克隆异质性在神经元和神经胶质的牙髓干细胞/祖细胞的分化

文摘

细胞异质性的发展提供了一个重要的挑战细胞疗法在可预见的和可复制的结果是一项基本要求。移植牙髓干细胞/祖细胞(DPSCs)展示了早期承诺在脊髓损伤和中风的实验模型,尽管移植后神经和glial-like分化的证据有限。在这里,我们报告,首次对单个细胞衍生的能力克隆小鼠DPSCs区分的文化在体外成不成熟neuronal-like oligodendrocyte-like细胞。重要的是,只有DPSC克隆高巢蛋白mRNA表达水平被发现成功地分化成Map2和NF-positive neuronal-like细胞。神经元分化DPSCs具有膜电容比得上主要培养纹状体神经元和小内voltage-activated K⁺但不是向外Na⁺电流记录显示功能不成熟的表型。同样,只有高nestin-expressing克隆证明它有能力采用通过简单地去除Olig1, Olig2, MBP-positive成熟oligodendrocyte-like表型。在一起,这些结果说明适当的标记可以用来提供一个早期的适用性的细胞群目的分化成特定的谱系可能是有益的,强调进一步理解异质性在混合细胞数量是必需的。

1。介绍

干细胞异质性构成细胞疗法的临床实施的重大障碍。混合的文化可能含有干细胞的组合与广泛的分化潜能和长期增殖能力,以及更多lineage-committed祖细胞。这种变化在细胞在相同的可移植的人口会导致不良表型的采用,可能限制的改善结果。

牙髓干细胞/祖细胞(DPSCs)具有典型的间充质祖属性在体外,证明能够分化成成/成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(1- - - - - -3]。此外,内皮细胞肌原性的、hepatocytic melanocytic分化能力也被报道,表明一个各种各样的潜在的治疗应用4- - - - - -8]。然而,DPSCs代表一个高度异构与不同克隆的细胞增殖和矿化能力的差异(1,9]。这样的变化可能会阻碍发展的进步DPSC-based治疗。然而,移植的种群混合DPSCs已经证明承诺改善功能结果在脊髓损伤实验模型,中风和帕金森病(10- - - - - -15]。这些影响主要是保护和介导通过支持生长因子的释放。迄今为止,不清楚DPSCs可以分化成,功能补偿,移植后神经元和神经胶质细胞类型。在体外啮齿动物和人类的研究表明潜力DPSCs分化成neuronal-like细胞(16]。此外,独立研究描述了这种神经元分化的程度的功能性DPSCs [17- - - - - -21]。然而,只有一小部分细胞在这种文化的发展功能表型(18]。同样的,结果可能在不同的患者样本受到相同的分化协议(22]。理解这种异质性背后的细胞生物学研究人员带来了巨大的挑战。确定一个适当的标记的神经分化能力,事先筛选DPSC文化,可以帮助减少之间的这种可变性研究导致更多的定义和可预测的结果。

在这项研究中,单个细胞衍生克隆鼠种群DPSCs (mDPSCs)孤立和早期神经标记的表达差异识别。只有克隆巢蛋白表达水平较高的被发现分化成成熟neuronal-like细胞,显示最小的电活动。同样,小说差异化协议开发的推导oligodendrocyte-like细胞从高nestin-expressing mDPSC克隆。在一起,这些发现表明,巢蛋白可以作为一个合适的标记用于评估的能力mDPSCs分化成neuronal-like和glial-like细胞在体外。

2。实验程序

2.1。隔离mDPSCs

批准的所有程序都是卡迪夫大学生物标准办公室。对于每个DPSC隔离,切牙髓的组织的4 - 5×21-28-day-old C57 / Bl6老鼠,牺牲的有限公司₂英国动物窒息依照表1(科学程序)法案1986年,汇集。胶原酶/ dispase消化细胞悬浮后,优惠坚持纤连蛋白选择技术用于选择孤立的细胞的祖细胞不成熟的基于表型β1整合素的功能[23,24]。经过12天的主文化,个人殖民地fibronectin-adherent细胞,显示典型的双相fibroblastic-like DPSC形态和编号大于32细胞,克隆隔离和扩张的选择如前所述使用克隆环(25]。克隆DPSCs随后被扩展αMEM补充青霉素100单位/毫升、100μg / mL链霉素,20% (v / v) heat-inactivated胎牛血清(所有从生活技术)和100年μM l-ascorbic酸2-phosphate (Sigma-Aldrich)。细胞计数进行在每个通道,用于追踪文化随着时间的推移,人口倍增: 20至40人口倍增的细胞用于实验。四个人mDPSC克隆扩张足以允许多个复制分化实验用在这项研究中,每个来自一个单独的牙髓的提取()。

