文摘

转化生长因子1 (TGF -β1)在肝祖细胞中起着核心作用——(手持电脑)介导的肝脏修复和纤维化。然而,不同的效果的TGF -β1在祖细胞并没有被描述。在这项研究中,两种在体外(手持电脑cocultured肝星状细胞(hsc) transwells)在活的有机体内(同₄受伤的肝纤维化大鼠)系统被用来评估的影响。我们发现,手持电脑使用TGF -β12小时1抑制肝星状细胞的激活,而致敏48小时增加肝星状细胞的激活。符合这些在体外结果,在活的有机体内肝纤维化大鼠模型显示相同的时间TGF -的双重效果β1。回归的肝纤维化血清转氨酶和白蛋白水平正常化检测大鼠移植的手持电脑使用TGF -β1为12小时。相比之下,发现了严重的肝纤维化和collagen-1水平升高的大鼠移植手持电脑使用TGF -β1 48小时。此外,TGF -β1-pretreated手持电脑显示取消激活肝星状细胞通过加强SERPINE1表达式。抑制SERPINE1扭转失活反应剂量依赖性的方式。

1。介绍

肝祖细胞(手持电脑)是一组小驻留在最小的导管的上皮细胞在肝脏胆道树(1]。随着研究技术的进步,我们理解和欣赏的积极参与手持电脑在两个急性和慢性肝脏疾病。取决于并发疾病过程和微环境的变化,手持电脑是多能在不同刺激下的,可以经典分化成肝细胞或cholangiocytes,甚至myofibroblast细胞或癌细胞(2- - - - - -5]。

在急性肝损伤时,肝细胞分裂时严重受损或阻塞,手持电脑被激活和增殖,手持电脑将开始渗透和扩张的肝板向中央静脉;因此,他们分化成肝细胞或cholangiocytes恢复肝实质和肝功能6]。最近的研究表明手持电脑的重要作用损伤修复和纤维化实验模型和慢性肝病患者(7,8]。HPC响应与肝细胞损伤和肝纤维化的程度(9]。此外,抑制肝星状细胞(hsc)激活或iloprost政府减少手持电脑激活增加肝细胞分化[10]。肝星状细胞是居民perisinusoidal细胞分布于整个肝脏,与一个了不起的一系列功能正常,肝脏受伤。在肝损伤,各种炎症和纤维发生的途径促进肝星状细胞的激活,这增加了纤维发生和改变矩阵退化;因此,肝星状细胞(可能是重要的治疗目标11]。

然而,争论是否HPC的影响反应在肝纤维化antifibrotic或纤维发生的。CCl的₄全身的大鼠肝衰竭模型2/3肝切除术,手持电脑有效参与修复受损的肝脏如图所示,我们之前的研究(12]。我们最近的数据也表明,CCl手持电脑改善移植₄全身的肝硬化。然而,观察多能分化的手持电脑。例如,HPC的扩张室,这被称为ductular反应,显然会导致瞬态放大的异质细胞群,能够分化成肝实质和myofibroblast细胞。Ductular反应往往伴随着手持电脑激活以及周围的细胞外基质(ECM)过度沉积的门户地区,建议直接联系Ductular反应和门静脉周的纤维化(5,13]。

转化生长因子1 (TGF -β1),一个多功能的细胞因子,发挥其生物效应在组织和器官发育,细胞增殖、分化、生存和凋亡[14]。在肝脏,TGF -β1是假设作为重要环节在肝脏再生,慢性损伤、肝硬化和肝细胞癌。TGF -β1被认为是最有效的肝profibrogenic激活细胞因子主要由间充质细胞在慢性肝损伤(15]。它是合理的建议监管从TGF -轴β手持电脑,然后1肝星状细胞在肝纤维化。他们的相互关系可以通过部分模仿解剖病理微环境在纤维化手持电脑暴露于高浓度的TGF -β1。

