文摘
间充质干细胞(msc)导出液已被证明对肾脏有保护作用在缺血/ reperfusion-induced肾损伤。然而,液中的关键部件及其潜在的肾脏保护作用机制不清楚。在我们目前的研究中,我们专注于丰富的蛋白液源自msc (MSC-exo),发现主题趋化因子受体2 (CCR2)表达MSC-exo高能力与其配体结合CCL2。我们还证明了CCR2 high-expressed MSC-exo可以减少自由CCL2的浓度和抑制其功能招募或激活巨噬细胞。此外,击倒CCR2表情MSC-exo极大地废除了这些影响。最后,我们还发现,CCR2击倒受损的保护作用MSC-exo肾缺血/再灌注损伤的老鼠。表达的结果表明,CCR2在炎症调节MSC-exo可能发挥关键作用和肾损伤修复作为诱饵来抑制CCL2活动。我们研究新的材料理解MSC-exo的功能和这些受体蛋白表达在液。
1。介绍
肾I / R (I / R)损伤可能是由于肾移植,主要主要是急性肾损伤(AKI) [1]。尽管先进的医药治疗,阿基仍然是发病率和死亡率的主要原因住院的病人肾移植(2]。虽然已经进行了各种尝试预防或治疗阿基,大部分的这些努力已经取得了有限的成功3- - - - - -5]。阿基仍然是一个巨大威胁患者急性肾I / R损伤。因此,迫切需要找到一个新的、安全的治疗方法,患者急性肾I / R损伤。Macrophage-mediated炎症是一个不变的发现在急性肾I / R损伤(6),是一个关键的初始和加重肾损害的因素7]。肾I / R总是迅速引发一场激烈的炎症反应,炎症细胞招聘、细胞因子生产,一代的自由基和氧化应激8,9]。反过来,这些因素直接参与进一步的I / R损伤后组织损伤(10,11]。因此,抑制炎性反应被认为是关键的保护从急性I / R损伤肾脏。
之前的研究表明,不同来源的间充质干细胞(msc),包括人类脐带血,骨髓,胚胎,胎膜可应用于组织修复,如促进康复阿基引起的各种原因。因为它已经被Camussi博士的研究小组审查,大量注册临床试验提出了使用msc帮助患者肾功能恢复阿基或肾移植后移植肾功能延迟恢复(12]。msc诱导血管生成不仅提高ischemia-related器官功能障碍,也有能力的抗炎和免疫调节衰减I / R-induced组织功能障碍(13- - - - - -15]。最近的研究表明,msc抑制炎症通过旁分泌机制,微泡(MVs)源自msc在该机制中发挥着重要作用(16- - - - - -18]。液中各种类型的MVs,是纳米尺度的细胞外囊泡(直径30 - 100 nm)和CD9是积极的,CD63,和研究,最近被研究得19,20.]。液可以调解信息交流穿梭在正常和病理条件下的蛋白质,信使rna,和小分子核糖核酸21]。根据这些发现,越来越多的研究,目的是进行调查液的功能。阿基液的影响,肝脏损伤,心肌I / R损伤之前已经证明(22- - - - - -24]。然而,影响液的macrophage-related炎症的急性缺血性肾损伤和修复是不清楚。
在当前的研究中,我们发现主题趋化因子受体2 (CCR2)在液浓缩来自小鼠骨髓间充质干细胞。和CCR2报道有关的招聘和激活外周单核细胞/巨噬细胞(25]。本研究的目的是澄清的作用CCR2表情MSC-derived液中巨噬细胞功能和肾脏修复。
2。材料和方法
2.1。动物和细胞
所有的Balb / c小鼠从上海获得线性实验动物有限公司(上海,中国)。应变Balb / c小鼠骨髓间充质干细胞获得使用鼠标从Cyagen生物科学公司和培养间充质干细胞生长培养基(mucmx - 90011, Cyagen生物科学、广州、中国)根据制造商的指示。细胞CD44阳性,CD34本来就和消极,CD117通过流式细胞仪分析和阴性细菌、真菌、支原体。
NIH3T3小鼠成纤维细胞系和巨噬细胞细胞株RAW264.7获得直接从写明ATCC(类型文化收藏委员会、中国科学院)。这些细胞是维持1640年RPMI介质(GIBCO)补充10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,消息灵通的25毫米。所有的细胞系都在文化连续不超过6个月之前的分析。
2.2。液的分离和纯化
根据先前建立液分离和纯化方法(21]。短暂,在中包含exosome-free血清对细胞培养48 h和上层的收集。然后,液被超速离心法分离,然后通过一个0.22μm过滤器。外来体颗粒在1毫升的PBS resuspended,通过BCA与蛋白质含量测量吸光度(热费希尔科学Inc .)和存储在−80°C到使用。
2.3。RNA分离和蛋白质提取