2.2。神经元分化

mDPSC克隆被播种在10000个细胞/厘米²poly-d-lysine / laminin-coated文化表面在DMEM / F12(1: 1)含有谷酰胺和消息灵通的缓冲区,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,1×N2补充(所有从生活技术),1×NEAA (Sigma-Aldrich)和20 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和20 ng / mL表皮生长因子(包括从Peprotech)。5天之后,文化清洗与PBS和改变neurobasal中补充了青霉素100单位/毫升、100μg / mL链霉素,2毫米谷酰胺(所有从生活技术),1×NEAA (Sigma-Aldrich)和10 ng / mL脑源性神经营养因子、神经生长因子10 ng / mL, 10 ng / mL neurotrophin-3从Peprotech(所有)。RNA提取天0、5、10和15的分化用于qPCR免疫细胞化学和细胞被固定在15天。

2.3。少突细胞分化

克隆mDPSC文化被播种在10000个细胞/厘米²在DMEM poly-d-lysine-coated文化表面含有青霉素100单位/毫升、100μ(16 g / mL链霉素,佐藤补充μg / mL腐胺,62 ng / mL黄体酮,5 ng / mL亚硒酸钠,和100年μg / mL牛血清白蛋白(BSA)), 50μg / mL holo-Transferrin 5μ从Sigma-Aldrich g / mL胰岛素(所有)和10 ng / mL血小板源生长factor-aa 20 ng / mL bFGF (Peprotech)。10天后分化细胞是免疫细胞化学固定。

2.4。隔离mSTM神经元

小鼠纹状体(mSTM)神经组织解剖在PBS P0老鼠,使用Accutase消化,和镀poly-l-lysine-coated玻璃盖玻片先进DMEM / F-12补充2毫米谷酰胺,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,1.8毫米CaCl₂、0.5毫米/ L丙戊酸和1 x B27-supplement(没有维生素A)(所有从生活技术)。

2.5。逆转录酶聚合酶链反应

总RNA提取使用RNeasy迷你工具与列DNase消化(试剂盒)根据制造商的指示和互补脱氧核糖核酸合成使用MMLV逆转录酶(Promega)。PCR反应是使用GoTaq聚合酶(Promega)和执行特定于产品的引物(补充表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1290561)。RNA提取主要培养E14.5皮层神经干细胞,孤立如前所述[26),作为一个积极的控制。

2.6。实时定量聚合酶链反应

qPCR读数,三个独立实验的互补脱氧核糖核酸样本生成每使用克隆每个测量一式三份)和使用ABI棱镜7000机(先进的生物系统)。有针对性的引物(补充表)被添加到每个cDNA样本一起精密MasterMix火箭和SYBRgreen (PrimerDesign)。解离曲线记录检查特异性的反应和产品在1.4%琼脂糖凝胶电泳,以确认产品尺寸。相对变化的表达式计算使用方法(27]。统计分析使用Graphpad棱镜软件。

2.7。免疫细胞化学

细胞被固定为4% (w / v)多聚甲醛在室温下15分钟和permeabilised 0.1% (v / v)特里同x - 100 10分钟。非特异性抗体绑定被孵化在2% (w / v) BSA 30分钟。细胞孵化一夜之间用以下主要抗体:巢蛋白(Santa Cruz),武藏(生命技术),microtubule-associated蛋白2 (Map2(微孔)),神经丝轻链NF-l (Abcam),通过简单地去除Olig1和Olig2(从微孔),髓鞘碱性蛋白(MBP (Abcam))β肌动蛋白(细胞信号)。第二天,互补Alexa萤石488 - 594 -共轭二次抗体(技术)应用。玻璃盖玻片是安装使用安装媒体补充与DAPI染色(VectorLabs),准备在荧光显微镜下成像。

