GDNF提高治疗效率的神经干细胞细胞治疗在慢性实验过敏在老鼠脑脊髓炎

文摘

多发性硬化(MS)是中枢神经系统的自身免疫性疾病。当前immunomodulating药物不能有效防止女士进步神经衰落。神经干细胞(nsc)移植已被证明能促进实验性变应性脑脊髓炎的修复和功能恢复)(实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型对于女士,和胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF)也被发现有能力促进轴突再生和remyelination再生轴突。在目前的研究中,以评估GDNF是否会增强疗效,nsc的实验性自身免疫性脑脊髓炎GDNF基因改性的nsc (GDNF / nsc)和本地nsc移植到每一个10天的大鼠侧脑室和老鼠牺牲在免疫后60天实验性自身免疫性脑脊髓炎。我们发现nsc显著降低临床症状,和GDNF基因修改进一步促进功能恢复。GDNF / nsc更深刻地抑制脑部炎症和提高了髓磷脂与nsc的密度。的生存GDNF / nsc显著高于nsc移植。nsc移植GDNF / nsc,相比之下,分化成神经元和少突胶质细胞。此外,在老鼠少突细胞谱系细胞的信使rna表达GDNF / nsc相比显著增加有nsc的老鼠。这些结果表明,GDNF提高治疗效率。NSCs-based治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎

1。介绍

实验性变应性脑脊髓炎(运算单元),最常用的多发性硬化症(MS)的动物模型,是一种自身免疫性疾病在中枢神经系统(CNS)诱导和由myelin-reactive对髓鞘抗原的T细胞反应(1]。女士,在实验性自身免疫性脑脊髓炎autoreactive从外围组织T细胞迁移到中枢神经系统激活,从而引发炎症级联,导致大量损失髓和髓鞘细胞(寡树突胶质细胞)以及轴突损伤和神经元(2,3]。因为神经干细胞(nsc)有能力分化成各种神经细胞类型(4和myelinogenic潜力5在受伤的地区,他们可能是一个潜在的细胞类型的运算单元替代疗法。然而,较低的存活率(6和少突胶质细胞的分化水平低7)和神经元(8移植后)限制nsc的治疗效果。

神经胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF),一个强有力的神经营养因子,已经证明对各种神经元的神经保护的侮辱(9,10]。此外,GDNF能促进轴突再生和髓鞘形成后脊髓损伤(11- - - - - -13]。我们以前的研究已经表明GDNF基因改性的nsc提供更有效的神经保护老鼠遭受中风比本地nsc [14]。因此,在这里,我们推测,GDNF可能提高治疗效率的nsc。治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎本研究的目的是调查是否GDNF基因改性的nsc比nsc提供更有效的治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎。

2。材料和方法

2.1。nsc的文化和感染

nsc的文化和感染进行如先前所述的研究(14]。简单,细胞悬浮液从新生儿的大脑半球Wistar鼠(近交品系,动物房中心,西南医科大学,四川,中国)被放置在25毫升瓶1×10的密度⁵细胞在无血清DMEM / F12培养基/毫升补充20 ng / mL的表皮生长因子(EGF)、20 ng / mL的碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),和1% N2补充(美国从Gibco)。文化,5 - 7天后neurospheres形成。获得GDNF基因改性的nsc (GDNF / nsc), neurospheres被感染使用GDNF重组腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack CMV-GDNF) 2天。Adeasy-1质粒含有绿色荧光蛋白的基因和病毒的滴度1×10⁹空斑形成单位/毫升。nsc GDNF的表达是通过反向transcriptase-PCR测定感染后2天。引物序列如下:意义,5′-CCGAAGATTATCCTGACC-3′,反义,5′-GTAGCCCAAACCCAAGT-3′,和产品长度是242个基点的片段。标记移植的细胞在活的有机体内、国家安全委员会和GDNF / nsc移植前进行预处理3天了10μ米的5-bromo-2′脱氧尿苷(美国σBrdU)。

2.2。神经分化Neurospheres在体外

诱导nsc和GDNF / nsc分化,neurospheres是坚持盖玻片预镀与poly-L-lysine (10μg / mL,σ)six-well板块在DMEM / F12培养基在缺乏bFGF, EGF和N2补充,但有10%胎牛血清(的边后卫)7天。文化与4%多聚甲醛固定30分钟和孵化与神经元的特定标记microtubule-associated蛋白2 (MAP2 1: 100年,兔子,Abcam,英国),特定标记星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP 1: 100年,兔子,Abcam),和少突细胞特定标记galactocerebroside (Chemicon GalC, 1: 50,兔子,美国)一夜之间在4°C,其次是适当的生物素化的二次抗体(武汉博士德生物技术1:100年,中国)和辣根过氧化物酶(合)链霉亲和素(博士德)30分钟在37°C。免疫反应性与diaminobenzidine可视化(轻拍,博士德)。通过苏木精复染色也执行。消极的控制使用相同的程序没有执行主要抗体。MAP2的比率⁺,GalC⁺,或者GFAP⁺细胞占总细胞量化在每组5地区3盖玻片。

