文摘
当克利福德Grobstein着手研究归纳胚胎组织之间的互动发展中,他发明了一种方法,它仍然是重要的研究肾发展直到现在。从1950年代末起,在体外后肾的肾成为标准方法的培养。它提供了一个人工环境,作为一个开放的平台来研究器官形成。本文介绍器官培养的方法,描述了Grobstein如何测定及其变体间叶细胞诱导的用于研究方面,并描述了寻找天然和化学诱导物的后肾间质。审查也侧重于肾发展,从异位输尿管的芽的萌芽,输尿管的芽分支,肾元的生成,提出了寻找干细胞和肾祖细胞,导致特定结构和在肾组织的发展。它还介绍了当前使用Grobstein分析及其在再生医学和组织工程今天修改。在一起,本文强调的重要性体外肾的研究来获得新知识,将来可以并将再生医学发育生物学和应用程序的实现。
1。介绍
肾脏从次区域的胚胎中胚层组织开发,中间产生两个关键的细胞类型中胚层,epithelial-ureteric巴德(乌兰巴托),mesenchymal-metanephric间质(MM)。互惠乌兰巴托和毫米之间的相互作用,通过连续感应信号级联,调节肾脏的复杂组织的形成。乌兰巴托产生收集系统,而MM引起肾单位,肾脏的主要功能部件。肾的肾元由corpuscle-the肾小球,近端小管,亨利循环,和远端小管。后者连接肾单位和集合管系统。
研究器官的细胞机制发展,科学家们一直在培养器官自1930年代初以来,使用方法等挂滴或表面玻璃文化(1]。特劳尔在1954年改变了,那么常见,机关文化,介绍了金属网格的方法支持药棉表或滤泡在了器官生长的培养基介质和空气的间期(2]。然而,“肾脏器官培养孩子的父亲,”Clifford Grobstein,发达的基本方法研究肾小管感应。尽管抹子在多年来的技术已得到改进,它打开了一个新的维度研究器官发生(见图转换的方法1(见图),反映了新兴研究趋势2)。同样值得注意的是,肾脏organoculture的发展提供了一个人工环境,可以很容易地控制,使文化的准确操作条件,大大促进了肾的领域发展。本综述的目的是不给发展和分子过程,详细描述了其他地方,但是提供一个简短的,然而,包容,总结进展肾脏发育生物学领域的基础上体外/体外肾脏的文化模式。
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2。间质能力和归纳
在20世纪初,唯一可用的外植体培养嫁接技术研究开发。胚胎诱导,定义组织的发育影响或一组细胞在相邻组织或细胞,在几个胚胎研究模型。例如,Spemann将一小块背原口唇移植到另一个胚胎的腹侧网站相同的年龄和观察到宿主胚胎发展第二个神经板但位于腹侧的网站(3]。从这个关键的实验中,他得出的结论是,发展的模式是影响细胞的活动互相靠近。随后他叫blastoporal唇初级电感器(3),后来重新命名Spemann的组织者(4]。类似于两栖动物,初级电感器还确定了其他脊椎动物:爬行动物、鸟类和哺乳动物,并被命名为“原条“(5,6]。主感应过程导致的发展三个胚胎胚芽层。器官形成被认为代表一个二次感应过程(7,8],它主要发生在上皮和间质组织之间。胚胎诱导后来发现是一个通用的过程在动物王国9]。许多跨物种移植也被执行。基于组织的结合分析,归纳过程被归类为指导,它描述了两个组织的依赖对方的信号适当发展或宽容,当一个组织已经承诺和其他组织的存在仅仅是允许的完成其分化(9,10]。类似于其他器官,如牙齿、肝脏,胰腺,二次感应是一种现象,也控制肾脏发展。
