静脉注射心脏干细胞液改善阿霉素诱导扩张型心肌病的心脏功能障碍

文摘

尽管心脏干细胞的疗效(二者)治疗原发性心肌病,干细胞疗法有很多的局限性。CSC-derived液(CSC-XOs)已被证明负责大部分二者的再生效果。使用阿霉素诱导扩张型心肌病小鼠模型,研究系统的影响提供人类CSC-XOs老鼠。老鼠接受CSC-XOs通过超声心动图显示改善心脏功能,以及细胞凋亡的减少和纤维化。尽管使用免疫活性的老鼠和人类CSC-XOs小鼠没有表现出不良免疫反应。使用CSC-XOs克服的局限性干细胞并改善心脏治疗。

1。介绍

心脏干细胞(二者),如cardiosphere-derived细胞和c - kit (CD117) +细胞,已被证明是一种有效治疗缺血性心脏病(1)临床试验包括克丢西尔斯杖和西皮奥(2,3]。尽管CSC注射的效果,一些局限性仍可能阻碍从实验室过渡到诊所(4,5]。自体注入二者要求病人等待4 - 6周细胞制造完成。虽然同种异体细胞疗法已证明是有效的(6),仍然是一个细胞排斥和炎症的风险。除了兼容性问题,通常需要使用心肌内的细胞疗法(IM)或冠脉内注射(IC),以避免“第一遍效应”中,静脉注射(IV)交付被困在肺部细胞(7)或其他器官如脾(8]。即使使用IM或集成电路注入9),在心脏细胞保留利率可以低至11%和2.6%,分别为(10]。小的人口达到心脏的细胞,这些细胞不能灌输和最终会死6]。

最近的研究表明,大部分的有利影响干细胞疗法来自旁分泌作用[11];注射细胞分泌微泡,蛋白质和小分子核糖核酸,促进内源性再生。这样一个细胞分泌脂质双分子层粒子被称为液(12,13]。液中含有蛋白质和小分子核糖核酸(microrna) [14),可以改变靶细胞的细胞活动。CSC-derived液(CSC-XOs)已被证明再生心脏功能在小鼠心肌梗死模型15,16),然而,CSC-XOs是心肌内的通过一个打开胸腔手术。

之前的研究表明,二者也有效治疗扩张型心肌病(DCM) [17,18]。本研究的目的是测试的有效性静脉CSC-XOs治疗扩张型心肌病。由于外来体的体积小,我们也预计,液不受过度截留在肺部或其他器官,和第四交付将导致安全治疗有效量的液被交付到心脏。最后,通过使用人类CSC-XOs,我们将展示是否异种的注入液产量小鼠的免疫反应。

2。方法

2.1。细胞培养和外来体隔离

心脏干细胞(二者)生成和培养使用cardiosphere方法如前所述[2,15]。总之,通道4 hCSCs培养IMDM中含20%胎牛血清(的边后卫),直到confluency 90%;然后媒介转向无血清Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM)。介质是由二者的15天,然后删除,储存在−80°C等待进一步处理。

对外来体隔离,CSC-conditioned介质是在一夜之间冰慢慢融化;然后使用超滤(液被孤立19]。短暂的10毫升外来体条件培养基是0.22过滤μ真空灭菌过滤器(微孔、Billerica MA)去除大的囊泡和细胞碎片。滤液被添加进Amicon Ultra-15 100 kDa过滤器(微孔,Billerica MA)和旋转4000 g×10分钟。标签使用10了μDiI(生活技术,卡尔斯巴德,CA) 30分钟。滤液被丢弃,滞留物量进行调整与PBS 15毫升。旋转和洗涤与PBS重复两次。在最后一个周期,剩余体积含液(大约1毫升)被转移到微型离心管和储存在−20°C。

2.2。流式细胞术分析

流式细胞仪进行使用LSR-II hCSCs (Beckman-Dickenson,富兰克林湖,新泽西)。数据分析使用FlowJo (Treestar、亚什兰或)。细胞孵化与CD105抗体(fab10971p、研发系统、明尼阿波利斯、MN), CD90 (BD555595、BD、富兰克林湖,新泽西),c - kit (BD550412 BD)和CD45 (BD555482 BD) 60分钟。Isotype-identical抗体(BD559320 BD555748 BD555751, BD)被用作消极的控制。

