调制的滑膜Fluid-Derived关节内的间充质干细胞,Intraosseous富血小板血浆管理

文摘

本研究的目的是评价关节内的的影响(IA)或关节内的和intraosseous (IO)渗透富血小板血浆(PRP)滑液的细胞内容(SF)的骨关节炎的患者。31名患者接受单一的PRP渗透在IA空间()或在IA空间一起两个IO的渗透,在股骨内侧髁和胫骨的高原()。科幻小说收集之前和之后的一个星期的渗透。科幻小说的存在间充质干细胞(msc),单核细胞,淋巴细胞被流式细胞仪确定和量化。的数量和身份msc被克隆形成和分化分析进一步证实了。PRP渗透到软骨下骨(某人)和IA空间诱导msc在旧金山的人口的减少。这减少了msc被群集型(CFU-F)试验进一步证实。相反,IA渗透独自没有造成任何细胞数量的变化通过流式细胞术或CFU-F化验。骨关节炎的患者的科幻小说包含了人口的msc可以调制的PRP渗透某人隔间。

1。介绍

膝骨关节炎(OA)包含一个集群的退化性关节与不同的生化条件,炎症,和基因签名生成不同的亚型。发展阶段,由此产生的表型影响的严重程度患者的生活质量,是一个经济负担和社会挑战。估计,大约4600万名患者患有OA在发达国家,超过50%的成年人50年;到2030年,这个数字可能达到7000万1]。有必要开发新颖的治疗,减缓或阻止这种疾病的恶化,甚至逆转的损害。目前的治疗如止痛剂、非甾体类抗炎药物,关节内的入渗的类固醇,或者透明质酸只是缓解症状,,在先进的办公自动化的情况下,对这些病人关节置换是唯一的解决方案(2]。

膝关节是一个复杂的生物系统组成的滑液(SF),滑膜(SM)、半月板、韧带、软骨下骨(某人),关节软骨(AC)。交流是一个谎言的无血管的组织功能上夹在SM,生成科幻小说,和某人源自于等离子体的超滤液和软骨细胞的分泌物和synoviocytes,科幻小说是一种粘性液体组成的透明质酸(HA)和lubricin,细胞因子,生长因子,和一个小的细胞。侵略和炎症关节内的组织将增加msc在科幻3,4],它通常被理解为一个组织应对损伤(5,6),相当于迁徙chondrogenic祖细胞的反应从某人受伤的软骨7,8]。虽然msc的来源还没有被确定,最可能的来源可能是SM (4,5肤浅的交流),破裂区,某人(6,9,10]。最近的研究表明,某些分子的增加在病理情况下,如单核细胞趋化蛋白1,SDF-1, TGF -β1可以促进msc的招聘11,12]。

某人一直在OA发病机理方程(13]。有日益认识到某人之间的通信和交流的基础上更改某人经历严重的OA患者,包括微裂隙和结构性缺陷,形成血管的频道,神经生长,逐步替代fibroneurovascular的软骨下骨髓间充质组织(9,10,14,15]。由于膝关节OA的主要驱动力之间尚未建立不同的联合组织,治疗策略仅仅针对一个细胞或组织容易失败16]。因此,方法治疗OA应该旨在达到几个联合组织减少关节炎症的目的,控制疼痛,改善关节功能,恢复组织内稳态。

在新兴治疗膝OA,间充质干细胞(msc)和富血小板血浆(PRP)脱颖而出17),用科学理由PRP治疗膝OA的使用增长。关节内的入渗的PRP已经证明大大减少疼痛患者的膝关节和髋关节OA和改善关节刚度和身体功能(18- - - - - -21]。PRP和许多的生物活性介质包含IGF-I, TGF -β1 HGF PDGF、VEGF、神经生长因子、脑源性神经营养因子,CTGF, bmp, Vitronectin,纤连蛋白,SDF-1, PF4、等,表明积极影响通过chondroprotective联合组织的体内平衡,合成代谢,抗炎和免疫调节作用22- - - - - -26]。还msc具有一个重要的治疗潜力促进再生,源自他们的增殖和multipotential分化特性。msc可能导致新软骨细胞的形成和软骨再生,这一过程已经被观察到在有前途的临床前研究和临床试验(27- - - - - -29日]。然而,仍然有特异性在这个广泛的治疗,需要深入的分析什么更合适的细胞来源,影响治疗效果在体外扩张,和剂量30.]。我们假设针对SM,科幻,交流,和某人内注射和intraosseous (IO)入渗的PRP严重膝OA (31日)会产生更深层次的生物影响膝盖关节组织,因此比传统的更有效的治疗关节内的PRP (IA)的渗透。

