用。第一个模型,试图重现人类环境允许长期multilineage人工造血活动被coimplantation麦克卡尼和他的同事们报告的小片段的人类胎儿胸腺和胎儿肝脏免疫缺陷SCID小鼠,虽然这种模式并非用于研究骨髓转换(55]。随着NOD-SCID老鼠的发展与功能有缺陷的淋巴细胞和NK细胞几组成功显示,移植的单核和CD34+细胞PB的CML患者使用低细胞数量比CML (SCID小鼠模型的报道47- - - - - -49]。在发展的挑战之一在活的有机体内人类CML模型,仍是正常干细胞经常小巧慢性期CML干细胞。通过识别病人的在体外长期culture-initiating细胞(LTC-ICs)主要是白血病,将这些细胞注入NOD-SCID或NOD-SCIDβ2米−−/老鼠更加一致的移植被认为对移植后5个月8]。在后期时间点老鼠死于内生派生胸腺瘤时,但没有明显进步的疾病的迹象,表明这个模型只代表了慢性阶段的疾病(8]。
康妮的屋檐preleukemic在活的有机体内CML模型通过转导主要人类脐带血CD34+细胞与MSCV驱动p210 bcr - abl移植到NOD-SCID NOD-SCID紧随其后β2−−/老鼠。增加与减少观察移植B-lineage输出和增强生产红细胞和巨核细胞的细胞(50]。然而,只有4 28老鼠显示白细胞计数升高和/或脾肿大总值的延迟5 - 6个月。尽管发展为爆炸危机CML没有观察到,这些数据清楚地表明,表达bcr - abl导致管制生长和分化,在某些情况下,早期阶段疾病的进展。
自bcr - abl本身似乎不足以诱导白血病在异种移植模型中,有人提出额外的途径可能有必要配合bcr - abl的过渡CP-CML BC-CML, Wnt和刺猬等途径(16,56,57]。或者,它已经被观察到BMI1 polycomb基因的表达,这是与在正常和白血病干细胞增殖58,59),在晚期疾病患者明显高于在CP患者(60]。因此,我们评估BMI1能否作为bcr - abl一起合作因素。我们确认coexpression BMI1 bcr - abl人类CB CD34+细胞足以诱发NOD-SCID小鼠移植白血病(51]。这种疾病发展到淋巴爆炸危机阶段和连续移植b可以建立(51]。
尽管异种移植小鼠模型的开发使得工作能力与主要的患者样本在活的有机体内CP-CML的发病机制进展成BC-CML仍很难模型。虽然在人类逆转录病毒转导模型可以建立连续移植b,髓系恶性血液病的发展在异种移植模型仍相当具有挑战性。各种现象可以构成这些观察包括异种移植物中残留的宿主免疫模型,使用或可能更重要的是缺乏一个合适的微环境对维持人类骨髓白血病。
5。人源化小鼠模型
大多数免疫缺陷小鼠模型是IL2R直到日期γ−−/鼠标(NSG),哪些特性点头/ ShiLtJ背景,重度联合免疫缺陷(scid)突变,和损失的受体γ- 2,完全缺乏T, B, NK细胞。经过他们的发展,NSG异种移植移植模型很快成为访问的黄金标准在活的有机体内重新的肝星状细胞以及lsc。然而,2011年,该集团的失败报告的多米尼克•盖主要AML细胞移植的60 - 70% (61年]。重要的是,这些老鼠NSG仍偏向淋巴细胞增殖,而是和正常或恶性骨髓形成仍然难以实现。尽管这些异种移植模型是人类移植免疫缺陷,容忍,没有人类的微环境可能仍然适当防止人体细胞的增长。事实上,各种生长因子具有种特异性,例如,小鼠IL-3或gm - csf未能激活人类受体,这可能,至少部分解释淋巴偏见。唐娜Hogge和康妮屋檐NOD-SCID建立小鼠转基因对人类自洽场IL-3, gm - csf (62年,63年]。AML的样本未能在常规嫁接NOD-SCID老鼠现在可以嫁接在人类细胞因子NOD-SCID老鼠。群吉姆Mulloy然后越过这些老鼠的NSG背景,也更好的移植AML样本hSCF NSG转基因,hIL-3, hGM-CSF [64年]。