2.3。外来体特征

外来体大小和浓度测定使用纳米粒子跟踪分析(NTA;NanoSight莫尔文、英国)。10μL的外来体样本稀释到990年μL PBS为NTA达到合适的浓度。样本成像五次90秒和分析。外来体免疫荧光图像被使用(描述方法之前20.]。

2.4。在体外研究

新生大鼠心肌细胞(医疗保险)是孤立的,冻存,然后培养如前所述[214文化幻灯片。培养3天后,培养基与0.7×10补充⁹DiI-labelled hCSC-exosomes,培养一个额外的24小时,然后用4%多聚甲醛固定,储存在−20°C为immunofluorescent染色α-sarcomeric辅肌动蛋白。

2.5。动物研究

所有动物程序批准的机构动物保健和使用委员会。cd - 6-8-week-old雄性老鼠(查尔斯河实验室,威明顿,MA)。5毫克/公斤体重的阿霉素是由腹腔内注射引起扩张型心肌病。老鼠被安置在动物设施为7天,以便完成DCM的感应。小白鼠被注射入200μL PBS或200μ包含30×10 L PBS⁹CSC液通过尾静脉。

2.6。超声心动图

与异氟烷麻醉诱导后,心被成像使用飞利浦cx - 70 L15-7io高频探头超声系统。每个测量进行了几次,然后取平均值。二维引导M-mode图像腱索水平进行评估。M-mode测量左心室舒张和收缩末期维度(LVEDD, LVESD resp)进行利用的前沿方法Echocardiograph的美国社会22]。每个参数的估计,从三个不同的三个测量周期的平均在一个图像。左心室舒张和收缩卷(LVEDV LVESV, resp)计算的双翼飞机磁盘(修改辛普森法则)的方法。射血分数(EF)是由使用(LVEDV−LVESV / LVEDV)×100和部分缩短(FS)计算从M-mode超声心动图图像(LVEDD−LVESD / LVEDD)×100。

2.7。心脏组织学

牺牲后,心被移除,外侧平分,平衡和增加蔗糖30%隔夜的解决方案。心被嵌入在最佳切削温度(10月)化合物(Tissue-Tek托兰斯,CA) snap-frozen在液态氮,然后cryosectioned厚度为5μm。

苏木精和伊红染色(圆))进行了使用传统方法和化学物质(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。马森的三色的染色使用HT15执行三色的染色(马森)工具包(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。心脏部分被固定在4%多聚甲醛溶液,permeabilized 0.01%皂苷(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),并使用蛋白质块阻塞(Dako、斯特鲁普、丹麦)的解决方案。一夜之间,主要的抗体被孵化在4°C,随后二次抗体室温为1.5小时。部分采用TUNEL(罗氏、巴塞尔、瑞士)孵化后30分钟二次抗体孵化。样本然后用DAPI (LifeTech,卡尔斯巴德,CA)和安装在延长黄金安装媒体(LifeTech,卡尔斯巴德,CA)。

2.8。统计分析

所有统计分析使用Graphpad棱镜(Graphpad软件,拉霍亚,CA)。双面的测试进行了分析。被认为是显著的,表示有一个星号,代表标准偏差和错误酒吧。比较两组使用学生的进行以及,对比两组多使用双向方差分析之后进行事后比较Bonferonni修正。

3所示。结果与讨论

3.1。细胞表型,外来体特征,在体外研究

显微分析(图1(一))和流式细胞术(图1 (b))确认的形态和表型cardiosphere-derived二者(2,23,24]。为了确认孤立粒子液而不是其他细胞分泌物如微泡或凋亡的身体,我们检查的大小和表达本构exosomal标记。exosomal标记CD63表达的孤立的粒子(图2(一个))。在显微镜下观察到出现大小大于预期;这可以归因于外来体凝结或由于液的大小小于显微镜的横向分辨率。NTA证实液的大小(小于200纳米)(数据2 (b)和2 (c)),确认他们确实液。由于超滤方法用于外来体净化,可能有污染与蛋白质100 kDa,尽管其他的隔离方法,如超速离心法或聚合物沉淀导致蛋白质污染(25]。当DiI-labeled液添加到媒体基本医疗,他们容易被细胞吸收(图3)。心肌细胞的吸收CSC-XO的认股权证可能使用他们在扩张型心肌病治疗再生。

