骨髓间充质和Tendon-Derived干细胞移植的研究在大鼠跟腱断裂的再生效果

文摘

比较治疗的意义tendon-derived干细胞(TDSCs)和骨髓间充质干细胞(bmsc)移植治疗跟腱破裂进行了研究。组成的三组SD大鼠24老鼠,被指定为TDSCs bmsc,参与研究了通过morpho-histological再生效果评估和最终的破坏载荷。可能的机制在肌腱修复/再生TDSCs bmsc,我们测量Collagen-I (Col-I),通过rt - pcr Col-III基因表达水平,Tenascin-C通过immunofluorescent分析表达式。TDSCs显示更高的敏捷性肌腱愈合有更好的外观密度和组织良好的纵向纤维结构,尽管bmsc也显示出积极的效果。最初的最终破坏载荷在TDSCs远远高于其他两个学习小组在周1和2,但在4周达到平均或健康肌腱30.2 N的力量。类似高趋势Col-I / III基因表达水平在周1,2,4观察TDSCs治疗组upregulation的1.5倍和1.1倍比其他两个学习小组。Immunofluorescent化验显示更高的表达在TDSCs Tenascin-C星期1,虽然TDSCs和综合治疗组显示CM-Dil-labelled细胞探测到星期4。与bmsc相比,TDSCs显示较高的再生潜力而治疗大鼠跟腱破裂。

1。介绍

约3000万韧带和肌腱损伤全球每年报告由于生活方式、娱乐、工作模式、事故、药理代理人,和退行性生理变量,如性别,年龄,和遗传学1]。解剖研究是深入了解肌腱愈合和再生的关键。肌腱由平行和组织良好的胶原蛋白(Col)包,其中大约90%是Col-I,而其余的10%是Col-III, iv, v和vi (2]。慢性或急性跟腱损伤主要是用保守治疗或手术治疗,前者是仅用于缓解症状,是无效的,耗时的,但后来涉及到使用自体、同种异体,异种移植和修复设备(3,4]。然而,有相当高的风险并发症如感染、神经损伤、附着力和分布式皮肤敏感。因此,它是至关重要的定义等创新技术治疗肌腱损伤。

干细胞是未分化和自我更新的细胞能够分化成不同类型的特殊细胞与特定功能包括生物治疗过程(5,6),包括TDSCs bmsc,脂肪间充质干细胞(AdMSCs)和脐带血液干细胞(UCB-SCs)。TDSCs bmsc具有各种优势和优势等其他许多不同的干细胞类型快速扩散,肌腱修复特异性,减少再生时间和优越的腱形成(7];因此我们使用这两种干细胞类型作为本研究的模型。最近各种研究人员报道,bmsc可能区分给上升到几个结缔组织类型包括骨、软骨、肌腱、肌肉、骨髓,脂肪,真皮8- - - - - -10]。bmsc涉及促进肌腱愈合过程本质上通过加速成纤维细胞增殖和调制的某些生长因子和细胞分裂素(11- - - - - -13]。另一方面,TDSCs成体干细胞驻留在肌腱(14),组织学和生化证明肌腱修复的主要来源(15- - - - - -17]。程和同事证明TDSCs集落形成有很高的潜力而bmsc [18]。还说TDSCs mRNA表达高水平的tenogenic标记- scleraxis (Scx),tenomodulin (Tnmd)和细胞外基质(ECM)成分腱,也就是说,Col-1A1 Col-1A1 / Cl3-A1比率,decorin (宽带运比bmsc)。然而,TDSCs之间比较和综合治疗肌腱损伤尚未完成。我们假设TDSCs更有利于治疗跟腱损伤。

在目前的研究中,我们将TDSCs和bmsc移植到宏观的跟腱破裂区域的外观;histomorphological分析和生物力学强度观察找到修复的可能机制促进和评估两种干细胞的细胞移植影响类型。结果表明,TDSCs展览better-regenerative潜力相比,综合治疗跟腱破裂,可能是一个更好的选择治疗跟腱细胞来源。

2。材料和方法

2.1。道德声明

伦理委员会重庆大学生物工程学院,衣冠楚楚的医院动物实验中心批准使用SD大鼠实验性的协议包括跟腱样本的集合。

2.2。老鼠和治疗组

七十八Sprague-Dawley (SD)雄性老鼠重200 g从dap获得医院动物实验中心(中国重庆)用作接受者或捐赠者。6 SD大鼠,不动手术,tendon-derived来源的干细胞,骨髓间充质干细胞,和健康的跟腱。其余72 SD大鼠用于跟腱愈合实验。老鼠被分为三组:TDSC, BMSC,老鼠和参与组,每组24。这项研究是在三个时间点1周,2周,4周。八个老鼠分配给每个时间点。老鼠被安置在单独的笼子在诽谤喂养系统。