2。方法

2.1。治疗组和滑膜液的集合

病人被分成两个形态治疗组;病人的IA形态组一个IA渗透PRP ()和病人的IO集团()处理相结合的一个IA的渗透PRP后跟两个PRP IO入渗的PRP(一个在内侧胫骨平台和一个股骨髁)。两组收到两个IA PRP每周的渗入。科幻收集的31例,之前和之后的第一周PRP治疗。IA的选择或输入输出方式治疗是基于以前的医学治疗的失败;即已面向全膝关节置换的患者作为他们的OA的唯一解IO组分配。

2.2。PRP制剂

体积小36到72毫升的从每个病人外周血提取提取包含3.8%柠檬酸钠抗凝管。离心后580g 8分钟,在无菌条件下等离子体分数被移液分离。在每一个管,剩下的2毫升富含血小板的血浆在红细胞和“巴菲外套”收集,避免拿起白细胞,放在一起(31日]。这个准备的特点是含有2到3倍的浓度与外周血血小板缺乏红细胞和白细胞(发言生物技术研究所、威托利亚-加斯泰兹、西班牙)。

2.3。程序

IA集团8毫升的PRP在关节空间的渗透。渗透之前,21 G针放置到关节空间和科幻小说进行关节穿刺术和收集科幻小说被保存为分析样品预处理。一周后,另一个关节穿刺术治疗后进行了分析科幻小说。病人的镇静的IO集团被注入一个诱导剂量的生理盐水,单剂量咪达唑仑(0.03 - -0.05毫克/公斤),和芬太尼(3.2毫克/公斤),在周围静脉;单个或重复剂量的异丙酚也管理(1 - 2毫克/公斤),依赖于渗透的持续时间。的镇静程度−4或−5在里士满镇静。局部麻醉是由注入2毫升2% mepivacaine髁和胫骨骨膜的高原。作为IA的群体,一个关节穿刺术进行疏散的全部科幻小说是为分析预处理的IO样本组保存。PRP被渗透到关节空间(8毫升)然后给某人的胫骨平台(5毫升)和股骨髁(5毫升),使用一个13 G骨活检套管针手工引入某人;荧光镜的使用促进了套管针位置。 It is worth noting that Sánchez et al. have illustrated visual direct evidence that the intraosseously injected PRP was allocated into the SB [32]。

机构审查委员会批准了这项研究,从每个病人获得知情同意被包括在研究中。

2.4。多维流式细胞术Immunophenotyping (MFC)

约2 - 6毫升arthrocentesis-derived科幻小说的每个病人immunophenotyped使用一个八色直接免疫荧光技术。样品离心后,100年μL集中细胞悬液的染色在室温下15分钟在黑暗中,用以下结合单克隆抗体(摩):灿烂的紫(BV) 421 /橙色chrome (OC) 500 /异硫氰酸荧光素(FITC) /藻红蛋白(PE) / peridinin叶绿素protein-cyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5) / PE-cyanin 7 (PE-Cy7) / allophycocyanin (APC) / APCH7: (i) CD105 / CD45 / CD73 / CD271 / CD34 CD13 / CD90 / CD44。染色后,2毫升的流式细胞仪赖氨酸的解决方案(Becton / Dickinson生物科学,圣何塞,CA)是补充道。5分钟后在室温下孵化,样本顺序离心5分钟,享年540岁100年g和resuspendedμL(预拌Perfect-COUNT微球(Cytognos SL,萨拉曼卡,西班牙)。随后,执行数据采集每管在FACSCantoII大约5000有核细胞流式细胞分析仪(生物科学(BD),正欲圣何塞,CA)使用FACSDiva 6.1软件(BD)。监测仪器性能进行日常使用血细胞计数器设置跟踪(CST;BD)和彩虹8-peak珠子(Spherotech Inc .)、森林湖,IL)激光稳定后,后EuroFlow指南;样本采集系统纵向仪器稳定后进行确认。msc和残余白细胞被确定通过布尔控制策略基于散射,散射,和CD45表达式;单核细胞的基础上定义其相对较高的光散射特性和CD13和CD45明亮的表达式,而淋巴细胞被确定通过低散射特性和强劲CD45反应(图1)。绝对细胞数量每体积单位计算遵循制造商的建议。