2.3。运算单元归纳和nsc移植

所有动物使用和相关实验经中国科学院批准,中国的公关。运算单元是在女性Wistar鼠诱导豚鼠脊髓匀浆乳化完全弗氏佐剂(CFA,σ)。短暂,Wistar鼠(6 - 8周大,女,西南医科大学)在四个脚架和100毫克注射豚鼠脊髓组织在0.4毫升的PBS乳化与相同体积的CFA补充6毫克/毫升结核分枝杆菌H37Ra(石家庄Weitian科学仪器设备有限公司,有限公司,中国)。在免疫和2天,300 ng百日咳博德特氏菌毒素(Weitian) 0.1毫升PBS皮下注射。老鼠每天监测临床疾病的严重程度。免疫后,临床症状是利用以下量表:0,没有临床症状,1,柔弱的尾巴,2,后腿共济失调,3,后腿瘫痪,4、截瘫,和5,垂死的或死。在诱导后十天实验性自身免疫性脑脊髓炎,老鼠与戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30毫克/公斤),然后被固定在一个立体定向设备(两角™立体定位仪w /老鼠阿特拉斯产品:# 464601,美国)。大量的5×10⁵nsc或GDNF / nsc在10卷μL给每个侧脑室注射一次(前囱起源,L和1.0毫米2.0毫米,5.0毫米)。对照组经历相同的注射10μL盐水到每个侧脑室。

2.4。组织学和免疫组织化学评估

动物牺牲了致命剂量的戊巴比妥钠诱导后60天实验性自身免疫性脑脊髓炎。十五大鼠每组(5)灌注4%多聚甲醛进行组织病理学分析。组织病理学和免疫组织化学评估在6μ各级米厚的石蜡切片(前囱−0.2−1.6毫米)。Hematoxylin-eosin(他)染色法是用来评估炎性浸润。10核或更多聚集在大脑白质或周围血管浸润病变被认为是。估计炎症的程度,浸润和渗透细胞的数量均计算在内。Luxol快速蓝色(局部反馈,σ)染色用于可视化髓鞘和测量参数是集成光密度(IOD)。

BrdU免疫组织化学染色法是用于识别大脑移植细胞。部分与鼠标anti-BrdU孵化(Abcam 1: 200年,英国)在4°C一夜之间;然后山羊anti-mouse免疫球蛋白(武汉博士德生物技术1:100年,中国增加了30分钟的37°C。后碱性磷酸酶-(美联社)链霉亲和素(博士德)孵化为30分钟在37°C, 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl磷酸/氯化氮蓝四唑(BCIP /电视台,博士德)被用作色原10分钟。双标记实验,MAP2、GFAP和GalC被用来识别分化细胞移植的细胞。部分再次孵化与兔子anti-MAP2 (1: 100), GFAP(1: 100),和GalC(1: 50)在4°C一夜之间,和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 100年,博士德)是培养30分钟。辣根过氧化物酶(合)链霉亲和素(博士德)孵化为30分钟,其次是diaminobenzidine(轻拍,博士德)或3-amino-9-ethylcarbazole (AEC,博士德)10分钟发色体。免疫组织化学控制和孵化项目定期进行初级抗体被省略。

髓鞘被评为IOD 3节/动物的胼胝体ImageJ 1.44便士的软件。纹状体中的浸润数在每个大鼠部分。和3字段/纹状体成像,所以6领域双边纹状体成像,计算。Immunopositive细胞数在6领域坐落在双边在3节/动物纹状体。测量是在一个预定义的字段(0.6毫米×0.6毫米)image-pro + 6.0软件。