当Grobstein解剖老鼠肾脏萌芽在一天胚胎(E) 11.0和分离uninduced MM上皮结构的乌兰巴托,他可以证明无论是毫米还是乌兰巴托发达(11]。然而,当整个肾脏的雏形是讲究的,“正常”的形态发生持续,这表明肾脏具有基于程序从E11.5足以推动器官发生鼠标。此外,从E11.5阶段,MM已成为致力于开发肾脏结构和许多胚胎组织,如胚胎脊髓(eSC),足以引起它(12(参见表1)。这表明nephrogenesis的感应一个宽容而不是有益的角色。然而,尽管肾MM主管应对感应信号从几个胚胎组织(见表1),有能力定义窗口中发育程序需要被激活(13]。扩展preculturing MM之前接触诱导eSC的负面影响。MM是胜任感应信号在有限的时间内隔离和响应诱导后随着时间的推移变得较弱(13]。直到今天,MM细胞培养持续时间是不可能的,虽然生长因子,例如骨形态形成蛋白7 (Bmp7)和纤维母细胞生长因子2 (FGF2),可以扩展MM能力长达48小时(14),但即使这样,基质细胞似乎更快扩张。一个文化的协议,它保留了MM属性和能力在扩展文化,以及感应的方法来恢复竞争力,将是一个突破。它将允许传播文化的细胞,从而限制了细胞分离所需的动物数量。帮助建立新的文化协议主管MM可能来自最近的兄弟和基因敲除研究。正弦oculis-related同源框2 (Six2)是诱导毫米表示,它已被证明,Six2后代细胞有可能从远端小管形成肾单位的所有部分肾小球(15]。Six2还负责维护肾元祖细胞,因为Six2突变体异位和过早nephrogenesis,以及快速疲惫的祖细胞(16]。有趣的是,在老鼠Forkhead盒D1 (FoxD1)摧毁了基质的细胞群,Six2 +细胞大大扩展了(17,18]。有人建议,基质FoxD1 +细胞调节Six2自我更新通过河马,BMP-SMAD信号通路(17,18]。还需要更多的研究来测试如果Six2 + MM细胞属性可以在维护在体外文化因素,允许这些通路的选择性抑制作用,单独或合并使用。
2.1。自然MM诱导物
eSC后被证明能有效地诱导MM,它取代了乌兰巴托电感在后续实验。这启动了肾脏感应的搜索机制。eSC、大脑和其他间充质组织胚胎发育的不同阶段的测试作为诱导物(见汇总在表1)。背的比腹eSC eSC表现出更强的感应效果。eSC地区近端脑(中脑,端脑)显示了强烈的感应可能比远端后地区(髓质)。进一步,诱导物的活动似乎减少增加组织年龄(产后生活的7天)19]。其他各种nonneural组织诱导MM也表现出潜力,尽管不同的结果(12)(见表1)。
Transfilter实验已经使用过滤器执行不同的孔隙大小分离eSC的MM。发现更大的过滤孔与eSC感应更强,表现出越来越增速甚至毫米的小管发展(13,20.,21]。在实验小毛孔感应反应慢而弱,或完全没有22]。电子显微镜分析显示细胞发达pseudopodium-like过程渗透过滤器,从而生成MM之间的“桥梁”和eSC (22]。这些发现刺激广泛研究为感应了解细胞间接触是至关重要的,或者在长距离信号会发生。各种具有不同分子量的化合物,表面电荷,球形和nonspherical形状,高度带电分子测试,他们发现通过过滤器扩散速度比诱导因子(23]。进一步的研究调查了信号分子的迁移距离,不同来源的归纳组织,时间在此期间保留MM胜任归纳。甚至数学模型建立了考虑扩散时间通过一个和两个微孔过滤器13,23]。这些实验导致了拒绝的长距离扩散作为诱导模型。积极确认成功诱导的细胞间接触要求成立后,基于先进的组织保护方法和电子显微镜(24]。然而,最近发现的细胞内囊泡,也称为液或微泡,细胞间通信的新方法。液小细胞内囊泡(30 - 100 nm),携带手机信息,如各种rna、蛋白质或脂质,是释放的细胞(25- - - - - -27]。因为他们一直在血液和尿液中发现,他们可能也有潜力作为生物标记物的各种疾病(28]。液的尿液中进一步表明,他们也被释放从产后肾脏。然而,它们的存在和作用在胚胎发生目前不清楚。不能排除这种可能性,但是,,像1963年科赫和Grobstein发现,使用放射性同位素eSC,分泌“分子”相反的网站迁移到毫米的过滤器,多达100μ米之外从源头29日]。