2.8。膜片钳电生理记录

跨膜电流基本培养mSTM神经元从3天到21岁的文化和mDPSCs神经元分化15天在传统全细胞记录配置。浴的解决方案包含135毫米氯化钠,氯化钾5毫米,1.2毫米MgCl₂,1.25毫米CaCl₂葡萄糖,10毫米,5毫米玫瑰;使用氢氧化钠pH值调整到7.4。吸管的解决方案包含117毫米氯化钾,MgCl 10毫米氯化钠,2毫米₂1毫米CaCl₂,2毫米Na₂ATP, 1毫米Na₂三磷酸鸟苷,11毫米的玫瑰,11毫米乙二醇四乙酸;免费的调整到100海里;pH值与KOH调整到7.2。所有录音进行室温(22±0.5°C)使用一个Axopatch 200 b放大器和Digidata 1320 A / D接口(轴突仪器)。保持电压设置为−70 mV和跨膜电流记录使用电压步协议80 ms的时间在电压范围从120−+ 80 mV。串联电阻和膜电容补偿≈90%。吸管电阻时≈5 - 10 MΩ充满吸管的解决方案。所有录音都过滤与8-pole贝塞尔滤波器在5 kHz和数字化10 kHz。四乙铵氯化物(茶)购买的σ。

2.9。数据分析

膜片箝数据分析使用Clampfit 9.0,微软Office Excel 2003, Microcal起源6.0软件。瞬态内Na⁺提出了电流作为高峰值而向外稳态K⁺电流被当作手段。电流密度(pA / pF)策划反对命令电压(mV)。使用独立的统计方法进行比较以及;差异被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。隔离、扩张和克隆mDPSC文化的描述

牙髓细胞成功地分离和培养的小鼠切牙。隔离一天后,稀疏分布式fibroblastic-like细胞被确定在fibronectin-coated文化表面生长。许多这些迅速扩大无性生殖形成离散的独立的殖民地。克隆被孤立在12天,发现长期扩张,一些达到50 +人口倍增,确认一个高度增殖的表现型(图1(一))。神经祖标记巢蛋白和武藏在扩大克隆利用免疫细胞化学(图确定1 (b))。RNA提取从每个克隆20至40人口倍增和用于rt - pcr标记表达式进一步识别相似四mDPSC克隆和主要培养小鼠神经干细胞(mNSCs)(图1 (c))。mDPSC发现克隆表达一系列的成绩单也表达了nsc包括CD90、SCA1, GLAST, Sox2, Pax6, Myt1l,我,BLBP,武藏,NF-l。然而,标志着克隆差异观察,只有一般的干细胞标记SCA1,神经crest-associated标记我和径向胶质蛋白BLBP所有mDPSC克隆表达的测试。没有发现CD133的表达在任何mDPSC克隆。此外,克隆差异中标识mRNA表达巢蛋白的水平。基于半定量的分析,8 11分离克隆似乎表达巢蛋白mRNA转录水平高于其余3克隆。但是,只有4个克隆继续扩大,允许进一步的提取RNA样本巢蛋白表达的更准确的量化,因此随后被描述在这个研究。qPCR确认1和克隆2每个克隆表达明显高于水平(巢蛋白的记录比两个克隆3和克隆4(图1 (d))。随后,克隆1和2被定义为高nestin-expressing克隆,克隆3和4低nestin-expressing克隆。

3.2。Neuronal-Like分化

mDPSCs通常是bi /三极的和fibroblastic-like形态分化之前。15天的区别后,克隆最初被确定为高水平的巢蛋白mRNA表达采用更neuronal-like表型与多个neurite-like扩展。相反,没有观察到明显的形态学变化在低nestin-expressing克隆(图2(一个))。采用免疫染色的成熟神经元蛋白质Map2 NF-l被确认在高,但并不低,nestin-expressing mDPSC克隆后15天的区别(图2 (b))。信使rna表达的变化早,成熟神经元标记高nestin-expressing克隆超过15天的区别进行了分析使用qPCR(图2 (c))。第五天的分化、mRNA的表达SCA1强烈表达下调表明过渡从默认与mDPSCs间质表型相关。从第五天开始,转移后neutrophin-containing成熟媒介,表达巢蛋白和Map2被增加,表明neuronal-like表型。信使rna表达水平NF-l 15天期间被发现是不变的区别。

