文摘

流行病学研究已经确定了高尿酸血作为心血管疾病的独立危险因素。然而,高尿酸血引起动脉粥样硬化机制尚不清楚。这项研究的目的是建立一个新的hyperuricemia-induced动脉粥样硬化大鼠模型。Wistar-Kyoto老鼠被随机分配到一个正常的饮食(ND),高脂肪饮食(HFD),或high-adenine饮食(已经),其次是牺牲4、8、12周后。血清尿酸、血脂水平进行了分析,在主动脉病理变化观察苏木精和伊红染色和mRNA表达被定量实时聚合酶链反应评估。血清尿酸和TC显著增加了小组4周与ND组相比,但没有显著差异之间的血清尿酸ND和HFD组。主动脉钙化发生前和更严重的集团,而HFD组。增殖细胞核抗原,单核细胞趋化因子- 1,细胞间粘附molecule-1,血管细胞粘附molecule-1 mRNA水平增加HFD组相比ND组。这个新的动物模型将是一个有用的工具为研究负责hyperuricemia-induced动脉粥样硬化的机制。

1。介绍

尿酸是嘌呤代谢的最终产物在人类和由尿排出。尿酸酶的损失函数意味着人类和其他灵长类动物都有相对较高的血清尿酸与啮齿动物相比,提供生化依据痛风炎症反应和心血管疾病的风险增加。Gertler et al。1)最初提出的存在尿酸和冠心病之间的复杂的相互作用;1951年从那时起,越来越多的研究证实提高血清尿酸水平与心血管疾病之间的联系。最近的一项荟萃分析的前瞻性研究显示,每增加1 mg / dL的血清尿酸等同于死亡率增加12%的冠心病患者(2]。提高血清尿酸水平与冠心病的风险增加约70%。除了直接的心血管效应,高尿酸血也伴随着发展的风险增加高血压、肾损害、代谢综合征,这间接导致心血管事件的发生或影响心血管疾病的预后和治疗。

然而,相反,一些研究人员认为,缺乏尿酸酶是灵长类动物的进化优势(3,4]。高尿酸血可以帮助稳定血压,尿酸有抗氧化活动(3,5,6]。劳务等。7)报道,尿酸也可以防止细胞外超氧化物歧化酶的退化3,这是一个关键酶维持内皮细胞和血管的功能。心血管疾病患者的血清尿酸的增加可能是一个重要的补偿机制过程中氧化应激疾病(8]。高尿酸血与更好地预测患者的中风或其他神经系统疾病9]。然而,这些观察无法解释为什么高尿酸水平与心血管疾病患者预后较差有关。高尿酸血的有效性作为一个独立的心血管疾病的危险因素仍存在争议。

在这项研究中,我们建立了一个动物模型探讨高尿酸血与动脉粥样硬化之间的关系风险,还研究了特定的分子参与这个过程。结果有重要意义对未来临床治疗策略和高尿酸血和动脉粥样硬化的早期预防。

2。材料和方法

2.1。动物模型

九十名男性Wistar-Kyoto老鼠购自北京大学动物中心,北京,中国。动物实验进行按照指南的原则实验动物护理和保健指南和使用实验动物。老鼠(200 - 220 g)美联储被随机分为三组正常饮食(ND;)、高脂肪饮食(HFD;),或者high-adenine饮食(有;),分别。专营HFD老鼠服用胃内的()。维生素D₃(60 IU /公斤),后跟一个剂量的3天5毫升/公斤脂肪乳剂含有嘧啶(猪肉200克、200克胆固醇,20克胆汁盐、丙硫氧嘧啶和10克、溶解在1 L蒸馏水)每天两次,胃内的政府。老鼠被喂食了饲料含有10%酵母粉和管理腺嘌呤(50毫克/公斤,专营。)和钾oxonate(100毫克/公斤)皮下注射一天两次(上午8点和下午4点)。ND老鼠注射同等体积的生理盐水i.g.和美联储正常饮食。老鼠分别被安置在特定的无菌条件下以恒定温度(20 - 22°C)和湿度(45 - 55%)12 h光暗周期。三组的老鼠牺牲后4、8、12周,分别。