调查TGF -之间的相互关系β1、手持电脑和模仿的肝星状细胞微环境,我们利用在体外和在活的有机体内系统。在在体外研究中,手持电脑使用或没有TGF -β1是间接cocultured肝星状细胞。在在活的有机体内研究中,手持电脑使用或没有TGF -β1 CCl被移植到脾脏₄全身的纤维化。此外,在这个监管机制从TGF -轴β手持电脑,然后1肝星状细胞在肝纤维化研究使用一个epithelial-to-mesenchymal过渡——(EMT)相关的聚合酶链反应(PCR)数组。

2。材料和方法

2.1。Coculture肝星状细胞的手持电脑

河鼠肝祖细胞线(WB-F344)来自于军事医学科学院。大鼠肝星状细胞株(T6)请弗里德曼博士提供的。WB-F344细胞和HSCs-T6镀在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Gibco,宏伟的岛,纽约,美国)补充10% (v / v)胎牛血清(美国纽约的边后卫,Gibco大岛屿)(完全培养基)。

间接coculture系统组装使用transwell文化板块(0.4μ孔隙大小,6-well Millicell;微孔、瑞士)。这个系统允许细胞保持联系通过共享没有混合两个细胞系培养基;1×10⁴肝星状细胞是镀在众议院,4×10⁴手持电脑被镀上插入。coculture系统保持在一个孵化器提供5%的股份有限公司₂。对于单一组,1×10⁴肝星状细胞在培养皿中一个单独的和治疗的媒介一样coculture系统。

TGF -β1治疗,手持电脑与10 ng / mL TGF -培养β6 1 5% FBS-DMEM媒介,12日或48 h。1 h-indole-3-acetic酸,SERPINE1抑制剂α(-oxo-1) - phenylmethyl 5 - [4 - (trifluoromethoxy)苯基](pai - 039,轴突、美国、细胞信号技术,丹弗斯马,美国)被添加到中等浓度的10μ同时TGF - Mβ1确认其阻断和逆转HPC对肝星状细胞的影响。

2.2。实时定量PCR (qPCR)分析SERPINE1表达式

总细胞信使rna提取收获细胞与试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。互补脱氧核糖核酸是相对地转录使用逆转录系统(Promega,北京)。以下引物被使用:向前,5′-TCTCCAGGGGCCCTCTGAGGT-3′,相反,5′-TGCCCCTCTCCGCCATCACC-3′(SERPINE1);向前,5′-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAGA-3′反向5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′(GAPDH)。进行SYBR Green-based qPCR乐器(美国应用生物系统公司)2分钟在5°C在孵化前10分钟95°C逆转录酶灭活,否则干扰DNA聚合酶。四十周期在95°C 15 s紧随其后为60年代进行60°C。目标基因的mRNA表达是GAPDH规范化。相对量是表示为手段±标准差(SD)从三个独立的实验。

2.3。免疫印迹细胞Differentiation-Related纤维发生的标记

细胞被洗和细胞溶解缓冲区(250毫米氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,1%诺乃清洁剂P40、5毫米EDTA, 50 mM氟化钠,钠和1毫米₃签证官₄)补充蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学,美国)。煮10分钟后,溶解产物分离在12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶。这些墨迹被封锁在tris-buffered使用脱脂奶粉5%盐水包含渐变20 2 h在室温下后跟孵化与主白蛋白抗体(Abcam铝青铜,稀释1:500年,剑桥,英国),α胎蛋白(法新社,稀释1:1000年,研发系统、美国),α光滑的肌肉肌动蛋白(SMA稀释1:1000年,研发系统、美国),TIMP-1(稀释1:1000年,研发系统、美国),和PCNA (Abcam稀释1:1000年,剑桥,英国)在一夜之间在4°C。洗后,这些墨迹被孵化与适当的辣根peroxidase-conjugated二级抗体(ZSGB生物,中国)1 h在室温下,和反应是增强化学发光检测到的装备(美国热费希尔科学Inc .)。信号检测后,膜与反被孵化β肌动蛋白抗体(σ稀释1:2000年,美国)作为加载控制。免疫印迹检测重复了三次。