2.2。小分子化学毫米诱导物
它早就知道,锂阳离子是胚胎发育的有力监管机构(9),但只有年后锂研究作为一个公认的诱导物的毫米30.,31日]。看来氯化锂扰乱Wnt /β连环蛋白信号通路(32,33)通过抑制糖原合成酶激酶3 (GSK-3) [34感应(见下表),从而使毫米1)。失活的GSK-3氯化锂,bromoindirubin-3′肟(生物),或6 - [(2 - [[4 - (2,4-dichlorophenyl) 5 (5-methyl-1H-imidazol-2-yl) 2-pyrimidinyl]氨基)乙基)氨基]3-pyridinecarbonitrile (CHIR99021)可防止细胞凋亡的MM,促进tubulogenesis [32,33,35),类似于自然MM抗病诱导剂,尽管是以一种更为快速的动能(a . R.-R。个人观察)。抑制GSK-3导致细胞质的稳定β连环蛋白,进而导致起始目标基因的转录因子的激活的TCF / LEF家庭。长期存在或高浓度的这些分子是紧随其后的是坏死的毫米33]。瞬态接触这些化合物或低浓度因此推荐成功的实验MM感应。尽管许多小分子干扰Wnt /β连环蛋白通路已确定(36),他们的角色在毫米感应尚未全面调查。然而,其中两个小分子抑制剂Wnt生产2 (IWP2),它压抑豪猪,Wnt响应的抑制剂1 (IWR1)影响Tankyrases 1和2 (36),被证明完全阻止整个肾脏的发展尽管存在乌兰巴托(17)加强nephrogenesis Wnt信号的重要性(37]。
其他因素参与MM感应已确定在寻找无血清培养基。动物血清与批次的不同之处在于它的成分,这可能会导致不同的器官培养实验结果。媒介是补充10%胎牛血清(FCS)显示强烈的MM和tubulogenesis感应38]。而无血清培养基本身不支持肾开发、移植的组织仍然uninduced,没有tubulogenesis的迹象,即使在脊髓的存在作为一个电感器(38]。补充的无血清培养基50 g / mL转铁蛋白(TR)是能够支持诱导肾脏的正常发展39]。TR的影响不能被表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF),或胰岛素38]。因此这些都是重要的生存因素肾脏感应保护。
3所示。肾脏在体外文化研究肾发展
在生物医学领域的进步(见图2),即技术生成转基因兄弟(40,41和基因敲除42动物,以及派生的老鼠和人类胚胎干细胞培养(43,44)结合肾脏器官文化是非常强大的工具。基因打靶研究了单个基因负责输尿管的芽产物,MM感应,肾元发展(见表2和图3)。
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3.1。MM影响输尿管的花蕾产物
尽管众所周知,中间的MM发展中胚层(IM),被odd-skipped相关转录因子的表达1 (Osr1) [45),一种机制导致高度专业化的发展毫米区域层面的后肢,还有待揭示。MM,这个区域已经被广泛的研究在过去几十年的遗传模型和组合使用在体外文化。这导致识别的基因导致输尿管的芽沃尔弗氏管(图的结果3(一个))。