膜片箝记录被描述的电生理特性高nestin-expressing mDPSC克隆,之前和之后,15天的区别。主要培养mSTM神经元提供积极的控制比较的目的。只有向外K⁺电流在mDPSCs发现,之前和之后的区别。这些电流与1毫米茶,有效抑制的非选择性阻断剂K⁺通道(数据3(一个)和3 (b))。与此同时,两voltage-activated K⁺和钠⁺电流被记录在P0 mSTM神经元(图3 (c))。电压的+ 80 mV,明显高于K⁺电流密度是记录在P0 mSTM神经元(pA / pF)相比,差异(pA / pF)和神经元分化mDPSCs (pA / pF):和,分别。的电流密度之间没有发现显著差异未分化和神经分化mDPSCs;然而,膜电容变化显著(图3 (d))。分化mDPSCs ()具有显著低于未分化mDPSCs膜参数():。这低电容直接可比p0 mSTM神经元(),没有观察到显著差异()。在一起,这些结果表明,尽管适当的形态,成熟的神经元蛋白质经过15天的分化,和一个类似细胞电容主要培养神经元,高nestin-expressing mDPSC克隆维持一个电生理成熟表型。

3.3。Oligodendrocyte-Like分化

最初10天的区别后,克隆与高水平的巢蛋白被认为采用高度支oligodendrocyte-like形态。尽管一些分支观察,低nestin-expressing克隆基本上未能存活10天的区别(图4(一))。采用免疫染色的髓磷脂碱性蛋白(MBP),通过简单地去除Olig1和Olig2只是观察到高nestin-expressing mDPSC克隆(图4 (b))。oligodendrocyte-associated蛋白质的表达,结合适当的形态,这部小说表明,协议可能被用来推导oligodendrocyte-like表型与高水平的mDPSCs巢蛋白表达。

4所示。讨论

在这项研究中我们发现了异质性的能力单一细胞衍生克隆文化mDPSCs分化成neuronal-like和glial-like细胞。这些克隆拥有最高水平的mRNA表达的神经元progenitor-associated中间丝蛋白,巢蛋白,显示出更大的潜力神经谱系分化。虽然有些变化的证据的神经分化潜力异构DPSC一直先前描述(18,22),我们的研究表明,巢蛋白可以作为一个合适的屏幕DPSC文化的标志在体外之前在神经组织工程应用程序使用。与细胞异质性相关的问题越来越成为干细胞研究领域的认可并获得更全面的理解差异在可移植的人群将帮助任何干细胞疗法的潜力最大化。

分化之前,一系列的表达发育和神经祖标记由单一细胞衍生mDPSC文化与主要mNSCs广泛的分析和比较。尽管mDPSCs发现表达的标记也与国家安全委员会包括Sox2 Pax6, GLAST, BLBP,巢蛋白,和NF-l克隆之间的表达模式是高度可变的,展示的异质性程度的混合种群内存在DPSCs通常用于神经移植研究[10- - - - - -15]。重要的是,只有那些克隆与高水平的巢蛋白mRNA表达显示能够分化成neuronal-like表型细胞形态学及表达水平增加的基础上更成熟的神经元Map2标志。为了测试这些细胞的电生理特性,膜片箝记录。neuronal-like细胞的电特性来源于小鼠DPSCs在很大程度上仍uncharacterised相比人类DPSCs voltage-activated Na⁺和K⁺水流和ATP-activated Ca^{2 +}激增已记录(17,18,20.,21]。在以前唯一使用啮齿动物DPSCs功能研究,混合种群mDPSCs有区别的使用一个既定协议显示voltage-activated Ca^{2 +}但不是K⁺或Na⁺电流,直接反驳录音时相同的协议应用于人类hDPSCs [18,19]。单一细胞衍生的文化高nestin-expressing mDPSCs分化使用本报告中描述的协议,另一方面,显示TEA-sensitive电压门控钾⁺电流,展示功能的存在voltage-activated K⁺渠道在神经元分化啮齿动物DPSCs首次。尽管这些电流的振幅降低mSTM神经元相比,类似的膜参数测量每个细胞类型。这减少电容是指示性的细胞储存电荷的能力直接与主要培养纹状体神经元,确认后neuronal-like表型分化。虽然一个功能齐全的表型与火动作电位的能力尚未源自人类或啮齿动物DPSCs,这里有足够的证据表明高nestin-expressing mDPSCs可能晋升为区分,至少部分,沿着这血统。然而,进一步措施将需要获得一个更成熟的neuronal-like表型和未来研究可能专注于将支持coculture细胞类型提供适当的营养因素支持功能性质的发展和成熟,例如,星形胶质细胞(28,29日]。