2.5。(逆转录)- RT - PCR分析

rt - pcr实验,15老鼠每组(5)进行了分析。从大脑组织总RNA制备0.2 - -1.6毫米前囱背后使用试剂盒试剂(美国表达载体)后,制造商的指示。两个μ克是相对地转录成RNA cDNA使用豆类RNA PCR试剂盒(大连豆类生物技术,中国)。反应条件是30°C 10分钟,30分钟42°C, 99°C 5分钟,5分钟和5°C。寡核苷酸作为特定的引物如下:血小板源生长因子α受体(PDGFαR)感觉5′-CCAAATACTCCGACATCC-3′,反义,5′-CCAGAGCAGAACGCCATA-3′, 404个基点片段;GalC感觉5′-CGGTGCCCTTGTTGTTGTG-3′,反义,5′-TGCCGTCTGTTGTTTGTCC-3′, 252个基点片段;髓鞘碱性蛋白(MBP)感觉5′-TTCTTTAGCGGTGACAGGG-3′,反义,5′-GGAGCCGTAGTGGGTAGTT-3′, 156个基点片段;感觉,GAPDH 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,反义,5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′, 450个基点片段。互补脱氧核糖核酸被30个周期放大,放大的参数如下:变性为30秒,94°C;退火30秒,PDGFαR在57°C, GalC 59°C, MBP 55°C,和GAPDH 57°C;扩展了4分钟,在72°C。GAPDH是作为内生控制。PCR产物琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。

2.6。统计分析

所有测量值被表示为平均数±标准差,并使用SPSS统计分析软件,版本17.0。临床评分,多个比较了使用双向重复测量方差分析其次是图基多个成对的期末测验考试。对于其他组织学、免疫染色和PCR分析,多个比较了使用单向方差分析图基的紧随其后事后测试多个成对考试。被认为是显著的差异。

3所示。结果

3.1。nsc的GDNF促进神经元分化在体外

文化,5 - 7天后neurospheres出现(图1(一)神经上皮细胞),它表示特定标记巢蛋白(图1 (b))。他们被GDNF重组腺病毒感染后2天,荧光显微镜下的neurospheres显示绿色荧光(图1 (c))和强烈表达GDNF mRNA(图1 (d))。观察分化,neurospheres镀在盖玻片中含有10%的边后卫没有bFGF, EGF, N2补充7天。细胞特定抗体包括MAP2、GFAP和GalC用于标签分化细胞。nsc相比,MAP2-positive神经元GDNF / nsc的比例显著增加(),而从GDNF / nsc GFAP-positive星形胶质细胞的比例显著下降()。虽然比率的增加GalC-positive寡树突胶质细胞观察GDNF / nsc组nsc相比,它没有达到显著差异()(数据1 (e)- - - - - -1 (k))。

3.2。临床症状的GDNF nsc的加速经济复苏

评估老鼠nsc在实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响,nsc移植到侧脑室前疾病的发作(诱导后第十天实验性自身免疫性脑脊髓炎)。障碍出现在12天后感应控制初始实验性自身免疫性脑脊髓炎老鼠,而细胞移植推迟发病时间,1 - 2天后开始。如图2,老鼠接受nsc和那些接受GDNF / nsc相比降低了临床症状控制大鼠()。此外,GDNF / nsc老鼠改善临床结果相对于nsc集团()。虽然控制老鼠显示改善临床成绩随着时间的推移,有明显的赤字最终随访期间(诱导后60天实验性自身免疫性脑脊髓炎)。老鼠接受nsc恢复正常步态在诱导后50天实验性自身免疫性脑脊髓炎,而老鼠收到GDNF /感应nsc在45天之后恢复实验性自身免疫性脑脊髓炎。

3.3。减少炎症和更多的髓鞘GDNF / nsc nsc相比

炎性浸润和密度老鼠大脑的髓鞘实验性自身免疫性脑脊髓炎评估在诱导后60天实验性自身免疫性脑脊髓炎。大部分浸润位于纹状体相邻纤维,和更少的出现在大脑皮层。纹状体浸润的计算,结果表明,大鼠与盐水浸润显示比老鼠移植)(数据3(一个)- - - - - -3 (d));此外,更少的细胞每渗透在大鼠观察GDNF / nsc相比,老鼠与国家安全委员会()(图3 (e))。saline-injected老鼠显示稀疏和薄髓鞘(图3 (f))。此外,髓鞘被局部反馈染色观察。在我们的设置中,吞噬细胞也由局部反馈染色标记。更多的髓鞘所示颜色强度比控制老鼠在NSC移植,特别是GDNF / NSC移植(),尽管它可能包含吞噬细胞(数字3 (g)- - - - - -3(我))。

3.4。GDNF增强生存和神经元和少突细胞分化nsc移植

移植的细胞检测到BrdU-immunostaining感应后60天在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。的BrdU⁺细胞主要位于发炎区(数字4(一)- - - - - -4 (f)),BrdU的密度⁺细胞每毫米²在老鼠GDNF / nsc相比显著增加大鼠与国家安全委员会()(图4 (g))。的MAP2⁺/ BrdU⁺细胞和GalC⁺/ BrdU⁺细胞在老鼠GDNF /比起老鼠与国家安全委员会(nsc显然是更高);相比之下,GFAP⁺/ BrdU⁺细胞在老鼠GDNF / nsc下降相比,老鼠与国家安全委员会()(图4 (h)),这表明GDNF / nsc分化成神经元和少突胶质细胞但EAE-induced nsc的老鼠相比更少的星形胶质细胞。