2.4。EMT PCR基因表达的数组

微分EMT基因的表达进行了分析使用老鼠EMT PCR数组(parn - 090 zc型、试剂盒、希尔登,德国)。根据标准协议和RNA提取转换为第一链cDNA使用RT2链装备。模板添加到一个instrument-specific,即食RT2 SYBR绿色qPCR掌握混合。由此产生的混合物添加到井(25μ信用证)的PCR阵列板包含predispensed gene-specific底漆(25集μL 96 -孔板)和PCR进行。阈值周期(Ct)所有PCR基因在每个数组的值计算使用instrument-specific软件,和基因表达的褶皱变化成对比较计算使用方法。

2.5。手持电脑移植

程序涉及实验动物都是按照实验动物保健和使用指南发布的动物保健和使用委员会友谊医院,首都医科大学。肝纤维化是诱导雄性老鼠的报腹腔内注射0.2毫升/ CCl 100克体重的₄与橄榄油混合为2周(2:3)。CCl两天后完成₄治疗,5×10⁶手持电脑使用TGF -β1 12 h (TGF -β1 pre-HPC(12小时)集团),TGF -β1 48 h (TGF -β1 pre-HPC(48小时),),或没有TGF -β1 (HPC集团)在500年被稀释μL(磷酸盐(PBS),然后慢慢地移植到大鼠脾脏使用23-gauge针(16]。老鼠CCl处理₄与500年2周和移植μL PBS被用作控制(PBS组,)。移植后,没有额外的创新领导力₄是管理的四组。所有的动物都牺牲在细胞移植后4周,和血液和肝脏样本收集euthanization。

2.6。检查肝损伤

血清转氨酶(南京建成生物技术研究所,中国)水平和白蛋白(Abcam,剑桥,英国)测定生化肝损伤的证据。所有血液样本收集的实验。

2.7。组织学检查

肝脏样本在4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片。苏木精和伊红和小天狼星红染色进行。每个样本被两个病理学家独立评估,取得了盲法研究协议,根据纤维化评分系统最近发表的丛et al。17]。纤维化的严重程度被分为七个阶段(6),0表示没有纤维化和6表明肝硬化。

2.8。测定血清Collagen-1水平

血清水平的collagen-1测定采用酶联免疫吸附试验系统(蓝色基因,中国)根据制造商提供的说明。

2.9。免疫组织化学染色的α光滑的肌肉肌动蛋白

用兔抗免疫组织化学分析αAbcam sma(稀释1:100年,剑桥,英国)。详细的方法已经发表之前(17]。五个领域的每个部分被随机选中计算阳性表达面积的比值。

2.10。免疫荧光染色的SERPINE1

手持电脑孵化在媒体含有不同浓度的pai - 039在DMSO 48 h,固定为5分钟以100%甲醇−20°C,和阻塞PBS山羊血清含有10%,0.3甘氨酸,1%牛血清白蛋白,0.1%在室温下渐变为2 h。兔子的手持电脑被孵化anti-SERPINE1 (Abcam稀释1:100年,剑桥,英国)在一夜之间在4°C。在PBS洗涤三次后,主要的抗体反应与相应的Alexa萤石488 -共轭anti-IgG (Abcam稀释1:500年,剑桥,英国)30分钟的37°C。部分是一个奥林巴斯CX41荧光显微镜下检查(奥林巴斯、日本)。

2.11。统计分析

所有数据都表示为均值±SD从三个独立的实验。多个组的平均值之间的差别进行了分析使用非参数方差分析测试(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。比较两组使用学生的以及。被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。TGF -β手持电脑分化成1-Induced Mesenchymal-Like细胞

手持电脑TGF -的接触β1 0、6、12、24、36岁和48 h逐渐从一个典型的细胞形态学改变多边形形状和鹅卵石单层外形细长,纺锤状细胞。如图1(一)手持电脑处理,我们发现TGF -β1后开始出现表型变化12 h, 48 h后发生显著的表型变化。

此外,我们观察到的改变表现分化标记手持电脑处理TGF -β1。如图1 (b),αsma是诱导早在12 h,而其他标记的祖细胞的表达,包括铝青铜和法新社,抑制后24 h TGF -β1治疗,表明尽管αsma在TGF - 12 h后增加β1感应,手持电脑仍然拥有干细胞的表型。自TGF -β1治疗12 h诱导高水平的αsma表达与治疗6或48小时相比,我们选择TGF -β1治疗12 h所有后续的实验。