Oligodendrocyte-like分化DPSCs只有先前被描述在活的有机体内混合人口后,移植到脊髓损伤的大鼠模型(12]。使用一种新的协议改编自那些用于文化和分化少突细胞祖细胞(信息公开化30.,31日],mDPSC克隆与高水平的巢蛋白mRNA表达了一个高度支oligodendrocyte-like形态和少突细胞呈阳性标记通过简单地去除Olig1 Olig2, MBP。尽管分化mDPSCs MBP的表达,没有观察膜表与成熟的髓鞘寡树突胶质细胞有关在体外(30.,32]。这表明,类似于神经元的分化、高nestin-expressing mDPSCs能够区分部分不成熟premyelinating表型,但进一步分化的步骤可能需要完整的功能。然而,这个协议的发展代表了一个重要的发现,可能提供了一个有用的在体外研究工具为进一步研究机制通过DPSCs可以促进中枢神经系统修复和再生。

不同于骨髓,另一个常见的间充质干细胞来源,牙髓组织nonhaematopoetic和克隆DPSC文化在本质上可能更谱系限制性(9]。他们自然是高度异质化的据称是由多个种群的祖细胞浆的驻留在不同的位置可能拥有不同的增殖和分化能力。不同的细分市场已确定原位与血管相关联,在牙髓的基质,在subodontoblast层和外围nerve-associated胶质细胞(33- - - - - -38]。在开发期间,牙髓和中枢神经系统都源自胚胎外胚层。神经胚形成后,多能的神经嵴细胞迁移距离神经管开发颅面组织。起始的牙齿形态发生,这些细胞填充底层间质,最终导致牙髓的组织的细胞成分(39]。多功能成人DPSCs维持神经嵴干细胞特点和可能代表一种神经元和神经胶质细胞具有更大潜力分化给他们的发育起源被孤立的从不同的细分市场内的果肉(25,38,40,41]。最近的一项研究比较了增殖和分化潜力的人类DPSCs基于pericyte-associated细胞表面抗原CD34的表达(42]。只有CD34⁺hDPSCs发现表达巢蛋白和拥有的能力区分神经元血统,类似于高nestin-expressing mDPSC这里描述,建议他们可能在起源和来源于神经嵴perivascular-associated利基。这可能有利于选择DPSCs未来神经组织工程的研究。

在一起,所给出的结果表明,巢蛋白mRNA水平可能表明潜在的mDPSCs neuronal-like和oligodendrocyte-like分化。巢蛋白表达与干细胞相关发展中神经管以及特定亚型的公开化(43,44]。这样,它链接到mDPSCs神经元和适合oligodendrocyte-like分化能力。然而,nestin-positive细胞只占总数的一小部分牙髓细胞的组成部分,在隔离大鼠切牙(不到3.5%45]。大多数已发表的研究利用这样的混合种群的细胞,所以可能包含很大一部分的其他细胞,也许以前解释不一致的反应神经分化信号(18,22]。无性生殖的使用派生的文化允许在单个细胞水平进行调查和后续识别个体克隆细胞系之间的差异。克隆的增殖和矿化潜力的巨大差异DPSC文化一直以这种方式之前报道(1,9]。同样,neuronal-like和oligodendrocyte-like分化潜力的差异mDPSC克隆报道。使用单一细胞衍生的克隆不太可能治疗适用由于可伸缩性问题在短时间内帧。然而,克隆文化作为一个非常有用的研究工具来识别的细胞内混合种群的属性。在未来的研究中,单个细胞衍生的筛选克隆在大范围内,本报告中描述将进一步了解细胞的异质性及其对干细胞疗法的发展。

5。结论

之间存在显著的异质性克隆mDPSCs和克隆的文化水平相对较高的巢蛋白表达具有分化为神经血统的能力更大。这些发现有助于解释之前的报告只有少量DPSCs采用neuronal-like移植和移植后glial-like表型,以及不一致在体外分化的研究。总之,高nestin-expressing DPSCs可能代表一个更理想的细胞来源促进中枢神经系统的修复和再生。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由欧洲研究理事会StG授予243261年,威康信托基金会授予WT082887,和皇家社会URF奖UF051616 Bing的歌。

补充材料

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