总RNA提取使用试剂盒(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。总蛋白提取使用缓冲区里帕(热费希尔科学)含有蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。蛋白质用BCA量化进行了试验设备(热费希尔科学)。
2.4。RNA转染
siRNAs鸡尾酒为人类CCR2 (si-CCR2)或负控制RNA RNA (NC)设计并合成了上海GenePharma有限公司上海,中国。小干扰rna转染试剂使用人类UMSCs转染Xfect™(美国Clotech)根据制造商的指示。短暂,细胞生长在100毫米板和转染分别与RNA浓度250 pmol /盘子。提取RNA转染后48小时。
2.5。中存在
mRNA分析,生成第一链cDNA使用低聚糖dT和随机引物,和权力SYBR绿色PCR反应混合液(热费希尔科学)是用于实时PCR StepOne +系统(热费希尔科学)。使用底漆表达引物设计程序。所有实验进行了一式三份。
2.6。免疫印迹分析
根据先前建立的免疫印迹分析方法(26]。简单地说,在m /哺乳动物细胞被收集和细胞溶解蛋白质提取试剂(皮尔斯,罗克福德,IL)。所有样本归一化根据蛋白质浓度和分离在10% sds - page凝胶,然后转移到硝化纤维素滤膜(笼罩Corp .)、华盛顿、纽约)使用湿印迹转移系统(Bio-Rad大力神,CA)。以下抗体被用于免疫印迹:anti-CCR1, anti-CCR2(圣克鲁斯生物技术),anti-p-p65 (Abcam)和anti-GAPDH (Abcam)作为内生控制。山羊anti-mouse CCR2从圣克鲁斯生物技术获得的抗体。分析了灰色层次的印迹使用图像软件。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
趋化因子受体的表达水平液检查使用酶联免疫试剂盒(CUSABIO生物技术有限公司,武汉,中国)根据制造商的指示。总之,与标准曲线测定的蛋白质来自已知量,为生产提供的。CCL2绑定的竞争分析,重组鼠标CCL2蛋白质(100 ng / Biolegend,圣地亚哥,CA)是孵化液在不同浓度1小时。然后液exosome-free介质被超速离心法分离。CCL2蛋白质含量中等或液然后由ELISA分析。
2.8。肾缺血/再灌注模型和外来体管理
Babl / c小鼠麻醉乙醚和2%戊巴比妥钠(30毫克/公斤)。然后左肾动脉和静脉闭塞用血管钳60分钟通过弗兰克切口。在移除夹后10分钟,每只小鼠肾囊注射了液解决方案(200μ在20 g液稀释μL PBS)或只有20μL PBS的左肾。然后弗兰克切口是在两层使用4 - 0的针脚缝合关闭。虚假的操作是在类似的方式进行,除了肾血管的夹紧和注入液或PBS。然后老鼠牺牲在第五天的治疗后,收集肾脏病理检查。
2.9。肾组织病理学
一分肾组织的缓冲福尔马林固定在10%其次是嵌入在石蜡和苏木精和伊红染色。额外的部分被用于免疫组织化学评价F4/80(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)作为标记激活巨噬细胞浸润。每个部分是计算在20个随机选择大功率领域(×400)通过光学显微镜(尼康,东京,日本)。形态学研究结果得分(0 - 4、5级)根据沉积,肾小管扩张,肾小管变性,肾小管坏死。两个独立的观察员没有实验设计评估每个部分的知识。
2.10。肾功能检测
血液样本被从腹主动脉或尾静脉评估肾功能。血液尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)使用标准的测量方法和匹配试剂7600年日立分析仪(日立,东京,日本)。
2.11。迁移分析
巨噬细胞细胞迁移试验是根据先前建立的方法27,28]。短暂,Raw264.7细胞悬液(100µL, 106细胞/毫升)加载到上井transwell室(8µ米孔隙大小;美国纽约康宁)和液+ CCL2作为趋化因子在较低的井。板是孵化的37°C - h。然后剩下的细胞在参议院被移除,和膜固定在乙醇和使用吉姆沙染色剂染色。迁移细胞的数量在膜拍摄和量化使用一个倒置显微镜(尼康,东京,日本)。所有化验都至少独立重复三次。
2.12。统计分析
数据被当作平均数±标准差。统计实验组之间比较分析了使用方差分析和学生的以及。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。识别CCR2 MSC-Derived作为一种丰富的功能蛋白液(MSC-exo)