2.2。血清尿酸和脂质测量

最后的实验时间,老鼠禁食至少8 h,然后用10%水合氯醛麻醉。后从右侧颈动脉血液样本得到4 h在室温和离心机在3500 rpm在室温下15分钟。血清分离和尿酸、血脂水平测定使用一个自动分析器(东芝、日本)。

2.3。组织处理、组织学和免疫组织化学

在实验的最后,胸主动脉(从拱到隔膜)是收获,切成两半,在缓冲福尔马林固定或临时冻结。主动脉环嵌入在石蜡和部分被削减时4μm和准备苏木精和伊红染色(他)。免疫组织化学检测增殖细胞核抗原(PCNA)是使用一个执行anti-PCNA主要抗体(1:500)和辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rat Ig二级抗体(1:100)(表达载体、巴塞尔、瑞士)。

2.4。定量实时聚合酶链反应

主动脉总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体)。对于每一个样本,互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript RT试剂盒(豆类,中国)根据制造商的指示。SYBR Green-based聚合酶链反应(PCR)进行自动热循环(Bio-Rad)在最后一个25的体积μL,包含2μ12.5 L cDNA解决方案,μL (SYBR预混料Taq交货(豆类),1μ每个引物(10 Lμ8.5 mol / L)μL (ddH₂o .执行的循环反应是根据制造商的指示通过一个标准的两步PCR。实验被规范化的Ct值β肌动蛋白和相对mRNA表达计算相比,一个参考样本。每个样本运行和分析一式三份。使用的引物的结构表中列出1。

2.5。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差,并分析了单向方差分析后跟Newman-Keuls多重比较适当的测试(GraphPad棱镜版本5软件)。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。血清尿酸和血脂水平的变化

血清尿酸、血脂水平测定在所有组。血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)和低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)升高后的HFD组相比ND组4、8、12周分别在UA水平不变。然而,血清UA水平、TC和高密度脂蛋白胆固醇增加了老鼠。有趣的是,TC水平低的相比HFD组(图1)。此外,死亡率增加了30%有组8周后,与ND组。

3.2。主动脉组织病理学变化

没有主动脉的病理变化和老鼠的实验。然而,泡沫细胞观察后单核细胞浸润的主动脉HFD后大鼠4周的治疗。8周后,大量泡沫细胞形成和核凝结出现在内侧HFD大鼠平滑肌细胞,而钙沉积被发现在在8周大鼠主动脉,在12周更严重。然而,未发现钙沉积HFD大鼠主动脉的12周。玻璃样变性发生HFD和老鼠经过12周的治疗(图2)。

3.3。PCNA表达主动脉

PCNA表达在主动脉被免疫组织化学检查。染色主要是位于内侧平滑肌细胞(图3)和HFD相比的显著增加大鼠(26.3±1.9和31.4±1.4,)。

3.4。单核细胞趋化因子- 1、细胞间粘附Molecule-1和血管细胞粘附在主动脉Molecule-1 mRNA的表达

在老鼠是动脉粥样硬化的特点是显著增加主动脉单核细胞趋化因子- 1 (MCP-1)、细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)和血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1) mRNA和ND组相比,根据实时PCR。然而,upregulation MCP-1低比HFD组。

4所示。讨论

高尿酸血(定义为≥7.0 mg / dL男性个人和≥6.0 mg / dL女性个人)是由合成增加和/或减少尿酸的排泄。尿酸是复杂的规定,相关和高尿酸血也是多种并发症的发展,包括痛风,高脂血症,高血压,心血管疾病10- - - - - -13]。在目前的研究中,我们旨在建立一个hyperuricemia-induced动脉粥样硬化动物模型的喂食老鼠。这导致显著的尿酸,TC,炎症,和钙化,这是已知的与动脉粥样硬化有关,表明该模型可以帮助我们进一步理解,高尿酸血诱发动脉粥样硬化的机制。