2.5。msc隔绝膝关节滑液

收集科幻小说被稀释在磷酸缓冲盐(PBS)和细胞内容然后由离心收获。每个样本的一部分被播种在6-well板在标准的细胞培养条件下与杜尔贝科修改鹰介质(DMEM;Lonza)补充20%胎牛血清(Gibco), 1% penicillin-streptomycin (P / E) (Gibco),和1 ng / mL的人类重组基本成纤维细胞生长因子(bFGF;研发系统)(发展中)。贴壁细胞扩大湿润5%股份有限公司₂气氛在37°C和用于进一步分化实验。剩余的样本用于克隆形成试验(CFU-F)和播种在100毫米直径的培养板。七天后,电镀殖民地可见光和结晶紫染色数0.5%。是建立一个CFU-F包含超过10形态均匀的细胞。

2.6。滑液msc分化

间叶细胞谱系分化进行了化验Muinos-Lopez et al . 2016中描述33]。段落之间的短暂,SF-derived细胞评估2和5证实成骨的,脂肪形成的,chondrogenic能力。成骨的和脂肪形成的差异化,8000细胞/厘米²被播种在12-well盘子。脂肪形成的分化诱导用DMEM补充10%的边后卫,1μM地塞米松、0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine和50μ吲哚美辛21天。成骨分化,细胞在DMEM培养补充10%的边后卫,50μg / mL L -(+)抗坏血酸,10毫米β甘油磷酸,10 nM地塞米松21天。chondrogenic分化,2.55细胞,旋转在聚苯乙烯600×g 10分钟15毫升锥形管和孵化hMSC Chondrogenic分化BulletKit™介质(Lonza)。在28天变异进行了分析。分化化验,消极的控制包括细胞的维持与扩张中(包含10%的边后卫DMEM)没有诱导因素。差异化分析,媒介是改变每2 - 3天。

2.7。组织学和免疫组织化学差异分析

脂肪形成的和成骨分化评估油红O和茜素红染色,分别。脂肪形成的差异化,与4%多聚甲醛固定后(Panreac) 10分钟,细胞60%异丙醇其次是60%溶液清洗油红20分钟揭示细胞内油滴。成骨分化,矿物沉淀了茜素红溶液,2% pH值4.2,在室温下15分钟,用去离子水清洗。Chondrogenic差异化评价了甲苯胺蓝染色和免疫组织化学(包含IHC) II型胶原蛋白。细胞颗粒包括石蜡切片,4μ米厚。甲苯胺蓝,1%(重量/体积)在1%醋酸溶液,用于可视化阴离子glycoconjugates,蛋白聚糖(PG)和粘多糖(呕吐)。包含IHC,部分含水乙醇和年级连续15分钟的治疗受到抗原暴露的透明质酸酶在PBS(4毫克/毫升)和胃蛋白酶在0.01 N(4毫克/毫升盐酸溶液)在37°C。内源性过氧化物酶活性被H₂O₂治疗(3% H₂O₂在PBS)。样本孵化一夜之间在4°C小鼠单克隆反人类的II型胶原蛋白(0.5g / mL;克隆II-4CII议员生物医学)。染色是可视化使用想象与民建联®生色工具包(DAKO)根据制造商的指示。

2.8。统计分析

测定的数据平均值和标准偏差。比较是由Wilcoxon符号秩检测非参数数据和学生的以及对于参数数据,评估样品的正态分布后Shapiro-Wilk测试。数据被认为是具有统计学意义值小于0.05。统计分析了SPSS 17.0 (SPSS,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。病人的特点

病人的平均年龄在IA组年,范围是41 - 77年。骨关节炎患者的等级的百分比II, III和IV根据Ahlback规模分别为50%,35.7%,和14.3%,分别。关于IO组,患者的平均年龄年,范围是41 - 80年。在这个群体中,病人的比例分类为二级Ahlback规模分别为29.4%,47.1%为三级,23.5%为第四等级(表1)。

3.2。细胞的表型特征人口滑液

确定PRP治疗的细胞结构的影响关节,单核的细胞(跨国公司)的存在及其人口分析科幻小说的两个组,治疗前后,流式细胞术,(图中所描述的方法1)。

关于IA集团,跨国公司的浓度,淋巴细胞,单核细胞,msc的科幻治疗前后没有显著差异(表2)。

有趣的是,尽管在IO集团跨国公司的浓度变化,淋巴细胞,单核细胞在科幻小说也不显著,msc IO治疗后明显下降(表3)。

表4显示了细胞的增量(δ)之前和之后的每一个渗透,并比较了两种治疗方法之间的差异。减少msc IO PRP的渗透后观察到的水平高于降低IA治疗后()。

3.3。培养的克隆形成细胞(CFU-F)