2.3。细胞隔离

六SD大鼠用于分离各种细胞。老鼠与戊巴比妥钠镇静麻醉室。然后,使用3%氟烷在面具,他们牺牲了。股骨和胫骨,包括肌腱附着,解剖。bmsc的SD大鼠隔离使用修改后的程序(18]。简而言之,股骨和胫骨被切除,骨干被削减。骨髓是刷新了DMEM-LG (Gibco)补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。单个细胞悬液是由吸气骨髓生成通过注射器。样本进行清洗和离心机在1000 rpm移除碎片。细胞颗粒resuspended和扩大在湿润孵化器有限公司5%₂和37°C。TDSCs被切除分离大鼠肌腱和PBS冲洗。根据以前的报告[TDSCs被孤立19]。短暂,跟腱被剁碎成小块,与5毫克/毫升的I型胶原酶消化(σ)37°C公司为5%₂了两个小时。未消化的组织被用70毫米尼龙筛,剩下的细胞球低葡萄糖杜尔贝科修改鹰的培养基培养(DMEM Gibco)谷酰胺,10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。12天后,细胞殖民地形成和被选为进一步的文化。100%融合后,细胞被亚文化,媒介是改变每隔两天。对bmsc和TDSCs,通道3 (P3)细胞采用识别。

2.4。细胞识别和Multidifferentiation化验

流式细胞仪是用于确定干细胞表面标记:CD29、CD44, CD90 TDSCs和综合。成骨、脂肪形成的TDSCs chondrogenic分化潜力和综合测试根据以前的报告(19,20.]。感应后,茜素红、油红,甲苯胺蓝染色分析被用来证实成骨、脂肪形成,软骨形成,分别。

2.5。动物模型和外科手术

七十二SD大鼠,重200克,衣冠楚楚的医院和研究所提供的第三军医大学的外科手术。之前的研究中,所有操作和处理程序被批准的医院。老鼠被分为三组:bmsc集团TDSCs集团和参与组,每组24老鼠。从每组三只老鼠在每个时间点进行了测试。的左后腿动物被用于微观/宏观观察而正确的后腿被用于测量基因表达。五大鼠从每组每个时间点被用于生物力学评价。老鼠与戊巴比妥钠麻醉与3%氟烷麻醉室然后面具。在无菌条件下,10毫米左右后肢的纵向切口直接在跟腱(数字1(一)和1(b))。一段从中间部分跟腱是减少使用手术刀片从跟骨插入站点5毫米。临床缝合线被用来缝合切口,碘直接应用(图1(c))。TDSCs和bmsc贴上CM-DiI (C7000,英杰公司),在那之后捐献者TDSCs (1×10⁶/ 0.1毫升DMEM)或bmsc (1×10⁶/ 0.1毫升DMEM)每个老鼠的跟腱周围注射用注射器(图1(d))。在经济复苏期间,老鼠被安置在单独消毒标准下笼子里喂养系统。在每个时间点,老鼠牺牲了乙醚麻醉的剂量。

2.6。宏观评估

在每个时间点,老鼠被牺牲,肉眼观察的治疗腿被移除。再生的外观观察肌腱和比较的参与。

2.7。组织学评价

小白鼠的牺牲,跟骨之间的跟腱和musculotendinous结在每个时间点收获。肌腱沉浸在4% PFA一夜之间,脱水,嵌入最佳切削温度复合(10月)。标本被切成10μ米部分通过冷冻切片机(徕卡CM1900)和苏木精和伊红染色(他)组织学评价。

2.8。生物力学测试

每组五大鼠被用于生物力学测试如下:跟骨之间的跟腱和musculotendinous结切除在1周,2周,4周后切口。跟腱的近端和远端被安全地固定在锯齿状的控制和安装在机械测试机器英斯特朗)(。100 N负载电池容量,跟腱是把以恒定的速度10毫米/分钟直到破裂。数据记录与软件(赢得测试的7)。

2.9。定量聚合酶链反应(RT) (qPCR)