3.2。IV-Delivered CSC-XOs促进心脏功能的恢复

阿霉素诱导DCM的急性模型用于动物实验(图4(一))。七天与阿霉素注射小鼠后,心脏功能明显减少从基线测量。动物们接受CSC-XO治疗心脏功能(数据显示复苏4 (b)和4 (c)而动物接收盐水注射继续心脏功能恶化。在之前研究德等。17)进行了类似的研究,但有几个关键的不同。我移植G的疾控中心进行了测试α问老鼠,自发发展扩张型心肌病。结果显示稳定尽管心脏功能下降与当前的研究显示心脏功能的恢复到基线水平。此外,IM注射相当入侵因为胸腔手术通常需要,因此很难对临床翻译。

3.3。CSC-XOs减少细胞凋亡和纤维化的心脏

为了验证疾病修饰变化发生在细胞水平上,我们进行了组织学分析心脏的部分。hCSC-XOs已被证实携带microrna(22日,24日,146年和210年),减少纤维化通过抑制TGF -β信号通路(15和减少细胞凋亡16]。与TUNEL检测细胞凋亡进行了,显示显著减少CSC-XO治疗心(图5)。随后,我们通过Ki67检测细胞增殖。两组有很多细胞(~ 23 /高通滤波器),但两组之间没有显著差异(图6),表明CSC-XO没有促进心肌细胞循环。DCM并诱发大量的心脏纤维化的增长,减少收缩性和功能。马森的三色的染色显示CSC-XO治疗减少心脏纤维化(图7)。以前的研究已经表明CSC-XO富含多种小分子核糖核酸可以抑制细胞凋亡和mi后心脏纤维化通路。

3.4。异种的CSC-XOs诱导免疫反应最小

使用圆)染色,几乎没有渗透动物接受人类所示液对照组相比(图8),这表明CSC-XO没有引起明显的免疫反应。缺乏免疫反应异基因的翻译表明,使用同种异体移植的人类是非常可能的。尽管缺乏免疫反应在心脏,其他器官没有检查任何免疫反应。未来的研究需要检查其他器官和系统免疫反应以同种异体的外来体疗法。不过,如果同种异体移植是安全的,它允许液收集从控制细胞系已知的稳定产生治疗液,以及允许液被拉的架子”对急性心脏事件。

4所示。结论

研究证实CSC-XOs能够再生心脏功能在非缺血型扩张型心肌病等疾病。此外,我们表明,静脉液是有效的,这减少了外来体交付的侵袭性降到最低。最后,我们验证了异种的注入CSC-XOs缺乏免疫反应。这个结果本研究验证CSC-XOs是有效治疗扩张型心肌病。CSC-XOs为临床治疗提供巨大的希望减轻许多干细胞疗法的局限性,如交付和存储。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

亚当·c·Vandergriff和詹姆斯Bizetto梅拉德安德拉德平等对本文的贡献。

确认

本研究从美国心脏协会支持的资金,国家卫生研究所,NC州立大学校长教师卓越项目NC州立大学比较医学和转化研究中心和中国国家自然科学基金委H020381370216。支持詹姆斯Bizetto梅拉德安德拉德CNPq(蹂躏Nacional de Desenvolvimento尽管如此),巴西。Junnan唐家璇支持中国奖学金委员会。