确认减少msc在科幻小说,我们评估了msc人口的能力来维持克隆生长在塑料表面(CFU-F)。与流式细胞术结果一致,PRP的IA注入并未导致CFU-F显著变化,治疗前CFU /毫升治疗后(CFU /毫升)(图2(一个))。IO组中,我们发现显著减少CFU-FIO注射前CFU /毫升一周后渗透(CFU /毫升)(图2 (b))。与结果一致的msc、IO渗透后CFU-F水平的降低大于降低IA注射后()。

确认的间充质祖CFU-F细胞出现在科幻小说中,我们执行一个在体外multipotency试验通过向三间叶细胞谱系分化成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞在定义的条件下(图3)。虽然只有数量有限的化验显示trilineage分化能力(7 68化验,10%),大部分的评估显示bilineage滑膜fluid-derived间充质细胞分化能力(51 68,75%),与大多数实验阳性脂肪形成和骨生成血统(97%)、支持间质性质的人口。

4所示。讨论

在这项研究中,我们进行了两种不同治疗方法的PRP在OA患者应用程序。IA组PRP和关节内注射结合腔内和intraosseous注射应用IO组为了解决某人。

IA管理渗透后一周,观察到msc科幻和单核细胞水平降低(表2)。虽然这降低不显著,它可以显示一个PRP的抗炎作用。这一趋势可能是两个PRP IA注射后更为明显,这将符合重要的临床改善桑切斯等人报道和Vaquerizo等人使用三个IA政府每周PRP (19,21]。这种传统方式交付PRP的病人结果liquid-to-gel过渡3 d纤维蛋白支架。纤维蛋白溶解降解支架时,纤维蛋白支架中的生长因子,如IGF-I HGF, PDGF TGF -β1,血小板微粒逐渐被释放。这些生长因子已被证明,促进抗炎巨噬细胞表型(23,34- - - - - -36)和抑制NF -κβ信号通路在滑膜成纤维细胞和软骨细胞的表面区域交流(24)和诱导透明质酸的合成和lubricin synoviocytes和软骨细胞,分别与后者防止软骨细胞凋亡,软骨破坏和抑制的MSC释放和迁移25,37- - - - - -39]。虽然科幻的单核细胞的减少并不显著,这一事实与这些调节和营养的影响关节内注射PRP SM,肤浅的交流,科幻小说可以显示一个较低的水平的促炎细胞因子和恢复关节内稳态导致一个更有利的科幻环境chondrogenic msc分化[30.,37,39,40]。

有关IO,单核细胞和细胞水平也下降,但在这种情况下减少msc的浓度显著(表3)。这也证实当CFU-F的水平进行了分析治疗前后政府(图2 (b))。值得一提的是,之前的msc人口科幻PRP治疗和OA严重程度是相当不同的两组之间。SF-MSCs IA组的水平非常接近人口健康水平,大幅低于IO组。同样,IO组的患者的比例与高级学位的OA(办公自动化等级III和IV) IA组中为70.6%与50%。这两组之间的差异成为类似的应用程序的IO治疗后,这近似msc IA组和健康的人口水平。这观察是依照一些研究SF-MSCs水平与OA的严重程度有关,关节损伤和疾病持续时间(4,34]。

当比较两个治疗组,msc PRP治疗后的下降是IO组(表中更为明显4)。尽管IO组下降可以受到更高层次的MSC在这组在治疗之前,这个更大的减少CFU-F也观察到,在基线组之间的区别并不重要。关节穿刺术在这个细胞下降的影响也必须考虑在内,因为一个星期可能没有足够的骨髓间充质迁移到IA的空间。考虑到SM和肤浅的交流击穿区域假定为主要来源的细胞达到科幻和他们不断浸泡液,似乎可能msc在科幻小说在一个星期4,5,41]。从某人关于msc移植,尽管缺乏临床研究,分析这一过程所需的时间,在体外研究表明这种迁移后20个小时,所以一个星期似乎足够msc从某人到达旧金山42]。