我们检查了Col-III的表达、Col-I GAPDH在每一个时间点。总RNA提取总RNA提取使用工具包(Bioteke公司)根据制造商的指示。RNA受到逆转录互补DNA(互补)使用第一链cDNA工具包(热科学Rt-First链cDNA合成装备,K1622)。PCR条件为5分钟65°C,然后42°C 60分钟,终止在70°C 5分钟。产品储存在80°C。为每个样本总cDNA放大反应混合物的最后一卷包含SsoAdvanced SYBR绿色存在supermix (Bio-Rad编号1725264)现成的反应Col-I鸡尾酒和特定的引物:转发:AAGGTGACAGAGGCATAAAG,相反:GGAAGCTGAAGTCATAACCA Col-III:转发:CATGATGAGCTTTGTGCAAT,相反:CTGCTGTGCCAAAATAAGAG。循环条件是变性在95°C,持续30秒,39个周期在95°C,持续5秒,最佳退火温度为20秒,30秒72°C, 60°C到95°C升温速率为0.1°C / s。排名96实时PCR检测系统(Bio-Rad)是用来记录结果。感兴趣的基因的相对表达水平正常化GAPDH是根据分析方法。

2.10。Immunofluorescent化验

每组的治疗跟腱是收集在星期1和星期4和执行冻结部分。所有的部分都免疫染色Tenascin-C(1: 100年,Abcam)主要抗体,随后Alexa萤石488 dye-labeled二级抗体。DAPI(罗氏)被用来染色细胞核和immunofluorescent显微镜下观察检查细胞移植再生过程。

2.11。统计分析

所有的数据都表示为±标准差。与单向方差分析进行统计分析,其次是LSD检验比较两组(起源实验室起源V 8.0软件)。一个值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。研究干细胞标记TDSCs和bmsc的确认和分化能力

流式细胞术分析是为了确定干细胞。TDSCs和bmsc积极测试他们的CD 29日CD 44岁和CD 90,这表明干细胞表面标记(图2(一个))。它证实了细胞我们从跟腱孤立和骨髓干细胞。Multidifferentiation能力是干细胞的普遍特点之一。差异分析表明,脂肪生成红色(石油),软骨形成(甲苯胺蓝)和骨生成(茜素红)的孤立TDSCs bmsc感应(图后出现2 (b))。因此,基于细胞识别分析的结果,它成为保证分离干细胞TDSCs,伴着。

3.2。Week-Wise宏观评估修复跟腱的形态学变化

皮肤缝合的临床缝合注入TDSCs (1×10⁶/ 0.1毫升DMEM)和/或bmsc (1×10⁶/ 0.1毫升DMEM)使用无菌注射器跟腱。TDSCs和bmsc移植后,出现在治疗区域的变化分析了在周1,2,4后手术。在第一周,缺陷区域出现明显的参与集团(数字3(一)和3(D)),而bmsc集团透露了一些结缔组织在治疗区域(数据3(B)和3(E))。TDSCs组显示增长的一个好的开始在治疗区域(结缔组织的数字3(C)和3(F))。接近一周2、结缔组织的生长发育不良而叛逃的地方区域参与组中是显而易见的,它仍然在星期1(数据3(一)和3(D))。另一方面,综合治疗组出现比第1周组、结缔组织和TDSCs显示最好的增长在治疗区域(数据3(C)和3(F))。

TDSCs集团在4周出现明显不同于其他组,显示一个完整的跟腱正常出现在经历和侧面视图(数字3(C)和3(F))。bmsc组显示明显的结缔组织增长一点横向切口外观明显经历和侧面视图(数字3(B)和3(E))。参与集团没有组织生长(数字3(一)和3(D))。

3.3。生物力学测试

修复跟腱的抗拉强度在各学习小组由最终的破坏载荷测试方法。最终的破坏载荷TDSCs组(10.2 N)远远高于在bmsc (6.7 N)和参与团体在切口后第1周(3.5 N) ()。TDSCs的破坏载荷和bmsc增加1.9倍(^# )和0.9倍(),分别在前高0.5倍变化()。最终的破坏载荷在2周后切口是TDSCs显著提高(23.5 N)比bmsc (16.5 N)和参与(10.8 N)的1.2倍(^# )TDSCs和bmsc组的0.5倍()。的破坏载荷TDSCs超过0.5倍()与综合。在星期4的最终破坏载荷TDSCs集团再次显示值(30.2 N)高于bmsc组(28.45 N)和参与组(25.3 N)。重要的是要注意,在这些三组中,bmsc也高于参与组。然而,没有统计上的明显区别TDSCs和综合。此外,在手术后4周,TDSCs的最终破坏载荷和bmsc接近的健康(图4)。