啮齿动物拥有尿酸酶尿酸代谢,因此血清尿酸水平低。进一步研究高尿酸血和动脉粥样硬化之间的关系因此需要hyperuricemic动物模型。我们创建了一个鼠模型通过与混合的腺嘌呤饮食喂养,酵母力量,钾oxonate。4周后,大鼠血清TC水平高。血脂异常是动脉粥样硬化的重要生化基础,和脂质积累内外细胞是动脉粥样硬化斑块的病理特征。我们的研究结果表明,小鼠尿酸可能会干扰脂质代谢异常导致脂质水平,这可能会提供一个hyperuricemia-induced动脉粥样硬化的机制。他染色显示,血管平滑肌细胞(VSMCs)受损,最终消失在了大鼠4周后,与泡沫细胞的出现。此外,8周的高尿酸饮食导致扩散的钙盐沉淀的内侧层血管,破坏和纤维化subintimal平滑肌细胞,透明变性,泡沫细胞的出现。值得注意的是,动脉粥样硬化的病理变化特点出现更早,在和HFD老鼠相比变得更加严重。

VSMCs的主要细胞类型之一参与动脉粥样硬化斑块的形成,和过度VSMCs扩散是一个重要的动脉粥样硬化的病理特征。可溶性尿酸已被证明导致扩散VSMCs [14]。在动脉粥样硬化的早期阶段,内侧平滑肌细胞进行内膜过度增殖和迁移,导致内膜的增厚和狭窄的腔。转换、增殖和迁移VSMCs是负责管腔狭窄的基本病理过程15,16]。VSMCs也是细胞因子的重要来源,在维护和放大炎症扩散中发挥主要作用。PCNA-positive细胞的数量可以反映细胞增殖的状态(16),提供了重要指标判断细胞的生物活性和生长状况。在最近的研究中,血管的表面积和厚度的比例(数据没有显示)和PCNA-positive细胞在大鼠高尿酸显著增加。这一结果进一步证实了高尿酸水平的作用在平滑肌细胞的增殖,进而调节内侧血管硬化和动脉粥样硬化的发展。

我们调查了在这些模型大鼠hyperuricemia-induced动脉粥样硬化的可能机制。炎症是动脉粥样硬化的重要机制,尿酸是已知的对血管细胞有促炎的影响。在平滑肌细胞,高尿酸水平诱导MCP-1通过激活转录因子核因子κ- b、增殖蛋白激酶和环氧酶2,虽然表达水平ICAM-1, VCAM-1, P-selectin, E-selectin也增加。我们证明了信使rna表达水平MCP-1, ICAM-1,和在主动脉VCAM-1增加老鼠与控制老鼠相比,基于逆转录PCR(图4)。只有upregulation MCP-1与HFD相比是低的。这些结果表明,高尿酸水平引起的血管损伤和动脉粥样硬化的发展通过upregulation MCP-1 ICAM-1, VCAM-1 mrna。

5。结论

我们建立了一个hyperuricemia-induced动脉粥样硬化动物模型,发现高尿酸血之间没有显著差异,高胆固醇血症导致大鼠动脉粥样硬化。高尿酸水平可能导致动脉粥样硬化通过干扰脂质代谢、促进VSMCs的扩散,并激活的炎症。高尿酸血应被视为一个重要的风险因素对动脉粥样硬化的发生和发展,和治疗高尿酸血代表着一个重要的预防和治疗方式。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

甄刘、陈通和海涛妞妞了同样工作。所有作者期末论文提交和批准同意负责所有方面的工作。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(81500346,81500346,81500346,31471195),山东省科技发展计划项目(2014 gsf118013),山东省自然科学基金(ZR2010HZ001),和青岛的基本应用研究计划(14 - 2 4 - 73 jch)。