3.2。手持电脑使用TGF -β1 12 h抑制肝星状细胞的增长

模仿的在活的有机体内纤维化的微环境,我们cocultured肝星状细胞和TGF -祖细胞进行预处理β不同的时间(图12(一个))。我们观察到接触TGF - HPC的影响β1在肝星状细胞的激活。

肝星状细胞的形态学变化只观察他们cocultured祖细胞后使用TGF -β1为12 h(图2 (b))。在这组,肝星状细胞失去了典型轴形状和圆形或椭圆和圆形细胞核。细胞的数量并没有增加。没有其他组织观察形态学变化;他们仍然带着一个典型的HSC的外表,包括纺锤形、星形或不规则细胞体椭圆形或长核。

3.3。TGF -预曝光的手持电脑β1在不同的时间不同的肝星状细胞激活引起的

接下来,我们分析了纤维发生的基因的表达在肝星状细胞是cocultured手持电脑使用或没有TGF -β1对6、12或48 h。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (b)手持电脑使用,肝星状细胞cocultured TGF -β1对6 h显示无显著差异αsma相比没有TGF -或TIMP-1表达式β1治疗手持电脑;与手持电脑刺激预处理步骤cocultured TGF -β1 12 h已经大大降低αsma和TIMP-1表达水平与未经处理的手持电脑。然而,手持电脑使用TGF -β1超过12 h已经显著增加αsma和TIMP1表达水平,而未经处理的手持电脑。这些结果表明,预曝光TGF -的手持电脑β1不同时间的微分肝星状细胞的激活引起的。

手持电脑暴露于动物注射TGF -β1 12 h降低了肝纤维化的进展和改善肝功能。

我们进一步评估手持电脑接触TGF -的影响β在肝纤维化的1在活的有机体内研究。河鼠模型被注射的手持电脑接触TGF -β1为12或48 h。这些时间是基于结果的选择在体外研究。

我们与他走时和小天狼星红染色肝部分(图4(一))。肝纤维化的半定量的分数每组如表所示1。纤维化评分证明动物移植未经处理的手持电脑或手持电脑使用TGF -β1 12 h数量减少的纤维化,与自然回归的纤维化PBS组()。重要的是,与HPC移植组相比,大鼠移植手持电脑使用TGF -β1 12 h显示额外的显著减少肝纤维化。手持电脑使用大鼠移植TGF -β1 48 h纤维化有显著提高(、表1)。

因为肝纤维发生肝星状细胞是重要的,我们进一步研究了手持电脑是否会影响肝星状细胞激活。大鼠移植与未经处理的手持电脑或手持电脑使用TGF -β1 12 h显示显著抑制HSC的活化,减少表示的表达式αsma和胶原蛋白I(数字5(一个)- - - - - -5 (c)),这表明注入手持电脑接触TGF -β1一个适当的时间是一种新型的治疗策略来减弱肝纤维化。

此外,我们比较血清ALT和铝青铜在四个实验组,每组水平。血清ALT水平显著降低大鼠移植的手持电脑使用TGF -β1 12 h比PBS注射组,他们倾向于更低的未经处理的progenitors-transplanted老鼠(图5 (d)),而老鼠的ALT水平与祖细胞移植使用TGF -β1 48 h是四组中最高的。血清铝青铜在未经处理的水平明显升高progenitors-transplanted老鼠CCl与控制₄全身的老鼠。正如所料,铝青铜水平进一步升高组与手持电脑使用TGF -移植β1 12 h,相比之下,在PBS和未经处理的progenitors-transplanted组。老鼠和祖细胞移植使用TGF -β1 48 h显示四组之间的最低水平(图5 (e))。

3.4。SERPINE1可能调解手持电脑用TGF -预处理的影响β1

我们检查了利用数组EMT PCR基因表达谱和比较EMT基因的相对表达水平的手持电脑接触TGF -β1为12和48 h。EMT的布局基因的PCR阵列如图6(一)。此外,图6 (b)描述了热量地图折叠TGF -之间的表达水平的变化β1-treated祖细胞和对照组。有许多红色和绿色的基因、信号调节和表达下调基因表达的TGF -β1-treated祖细胞。