引用

1. m . Kreke r . r .史密斯,l . Marban和e . Marban”Cardiospheres和cardiosphere-derived细胞治疗心肌梗死后,代理”心血管治疗的专家审查,10卷,不。9日,第1194 - 1185页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. r·r·Makkar医生r . r .史密斯,k . Cheng et al .,“内cardiosphere-derived细胞心肌梗死后心脏再生(墨丘利的节):一个前瞻性随机第一阶段试验,”《柳叶刀》,卷379,不。9819年,第904 - 895页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. a . r .丘格g . m . Beache j . h . Loughran et al .,“政府在缺血性心肌病患者心脏干细胞:西皮奥试验:外科方面和临时磁共振心肌功能和可行性的分析,“循环,卷126,不。11日,补充1,S54-S64, 2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 大肠Chavakis,森野奎m和s . Dimmeler”增强细胞治疗心脏修复的结果:从基础研究到临床应用进展,”循环,卷121,不。2、325 - 335年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. e . Marban h·c·曹,e . Cingolani”细胞,细胞疗法”,美国心脏病学会杂志》上,60卷,不。17日,第1708 - 1707页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. k . Malliaras t·s·艾。李,d . Luthringer et al .,“同种异体细胞疗法的安全性和有效性梗塞的老鼠与不匹配的cardiosphere-derived细胞移植,”循环,卷125,不。1,第112 - 100页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 美国m·菲舍尔m . t .德国哈丁f·希门尼斯et al .,“肺段是静脉注射干细胞交付的主要障碍:肺初步的效果,”干细胞与发展,18卷,不。5,683 - 691年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. a·库尔茨“间充质干细胞运送路线和命运,”国际干细胞杂志》上,1卷,不。1、1 - 7,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. a . Al Kindi y通用电气、d . Shum-Tim和r . C.-J。赵,“细胞cardiomyoplasty:路线的细胞交付和保留,“生命科学前沿,13卷,不。7,2421 - 2434年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. d .侯,大肠其子a.s.。优素福,et al ., t·j··布”放射性标记的细胞在心肌内的分布、冠脉内和间质冠状静脉逆行交付:对当前的临床试验,”循环卷。112年,补充,不。9日,I150-I156, 2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. m . Stastna i奇门蒂、大肠Marban和j·e·范Eyk”鉴定和功能分泌蛋白质组的大鼠心脏干细胞和新生儿心肌细胞,”蛋白质组学,10卷,不。2、245 - 253年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 一个。Kittel, a . Falus和大肠Buzas微型胶囊技术自然:细胞衍生细胞外囊泡与治疗的潜力,”欧洲微生物学和免疫学杂志》上,3卷,不。2、91 - 96年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. g . Raposo和w . Stoorvogel细胞外囊泡:液、微泡和朋友,”细胞生物学杂志,卷200,不。4、373 - 383年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r . Crescitelli c·拉瑟·t·g·萨博et al .,“不同的RNA在细胞外囊泡的亚种群:凋亡的身体,微泡液,”《细胞外囊泡,卷2,页1 - 10,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 答:G.-E。易卜拉欣,k . Cheng和大肠Marban液是引发心脏再生细胞疗法的关键人员,“干细胞的报道,卷2,不。5,606 - 619年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. l . Barile Lionetti诉,大肠Cervio et al .,“细胞外囊泡fromhuman心脏祖细胞抑制心肌细胞凋亡,改善心脏功能aftermyocardial梗塞,”心血管研究,卷103,不。4、530 - 541年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. m·a·德·e·Tseliou, b .太阳et al .,“cardiosphere-derived细胞治疗效果的转基因小鼠模型non-ischaemic扩张型心肌病,”欧洲心脏杂志》上,36卷,不。12日,第762 - 751页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. m·t·汉斯莱j·德安德拉德,b·基恩et al .,“心脏的再生潜力cardiosphere-derived细胞从成年狗心推导和犬类疾病预防控制中心的文化,“细胞和分子医学杂志》上,20卷,不。10、1 - 9,2015页。视图:谷歌学术搜索
19. a . Cappione古铁雷斯,m . Mabuchi j·史密斯,Strug, t·纳德勒,微泡的离心浓缩Ultrafiltration-Based方法,Billerica EMD微孔质量,美国,2014年。
20. t一,制造t·冈田克也米亚,l . Zhang和siv。中村”,不断激活的鞘氨醇1-phosphate受体介导的成熟exosomal多泡核内体,“自然通讯第2712条,卷。4日,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. a·c·Vandergriff m·t·汉斯莱,k . Cheng“隔离和新生大鼠心肌细胞的冷冻保存,”《可视化实验,没有。98年,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. n . b . Schiller, p . m .沙·m·克劳福德et al .,“建议定量左心室的二维超声心动图。美国超声心动图学会标准委员会小组委员会在二维超声心动图定量。”美国超声心动图学会杂志》上,卷2,不。5,358 - 367年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. r . r .史密斯,l . Barile h·c·曹et al .,“cardiosphere-derived细胞的再生潜力扩大从经皮endomyocardial活检标本,”循环,卷115,不。7,896 - 908年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. k . Cheng a·易卜拉欣·m·t·汉斯莱et al .,“相对角色CD90和c - kit cardiosphere-derived细胞的再生功效在人类和小鼠模型的心肌梗死,”美国心脏协会杂志》上,3卷,不。5篇文章ID e001260 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m·纳瓦兹·g . Camussi h . Valadi et al .,“细胞外囊泡的新兴角色作为泌尿生殖癌症生物标记,”自然评论泌尿外科,11卷,不。12日,第701 - 688页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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