虽然这些异种移植物模型显然持有的承诺,也有一些潜在的缺陷。由于这些转基因模型和人类的等位基因是不撞到了他们的内源性基因座,表达水平可能不同于生理水平,这可能会对正常的自我更新和分化有重要影响的项目。的可能,这是解决MYSTRG老鼠Flavell生成的实验室,4人的细胞因子的撞到了各自的老鼠基因座(65年]。然而,一个适当的利基显然包括更多的因素不仅仅是这些细胞因子。直接与利基的交互不仅对正常肝星状细胞很重要而且对lsc[至关重要66年]。例如,N-cadherin调和关键CML lsc之间的相互作用和他们的利基67年]。事实上,有一个连续lsc之间的串扰和自己的定位,特别是在CML的情况记录,lsc逐渐改变他们的利基,支持白血病生成(68年,69年]。因此,一个人类造血和白血病生成最终的模型可能是一个模型研究的领域是人类起源(恶性)。理查德Groen描述了一个陶瓷支架的人源化小鼠模型使用NSG播种与人类间充质基质细胞植入来生成一个人类骨髓——(huBM)像利基(70年,71年]。我们广泛研究逆转录病毒CB CD34+bcr - abl模型在这些人性化的利基NSG的老鼠,我们的数据表明,bcr - abl过度就足以诱导AML和所有人,可连续移植(72年]。通过比较转录组的白血病来源于小鼠利基与白血病huBM-like脚手架(huBMsc)为基础的领域,我们观察到显著差异表达的基因与缺氧有关,线粒体和新陈代谢。危象的有效嫁接CML患者细胞也观察到,即不成熟的爆炸之类的表型是维护人类脚手架利基,但在小鼠利基市场在一个小得多的程度上。因此,我们建立了人类生态位模型的bcr - abl的骨髓和淋巴功能+白血病可以详细研究[72年]。未来的研究将旨在确定慢性期CML患者样本也可以嫁接在这个模型中,从慢性阶段进展到爆炸危机是否CML可以建模为好。
6。结论
CML是研究最多和最好的理解血液恶性肿瘤直到现在,迷住了几个癌症干细胞的兴趣爱好者将药物发现的限制进一步了解突显出这种疾病的分子机制。在过去的35年,CML模型不断发展和改进,已在很大程度上帮助我们理解这种疾病。建立人性化的生态位模型,它将有可能进一步学习和了解白血病细胞与环境之间的串扰与CML的发病机理。这应该给我们一个一步一个完整的理解的机制bcr - abl施加转型的潜力,本质上在造血细胞以及非固有地通过修改其利基。
7所示。未来前景
除了再生医学,iPSC技术也提供一个很好的平台模型,研究骨髓增殖性肿瘤等疾病的病理生理学包括CML和PV。Carette等人成功重组KBM7 BC-CML细胞系在CML细胞则(52]。胡锦涛等人重新编程跨国公司从BM CP-CML病人使用nonintegrating游离向量(53]。虽然CML-iPSCs的DNA甲基化模式是不同于原始CML样本,这是iPSC-like;也是非常相似的正常细胞则和人类胚胎干细胞的基因表达谱。然而,疾病从来没有发展到公元前阶段可能由于缺乏更多的突变。后来,黑川纪章的生成CML万能伊马替尼敏感CML患者样本(54]。有趣的是,CML-iPSCs对伊马替尼,而CML-iPSC-derived造血细胞恢复伊马替尼除了CD34的敏感性+38−90年+45+未成熟细胞耐药,可能与患者中观察到。的一个挑战是,重组CML细胞则导致表观遗传变化不同于原来的患者样本的观察,从而也iPSC CML细胞的特征。尽管如此,iPSC提供了一个令人兴奋的新技术与CML的各个方面可以研究和小说可以开发特定的靶向治疗。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关出版的手稿。