5倍的基因表达水平的变化表中列出1。84年EMT-focused基因在这个数组,SERPINE1和ITGA5是不同的表达之间的4.5倍未经处理的手持电脑和手持电脑处理TGF -β1 12 h;5倍的差异之间的四种基因表达检测手持电脑处理TGF -β1为12 h和手持电脑处理TGF -β1 48 h。Collagen-1A2、矩阵metalloproteinase-9和WNT11调节,只有SERPINE1似乎表达下调的手持电脑处理TGF -β为48 h(表12)。

实时PCR用于进一步验证的改变水平SERPINE1 PCR检测到数组中。SERPINE1的表达调节的祖细胞治疗TGF -β1 12 h,表达下调的手持电脑处理TGF -β1 48 h,进一步证实了先前的结果在PCR数组(图6 (c))。

3.5。抑制SERPINE1手持电脑的手持电脑预防肝星状细胞的反应

进一步确认的角色SERPINE1祖细胞介导肝星状细胞的反应,我们使用化学抑制剂(pai - 039)块SERPINE1表达确定的反应肝星状细胞祖细胞可以被打断。

我们首先确定最优浓度SERPINE1 kit-8细胞计数分析。与pai - 039治疗≥15μ米24或48小时减少细胞生存能力显著(数据未显示)。因此,我们选择1、5、10μpai - 039测试SERPINE1表达的抑制作用。如数据所示7(一)- - - - - -7 (b)5和10μpai - 039显著抑制SERPINE1表达式剂量依赖性的方式()。

最后,我们研究了抑制SERPINE1是否影响肝星状细胞的祖细胞的响应。如数据所示7 (c)- - - - - -7 (e)pai - 039手持电脑处理有效地阻止肝星状细胞的反应TGF -β1为12 h。这些结果表明,手持电脑很大程度上抑制HSC激活通过SERPINE1-dependent机制。

4所示。讨论

所知甚少的效果在HSC激活和纤维化病理条件下手持电脑。TGF -β1是一个强有力的profibrogenic活化间充质细胞产生的细胞因子在肝损伤。我们假设TGF -的增加产量β1对肝损伤会调节手持电脑的功能,从而影响肝星状细胞的活性的修复受损的肝实质。我们旨在调查潜在的TGF -β1-HPCs-HSCs监管轴。为此,我们cocultured肝星状细胞和手持电脑使用TGF -β1与组装模拟病理环境监管轴在体外。此外,调查TGF -的影响β在肝纤维化1-stimulated手持电脑在活的有机体内手持电脑使用,TGF -β1 CCl移植到老鼠了₄全身的肝纤维化。此外,SERPINE1潜在作用的中介TGF -的影响β1-pretreated手持电脑在HSC活化进行了分析。手持电脑可能函数不同,我们发现,根据手持电脑的时间与TGF -敏化β1,手持电脑可能激活肝星状细胞通过减少SERPINE1表达式。

当前的研究强调有趣但TGF -之间的复杂交互作用β1、手持电脑和肝星状细胞。看来TGF -β1手持电脑影响深远,相反的手持电脑HSC激活和肝纤维化的影响主要是由时间决定的TGF -β1接触,见coculture和移植研究。我们的研究结果表明,短期暴露(12 h)的手持电脑TGF -β1导致HSC数量减少,相应减少肝星状细胞的激活;更重要的是,它阻止纤维化的进展和改善肝功能。(48 h)与此同时,一个相对长时间的曝光导致增加肝星状细胞的激活和肝纤维化恶化。这些研究结果表明,多功能手持电脑的最终目的地和功能依赖于接触或监管TGF -β1,曝光时间似乎起到了决定性的作用在调节职业——或者antifibrogenesis。我们的结果不仅证实了不同影响修复受损肝组织手持电脑,但重要的是所提供的证据必须手持电脑和TGF -链接的功能β1规定。