3.4。跟腱愈合的组织学研究

跟腱的组织学分析部分是经历了苏木精和伊红染色参与集团bmsc集团和TDSCs集团在三个时间点(周1、2和4)(图5)。观察结缔组织TDSCs和综合治疗组在手术后1周。TDSCs集团纵向可见纤维组织已经出现以及其他组织细胞结构未见的两组。在手术后第2周,TDSCs和BMSCs-treated特别是TDSCs-treated肌腱表现出更多的ECM沉积和明显的纵向纤维组织的参与肌腱与更多的纺锤状细胞排列/组织沿纵向(拉伸)轴的肌腱。类似的趋势观察手术后4周TDSCs给出改善肌腱比BSMCs状态,因此TDSCs和BSMCs显示纺锤状形态分布沿纵向纤维组织的肌腱。相反,松散的细胞和薄纵向纤维组织,参与集团开始出现在较高的小组织血管化。为了检查移植,贴上TDSCs切除跟腱,冻结部分被荧光显微镜的准备和分析。CM-DiI阳性细胞(红色)是探测周围的肌腱移植后4周(数字6(一)和6 (b)),这表明这些移植细胞还活着,可能参与再生的过程。

3.5。第三我胶原蛋白和胶原蛋白基因表达分析

检测主机ECM(胶原蛋白)沉积条件下,定量实时PCR进行调查rat-specific Col-I和Col-III(图6(一))。在第一周,TDSCs和bmsc Col-I基因表达水平调节到6.2倍()和4.2倍(),分别。Col-III的水平调节的4.2倍()在TDSCs和2.2倍()bmsc与参与。此外,Col-I的表达和iii TDSCs组高于bmsc组和它显示显著差异()。在手术后第2周,Col-I基因表达水平调节的4.1倍()和2.3倍()在TDSCs bmsc组,分别。此外,在TDSCs和BSMCs Col-III水平调节的2.3倍()和1.2倍(),分别与参与。此外,Col-I的表达和第三高TDSCs组相比bmsc集团和它显示显著差异()。在手术后4周时间,TDSCs Col-I水平高于bmsc;它显示出显著性差异,但只有TDSCs Col-I基因表达水平表现出显著差异,并调节1.5倍()与参与组相比,1.1倍(BMSCs-treated组(图)6(一))。此外,Col-III在所有组表达水平几乎相同(图6(一))。很明显,TDSCs和bmsc促进ECM基因表达的能力。但这里我们观察到TDSCs bmsc相比有更多的灵活性来触发ECM的基因表达和加速肌腱修复许多褶皱。

3.6。Immunofluorescent化验受伤的跟腱TDSCs和bmsc移植紧随其后

免疫荧光染色的组织发现,1周后植入TDSCs和bmsc跟腱受伤,细胞被发现在许多地区的分布CM-Dil标签(图6 (b))。植入后TDSCs和bmsc跟腱受伤,很大一部分与Tenascin-C染色检测在两个治疗组(图6 (b)),TDSCs治疗组小鼠表达Tenascin-C高于bmsc组。此外,4周后植入TDSCs和bmsc仍能够发现CM-Dil标记细胞(图6 (c))。简而言之,结果表明早期postimplantation TDSCs和bmsc可促进Tenascin-C的表达。此外,植入细胞可以存活至少1个月的跟腱损伤和参与肌腱重建。

4所示。讨论

跟腱断裂占大约35%的肌腱损伤由于低血液供应和低肌腱成纤维细胞的细胞代谢活动,除了这些低治疗潜力的肌腱破裂。以前的研究报道TDSCs是immune-privileged同种异体移植细胞有潜力(2,14,16),导致细胞银行和在紧急情况下可以使用。组织再生的速度主要取决于内源性干细胞的增殖和分化产生大量的ECM。据报道,TDSCs有较高集落形成能力,迅速增殖,并拥有一些通用干细胞特征相比,bmsc取决于年龄和干细胞的起源17,19- - - - - -21]。研究还表明,TDSCs mRNA表达高水平的tenogenic标记,scleraxis tenomodulin, ECM组件的肌腱相比bmsc [14,17,22]。通过使用小鼠模型Bi et al。14)发现,bmsc相比,TDSCs有更多的能力来表达Sox9 mRNA水平更高,排版,Runx2,和Scx,而在人类TDSCs表达水平增加tenomodulin (TNMD)相比,人类bmsc。