3.5。GDNF对少突细胞谱系细胞增加mRNA的表达

PDGF的αR,少突细胞祖细胞的标记,GalC,未成熟和成熟的少突胶质细胞的标记,和MBP,髓鞘少突胶质细胞的标记,用来评估少突细胞谱系细胞移植后。nsc和GDNF / nsc移植显著增加mRNA PDGF的表达αR、GalC和MBP与对照组相比)和GDNF /出现更有效率比国家安全委员会(nsc移植)(数据5(一个)和5 (b))。这些结果表明,oligodendrogenesis和remyelination nsc移植后显著增加,特别是GDNF / nsc移植。

4所示。讨论

我们的研究表明,nsc和GDNF / nsc移植到大鼠与对照组相比显著提高功能受到实验性自身免疫性脑脊髓炎,GDNF / nsc组显示,效果更佳。更多的髓鞘和更少的炎性浸润观察GDNF / nsc组。更多BrdU⁺观察GDNF / nsc BrdU相比⁺nsc等等MAP2 GalC-positive细胞从GDNF / nsc检测而nsc移植。此外,增加了PDGF mRNA的表达αR, GalC, MBP大脑观察GDNF / nsc组相比nsc组。

先前的研究已经报道,nsc移植可以减少EAE-induced中枢神经系统炎症,促进临床改善(15- - - - - -17]。当注入皮下注射,nsc迁移到小鼠淋巴结的实验性自身免疫性脑脊髓炎,他们阻碍了骨髓树突状细胞的激活和稳步克制encephalitogenic T细胞的扩张,因此降低免疫细胞动员从外围17,18]。随后移植系统,nsc进入中枢神经系统血管周的地区和诱导细胞凋亡的血源性CNS-infiltrating encephalitogenic T细胞(7,15,19]。之前的研究表明,nsc移植改善临床症状,减少组织损伤后运算单元,这是有关减少大脑的血管周的浸润和encephalitogenic T细胞(20.]。在这项研究中,我们显示一个更显著减少炎性细胞浸润的数量和大小GDNF / nsc组相比nsc组。这些结果表明,GDNF / nsc更有效地降低浸润炎症细胞,这可能导致治疗效果大于nsc运算单元,而本研究的局限性是控制nsc应该单独感染空病毒载体表达GFP因为细胞分裂可能稀释BrdU标记。

炎症环境不可避免地导致轴突退化和髓鞘脱失,这是与慢性残疾和脑萎缩在先进的女士21]。先前的研究已经表明,nsc移植生成新的神经元和少突细胞谱系细胞替换丢失或退行性细胞,明显促进轴突再生和髓鞘脱失程度的减少16,22]。目前的结果显示,更多的新神经元和少突胶质细胞产生GDNF / nsc移植比nsc移植,至少部分提供remyelination的可能性和可能导致更好的临床康复。此外,在中枢神经系统病理环境下,nsc移植分化为星形胶质细胞,有可能引起反应性胶质增生(23,24]和阻碍内生轴突remyelination [7,13]。在这里,我们表明,GDNF /大脑产生nsc不如nsc星形胶质细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎,这可能有利于remyelination。

PDGFαR, GalC MBP,少突细胞谱系细胞的标记,是强烈减弱(慢性阶段的实验性自身免疫性脑脊髓炎21,25,26]。在这项研究中,细胞移植增加了PDGF mRNA的表达αR, GalC, MBP病变区域在大脑中,高表达GDNF / nsc组相比nsc组。这表明,大量的少突细胞谱系细胞移植后生成,尤其是GDNF / nsc。因此,老鼠GDNF / nsc移植可能拥有更多remyelination程度比老鼠nsc由局部反馈更多的髓鞘染色观察虽然吞噬细胞被包含在这些地区的可能性不能被排除在外。

总之,我们这里显示GDNF / nsc移植大鼠显著促进功能恢复实验性自身免疫性脑脊髓炎,减少大脑炎症浸润,改善髓磷脂的密度,增加神经元和少突细胞谱系细胞的重新,减少nsc的星形胶质细胞分化。这些效应表明,GDNF增强治疗的效率NSCs-based治疗,慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎。提供一个更有前途的方法治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究由四川公共卫生局(没有被授予。100227年),泸州科技局(没有。2013 - 47 (1/20))。

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