我们首先分析了40多个炎症相关蛋白的表达水平在MSC-exos通过ELISA-based扫描使用NIH3T3-exos作为控制。我们发现MSC-exos特定蛋白质丰富的签名是非常不同于NIH3T3-exos(图1(一))。最不同的表达5蛋白质MSC-exos NIH3T3-exos相比,我们感兴趣的两个主题趋化因子受体蛋白质,主题趋化因子的receptor-1和CCR2 (CCR1)。众所周知这些受体蛋白受体相关的招聘和激活外周单核细胞/巨噬细胞(25]。通过世行分析,我们发现两个受体蛋白高表达MSC-exos和msc、但MSC-exos CCR2更丰富(图1 (b))。和这两个蛋白表达在非常低的水平NIH3T3-exos NIH3T3细胞,表明这些蛋白质MSC-exos特别表示。
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为了进一步揭示这些受体的可能的角色,我们调查是否这些ccr自己表达MSC-exos仍然有他们的配体结合的能力。然后我们孵化不同浓度MSC-exos和NIH3T3-exos中包含CCL2,已知的CCR2配体。使用串行超速离心法液被移除,自由CCL2蛋白质exosome-free中收集的ELISA分析(图1 (c))。我们发现,添加MSC-exos大大减少自由CCL2在中根据液的浓度,但NIH3T3-exos弱得多绑定活动(图1 (d))。这些数据表明CCR2在MSC-exos表达功能和可以强烈结合自由CCL2降低其浓度。
3.2。CCR2击倒MSC-Derived液未能CCL2绑定
进一步验证是否通过CCR2 MSC-exo绑定CCL2蛋白质,然后试图建立CCR2击倒的外来体模型。我们第一次转染骨髓间充质击倒CCR2-specific siRNAs成CCR2在msc的表达水平,然后收集这些msc的条件培养基对外来体方法进行了净化。我们发现siRNAs大大减少CCR2 mRNA水平相比,msc数控RNA-transfected msc(图2(一个))。另外,液源于这些msc明显减少CCR2蛋白表达水平(图2 (b))相比,控制液。因此,我们分析了CCL2绑定这些液使用标记CCL2, NIH3T3-exo作为控制。我们发现CCR2击倒MSC-derived液(si-CCR2 MSC-exos)绑定少得多的CCL2相比数控RNA-transfected MSC-derived液(数控RNA MSC-exos)(图2 (c))。所有这些结果表明CCL2-binding MSC-exos的能力依赖于CCR2表达水平,和si-CCR2 MSC-exos可以作为模型CCR2击倒液在我们未来的研究。
(一)
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3.3。CCR2积极MSC-Derived液抑制巨噬细胞迁移和激活
考虑到CCR2通常表示在单核细胞和巨噬细胞,促进其迁移和活化的细胞外CCL2,因此我们怀疑CCR2积极液可以调节小鼠巨噬细胞功能。体外的分析,我们首先建立了一个transwell模型分析监管职能的MSC-exo CCL2-induced巨噬细胞迁移。通过添加不同的MSC-exos或NIH3T3-exos CCL2-containing介质,我们发现MSC-exo大大抑制小鼠巨噬细胞的迁移与NIH3T3-exo控制。相比之下,si-CCR2 MSC-exos未能抑制巨噬细胞迁移,而数控RNA MSC-exos仍有能力(图3(一个))。这些结果表明,MSC-exos抑制巨噬细胞的CCL2-induced迁移,这种努力是极大地依赖于high-expressed CCR2蛋白质。
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(c)
MSC-exos在CCL2-induced巨噬细胞活化的影响也被研究。CCL2被诱导NF -κB激活和炎症因子表达结扎后CCR2在巨噬细胞。使用中存在的分析,我们发现MSC-exos和数控RNA MSC-exos强烈废除CCL2-induced海拔的炎性因子mrna,等TNFA,白细胞介素6,和IL1B,但si-CCR2 MSC-exos没有这样的效果(图3 (b))。通过白平衡的分析,我们还发现,磷酸化p65 NF -κB (p-p65)显著降低MSC-exos-treated NIH3T3-exos组巨噬细胞相比,虽然si-CCR2 MSC-exos还显示抑制CCL2-induced NF -的能力受损κB激活(图3 (c))。因此,我们建议CCR2-positive液目标CCL2,抑制其功能诱导巨噬细胞迁移和激活。