TDSCs相比bmsc被认为是一种有效的治疗细胞宝藏,积极参与适当的和增强肌肉骨骼修复包括肌腱修复(21,23]。TDSCs显示高chondrogenic潜力和成骨分化bmsc相比,因此在吸引候选人tendon-bone结再生(21]。保持视图的优越性dmsc比其他干细胞系,在我们的研究中,我们选择了两个不同的干细胞,即TDSCs bmsc,并移植到老鼠的跟腱受伤部位。移植后,动物们被允许为4周愈合。宏观外观、组织形态学、生物力学强度被用来评估动物整个愈合过程性能和组织的完整性。在四个星期的实验中,(TDSCs和bmsc)治疗组显示更好的结果比参与组。在早期阶段的再生,TDSCs显示一个提示刺激影响组织重构,在这两个宏观/微观外观和生物力学强度。在移植后的一个星期小变化被观察到;再生组织覆盖地区对待TDSCs和bmsc团体虽然没有可见结缔组织的受伤部位参与组。在两周内,TDSCs更好的宏观/微观外观比其他两组。移植后4周,TDSCs检测到更多的成纤维细胞的细胞的组织学评估存在并行安排行和积极的胶原纤维在治疗区域见TDSCs组(图5),跟腱几乎正常外观(数字显示3(C)和3(F))。

较高的机械强度,可以解释为增加胶原蛋白的生产。更高的机械强度表明,细胞移植促进组织和合成的各种ECM组件负责肌腱组织的结构和功能修复在不同的治疗阶段。最终的破坏载荷TDSCs组显著高于bmsc组和参与的小组。一周,两周,TDSCs迅速改善生物力学强度的早期愈合。然而,四个星期后,最终的破坏载荷TDSCs组仍然显示更好的结果比其他组但没有明显不同。此外,TDSCs和bmsc组显示更高的价值几乎达到健康(图4)。

简而言之,我们认为,细胞移植后,TDSCs第一个适应跟腱破裂的微环境。因为肌腱快速扩散和高亲和力的利基市场,TDSCs可能迅速分化为功能性tenocytes合成更大数量的ECM重塑。

此外,我们探讨修复的可能机制促进细胞移植和测试它通过三个实验,rt - pcr检查胶原蛋白表达,免疫荧光分析Tenascin-C蛋白质表达和CM-Dil来定位干细胞。最初Col-I和Col-III基因的基因表达调节TDSCs和bmsc移植后跟腱,比bmsc TDSCs显示更高的增强效果。我们认为,在短时间内受伤以来,主持人需要大量的细胞集中到伤口。细胞移植后,TDSCs和bmsc很快加入了再生过程,揭示了高胶原蛋白基因表达水平。然而,在4周,bmsc的刺激效果胶原蛋白I型基因表达就不见了。相比之下,TDSCs仍然显示增强的效果,这意味着TDSCs提供持续的刺激胶原蛋白类型我受伤部位的结缔组织的形成。此外,在星期4,所有TDSCs Col-III基因表达的增强,伴着走了。由于复杂的微环境的信号机制四个星期后,Col-III合成可能不会在再生过程中发挥最重要的作用。Col-III的解释可能是更重要的在肌腱愈合的早期阶段,因为它能迅速交联形成和稳定不稳定的维修站点更少所以组织重塑的后期阶段15,22]。

ECM Tenascin-C报道作为一种重要的蛋白质提供弹性的肌肉骨骼组织(15,24]。这个特性是非常重要的退行性和再生过程中正常的生物力学环境的肌肉骨骼组织受到损伤。在我们的研究中,我们发现,在早期阶段,TDSCs和bmsc移植组织可以促进Tenascin-C蛋白质合成在跟腱破裂的位置,甚至前观察比后者高蛋白质表达。

本研究让我们推测干细胞移植促进再生过程,和TDSCs第一微环境中适应跟腱破裂。此外,我们发现CM-Dil标记移植细胞检测到周围的肌腱手术后4周。它可以被移植的细胞还活着并参与肌腱重建过程快速高效bmsc和参与组相比,因此被证明是最好的选择。

5。结论

本研究提供的证据表明,TDSC和BMSC移植可以改善大鼠跟腱破裂的治疗潜力。此外,TDSCs表现出更好的再生潜力相比,综合治疗跟腱破裂和可能是一个更好的替代治疗细胞来源跟腱损伤。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了国家创新和吸引人才项目(“111”项目)(B06023),中国国家自然科学基金(11032012,11032012,30870608),中央大学和基础研究基金(cqdxwl - 2014 - 007)。

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