我们发现TGF -β1可以是一把双刃剑在纤维化的过程。众所周知,TGF -β1是一个多功能的细胞因子的功能依赖于靶细胞结合。它可以规范发展,分化、再生,纤维发生,肿瘤发生和转移18,19]。不同于先前的发现是,TGF -β1甚至可能产生两种截然相反的规定相同的手持电脑在慢性肝病的进展过程。TGF -β1被广泛认为是一个profibrogenic代理在慢性肝损伤,它刺激myofibroblasts产生细胞因子和细胞外基质。压倒性的scar-forming愈合反应会导致失真的肝架构(18- - - - - -20.]。但是更短的TGF -β1刺激的手持电脑可能优先预定手持电脑进入肝细胞的分化可以恢复肝的结构修复组织。因此,TGF -β1有有益的影响。我们也认为TGF -β1信号蛋白质发挥作用在维持细胞的未分化状态和初始分化(21]。伊等人表明,治疗大鼠肝上皮细胞与TGF -β诱导表达的铝青铜(22]。同样,我们之前的研究表明,结缔组织生长因子(CTGF)的下游中介TGF -β1,可以诱导HPC分化成肝细胞(23]。进一步的研究发现,TGF的抑制β-CTGF信号由iloprost轴(CTGF的抑制剂)导致显著减少祖细胞增殖的10]。在肝细胞再生和扩散,TGF -β1有一个重要的tissue-mass-limiting抑制细胞生长的影响和控制炎症通过生成调节性T细胞(24]。考虑到TGF -β5月1日施加antifibrotic活动,一个简单的抑制TGF -β5月1日不是一个明智的方法来减缓和逆转肝纤维化。

周围的微环境是一个重要的行列式HPC的行为。手持电脑不仅参与组织修复通过分化成肝细胞还参与纤维发生。如图8肝损伤发生时,在受伤部位环境充满煽动性的化疗/所释放的细胞因子渗入细胞促进干细胞或祖细胞的招募受伤的网站(25,26]。如果修复主要通过肝细胞、肝脏的原始架构将恢复。然而,当长期肝损伤时,祖细胞的数量减少或细胞没有功能,修复失败。在这种情况下,平衡是倾斜向长期的伤害。细胞疗法应该旨在提供适当的细胞在一个适当的时间和足够的剂量重建修复潜力和能力(27]。吴et al。28)发现WB-F344细胞暴露于低剂量的TGF -β1 18周获得致瘤性。综上所述,周围的微环境是关键元素来控制祖细胞行为和之间的平衡祖细胞活化,增殖,分化。改善微环境时应考虑祖细胞被认为是慢性肝脏疾病的治疗选择。

因为预曝光的手持电脑TGF -β1 12或48 h对HSC激活引起完全不同的影响,我们发现SERPINE1水平升高可能调解HPC抑制HSC激活。纤溶酶原激活物和血纤维蛋白溶酶蛋白水解瀑布在茎细胞的再生有重要作用,因为大多数再生反应与ECM的变化(29日]。•冯•蒙特福特等人发现,CCl纤溶酶原激活物抑制剂1具有保护作用₄全身的肝纤维化小鼠(30.]。因此,调制SERPINE1表达可能有治疗对逆转纤维化过程的影响。

总之,手持电脑TGF -微分的刺激β1 12 h与48 h产生反对反和航道纤维化的影响。我们的结果进一步表明,antifibrotic函数可能是通过调节表达介导的SERPINE1手持电脑。

利益冲突

没有利益冲突声明的作者。

作者的贡献

Ai-Ting杨和香港你参与的概念和设计研究;胡Ai-Ting阳,“豆豆”,Ya-Meng太阳,和赵Wen-Shan执行实验;Ai-Ting杨,平王,Min琮、Tian-Hui刘,张董,和香港你分析数据;Ai-Ting杨Ji-Dong贾,在香港你解释实验结果;Ai-Ting杨和香港你准备数据,起草论文;Ai-Ting杨和香港你编辑和修改。所有作者同意的最终版本。

承认

这项研究得到了国家自然科学基金(81100294,81100294,81270519)。