3.4。CCR2-Positive液源自msc减少I / R-Induced肾损伤
先前的研究显示,CCL2 / CCR2-related巨噬细胞激活中起着关键作用的I / R-induced肾损伤(29日,30.]。澄清的功能CCR2-positive MSC-exos体内,因此我们建立了I / R-induced肾损伤小鼠模型和比较CCR2-positive的影响和CCR2击倒MSC-derived液与NIH3T3细胞或数控RNA-transfected msc的控制。PBS也作为阴性对照组。在I / R手术后1天,我们观察到显著升高血清血尿素氮(BUN)和PBS组肌酐(Cr)水平,随着时间的推移,这些值增加。肾功能明显改善后,从第三天到第五天老鼠MSC-exos或数控RNA MSC-exos对待。然而,面包和Cr水平si-CCR2 MSC-exos NIH-3T3-exos组没有显著的变化比PBS组(图4(一))。病变观察在第五天)肾组织切片的染色。片显示大量的坏死区域近端上皮出现和丰富的管状蛋白质投在si-CCR2形成MSC-exos, PBS, NIH-3T3-exos组;然而,管状病变明显减少MSC-exo和数控RNA MSC-exos组(图4 (b))。我们还研究了巨噬细胞浸润的水平在这些小鼠的肾脏F4/80染色切片。发现MSC-exos和数控RNA MSC-exos治疗I / R后巨噬细胞浸润减少手术,而si-CCR2 MSC-exos NIH-3T3-exos组没有显著的变化比PBS组(图4 (c))。这些结果表明,MSC-derived液可以促进经济复苏的I / R-induced肾损伤通过CCR2-dependent方式。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
肾缺血和再灌注了诱导肾微血管内皮细胞激活和趋化因子的表达升高,它总是调节单核细胞粘附和迁移到受伤组织(31日]。作为一个最重要的趋化因子导致促炎的单核细胞招聘、CCL2及其主要受体CCR2一直被证明是关键因素,调节肾小管损伤肾I / R后,和招聘循环CCR2 +单核细胞进入肾组织中扮演着一个关键的角色在促进管损伤后I / R损伤的研究基于CCR2基因敲除小鼠模型(29日,30.]。在我们目前的研究中,CCR2 MSC-derived液囊被发现丰富,而这些CCR2积极液强烈束缚细胞外CCL2,降低其浓度。因此我们建议CCR2积极液作为诱饵来抑制CCL2函数,然后随后的招聘和激活抑制外周单核细胞/巨噬细胞。CCR2积极液的作用可能会增加我们的理解液来自msc的保护作用,可能提供一个治疗研究的新目标。
众所周知,液可能作为载体组成的脂质双分子层和含有蛋白质和rna。大多数以前的研究已经表明液可以通过转移协调和信息沟通的蛋白质或rna靶细胞(21]。然而,尽管许多细胞表面受体在不同液浓缩,这些受体的生物学功能讨论。在这里我们发现exosomal CCR2蛋白质可以强烈结合CCL2,然后自由CCL2浓度降低。因此我们建议CCR2积极液可能消费函数作为内生CCL2海绵这些配体和阻止他们的生物功能。考虑到大量液用于MSC-exo疗法为基础,我们建议这个函数可能强大到足以抑制内源性细胞因子和其他病理因素和可能发挥关键作用的机制。我们的发现可能也提供了一个模型来理解exosomal表面受体的生物学功能在许多其他领域。
5。结论
在这项研究中,我们发现,膜受体CCR2在MSC-derived浓缩液,而这些CCR2积极液强烈束缚细胞外CCL2,降低其浓度。因此我们建议CCR2积极液作为诱饵来抑制CCL2函数和随后的招聘和激活抑制外周单核细胞/巨噬细胞。CCR2积极液的作用可能会增加我们的理解液来自msc的保护作用,可能肾损伤的治疗研究提供了一种新颖的目标。我们的发现可能也提供了一个模型来理解exosomal表面受体的生物学功能在许多其他领域。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yu Bing沈,刘骏和球迷贡献了概念和设计。Bing沈刘骏贡献发展方法。Bing沈,刘骏,方张,勇王负责采集的数据。Bing沈,燕秦,志华周和健新秋的数据进行分析和解释。Yu Bing沈,刘骏和粉丝负责写作,审查和/或修改的手稿。Yu Bing沈和球迷贡献了行政、技术或材料的支持。Yu Bing沈和风扇进行监督学习。Bing沈,刘骏贡献了同样的工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81470116)和上海科技委员会自然科学基金(批准号14 zr1433200)。