这个观察表明,调制的PRP MSC,某人是一个重要的球员和潜在的组织目标和可能是一个MSC出口点通过渠道和船只违反骨软骨结和软骨,部分被科幻的骨关节炎的环境(9,10,42]。过度的TGF -β1和VEGF在骨关节炎的某人可能变化的驱动因素osteoblast-osteoclast耦合,导致骨重建失衡和fibroneurovascular增长(9,10,12,16]。此外,甄等人表明,通过抑制TGF -β信号在一个特定的人口msc出席了某人(巢蛋白阳性msc) OA的严重程度降低(12]。事实上,之前的研究表明,减少msc在科幻小说,在办公自动化程度低,建议临床改善(4]。合理推测,通过直接管理PRP到某人,并发的platelet-secreted TGF -β1、VEGF和等离子体生长因子如IGF-I和HGF对TGF -有调节作用β信号通路(12,43]。这可能减少msc的存在,可能会与OA某人fibroneurovascular组织的萎缩,解释antifibrotic并行的机制已经报道在几个细胞表型(43,44]。

减少进一步重要组件SF-MSC PRP治疗会引起细胞的过程归航即SF-MSCs可能在本地招募交流参加的受损区域在活的有机体内修复的组织,可能已经报道了李et al。45]。据报道,PRP富含纤连蛋白、血浆蛋白结合到纤维蛋白在自然聚合和网络招聘的主要因素之一,间叶细胞祖细胞(37,46- - - - - -48]。

在我们的研究中另一个有趣的方面是分析科幻msc的合适的来源。使用流式细胞仪分析前治疗,观察msc的存在的科幻在21 31了病人,代表总数的67.7%。msc在这些科幻小说的水平很低msc /μl .然而,使用这种技术来测量新鲜科幻没有之前细胞扩张周期可以代表一个限制由于低数量的细胞(35]。为了克服这个限制,msc的存在在那些科幻小说是评估通过培养在塑料表面来确定群集型细胞(CFU-F)的存在。在这种情况下,CFU-Fs的科幻小说中发现所有的病人,平均价值CFU-F /毫升。这些结果与其他研究报道相一致的可能性使用科幻作为自体msc的来源证明(5,34]。这个细胞获得msc的来源可能是一个有前途的替代治疗相关疾病如OA软骨变性疾病。

必须考虑各种因素在决定最佳的细胞源和良好的环境条件影响(30.]。使用科幻作为细胞来源的优势在其他领域,如骨髓、脂肪组织,最重要的是它很容易访问。关节穿刺术通常是一个必要步骤进行IA注射皮质类固醇之前,透明质酸,或PRP。此外,msc出现在科幻小说可能来自SM,组织参与软骨修复过程(49,50],chondrogenic能力可以增加与其他类型的msc (51]。

这项研究有一些局限性。首先,相对较少的样本分析,没有数据后得到第二和第三入渗的治疗方法,因为许多患者没有出现膝盖肿胀在他们最后一次访问。第二,有困难与滑液,其复杂性和小卷。因此,为了研究炎症细胞因子分析过程无法进行,所以工作主要集中在细胞结构。第三,donor-related变化有关的PRP中血小板源和原生质的增长因素可以解释生物和临床结果的差异。

5。结论

总之,针对不同的膝关节结构如SM,交流,和某人IA和IO入渗的PRP降低炎性环境和msc在科幻小说中。在体外分化的分析OA患者SF-MSCs显示不同等级的multipotency向脂肪细胞,成骨细胞,软骨细胞谱系,虽然bilineage分化能力是最频繁的观察,确认他们的身份。MSC调制产生的PRP可能增加了代理直接在某人,其影响力对OA的发病机制是至关重要的。此外,PRP的使用可能会支持msc治疗效果通过减少促炎的过程出现在OA患者的科幻小说。虽然是有前途的,限制我们的研究是相当大的主体间变异性;因此,一个更大的样本可能需要吸引更多明确的结论。结果鼓励进一步的研究,以进一步揭示细胞和分子机制,阐明PRP应用程序是否在这两个模式可能导致结构联合组织的变化在体外并使用这种疗法临床前研究报告(26,39,52]。最后,将需要进一步的研究来增加我们的知识关于科幻的MSC来源和他们的治疗潜力。

相互竞争的利益

爱德华多Anitua和落羽杉迪拉发言生物技术研究所的科学家,牙科植体公司调查领域的口语移植学和PRGF-Endoret技术。其他作者没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

艾玛Muinos-Lopez和迭戈Delgado同样这项工作。

确认

这项工作是支持由MINECO(经济和竞争力)通过学院祝您健康卡洛斯三世PI13/01633 (Froilan Granero-Molto)并通过GAITEK巴斯克政府项目。作者承认塔尼亚Lopez-Martinez、细胞疗法区域和Purificacion Ripalda-Cemborain,骨科手术和创伤科,为他们的技术支持。

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