第一个发现基因在肾脏器官形成中发挥作用是成对盒基因2(我们)。它的表达已被证明在乌兰巴托和早期毫米冷凝物。丧失研究决定,没有处于Pax2表达乌兰巴托分支和nephrogenesis失败(46- - - - - -48]。淘汰赛的创造转基因动物或功能丧失的建设模型允许识别的基因参与胚胎发生。一些受影响的不仅是一个器官,或导致早期胚胎死亡在子宫内,因此在之后的时间点了器官的分析困难。的使用体外文化系统,然而,允许在这些突变体器官的研究发展。纯合子胚胎肿瘤蛋白1 (WT1)淘汰赛(49)死在子宫内E13和E15之间,由于缺乏乌兰巴托产物(50]。实验进行体外透露,WT1双淘汰赛(−−)毫米可以诱导eSC,证明WT1对乌兰巴托崭露头角的[至关重要50]。类似的结果在Sal-like1 (Sall1)和空呼吸孔蛋白2 (Emx2)突变体51,52]。肾脏基础隔绝Sall1突变体胚胎展出在乌兰巴托结果失败,而从Sall1毫米−−/胚胎是由野生型胜任感应乌兰巴托和eSC。发现Sall1基因敲除小鼠未能引起输尿管的转录诱导因素如glial-cell-line-derived亲神经的因素(GDNF), Wt1、我们,Wnt4, BMP7 [52]。中表达的基因Emx2沃尔弗氏管中肾小管,但不是在MM (51]。结合文化与野生型突变乌兰巴托MM感应没有发生,随后肾脏发展受到了损害。Emx2缺乏MM,然而,诱导时结合野生型乌兰巴托。这些实验表明,在Emx2肾发育不全−−/纯合子小鼠胚胎诱导乌兰巴托生长是由失败(51]。没有上述基因的表达,乌兰巴托未能增长从沃尔弗氏管和MM细胞仍然uninduced而死。另一个基因发现体外肾脏文化是积极参与乌兰巴托GDNF,产物转化生长因子家族的成员β(TGF -β)[53]。GDNF被确认为诱发乌兰巴托分支的主要分子从沃尔弗氏管54]。当GDNF浸泡珠子被孤立的沃尔弗氏导管在旁边体外文化他们诱导异位芽的形成。此外,GDNF浸泡珠子干扰正常的肾脏发育诱导额外的分歧和不规则分支的乌兰巴托48,54]。这些研究结果首次表明,信号来自MM开始肾脏发展很重要,这是乌兰巴托的产物。
3.2。输尿管的萌芽发展和分支
一旦MM产生足够的GDNF,它分泌的MM向沃尔弗氏管它结合受体酪氨酸受体激酶(Ret)表达细胞。观察的−−/老鼠发现,缺乏Ret表达式是紧随其后的是肾脏的发育不全。此外,在嵌合小鼠马赛克的表达,一些细胞失去Ret表达式,肾脏正常发育,但发现,红−−/细胞重新排列和贡献发展乌兰巴托的树干,而不是技巧,如野生型小鼠(55]。从沃尔弗氏管成功乌兰巴托产物后,乌兰巴托侵入毫米和毫米之间的互惠后分子相声乌兰巴托,MM细胞诱导和乌兰巴托开始分支。
使用荧光标记乌兰巴托,隔绝Hoxb7-GFP转基因胚胎,结合在体外organoculture允许延时成像和更好的视觉分析乌兰巴托分支(56]。乌兰巴托展品连续三个不同分支模式:(i)终端裂成两半的分支,紧随其后的是不平等的增长两个新的分支和裂成两半的其中一个分支;(2)终端裂成两半的分支,紧随其后的是干伸长和侧向分支主干;(3)终端三裂的分支,其次是肝的改造产生两个不同的分支点(56- - - - - -58]。延时的分析图像记录在乌兰巴托分支显示最常见的分支类型是对称的终端分岔(i)。一些裂成两半的分支事件被观察到的不对称和下一个分支从这段是旋转90°分支的起源。三裂星云和侧向分支出现率低和出现在后面的分支。
虽然GDNF已被证明诱导初始乌兰巴托产物从沃尔弗氏管和刺激进一步的分支,另一种机制是必要的区分提示的分支区域和分公司的树干。乌兰巴托是由持续的分支网络的(59)和正受因素产生的MM,如Wnt11、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(EGF)或造血生长因子(HGF)和血管内皮生长因子(VEGF-A)在上述因素的突变体乌兰巴托分支受损(60- - - - - -63年]。这些因素导致肾脏发展,防止肾发育不全。然而,负监管机构存在,防止异位芽和控制乌兰巴托分支产物。这组由骨形态发生蛋白4 (BMP4) Slit2,迂回的同族体2 (Robo2), semaphorins。BMP4行为在乌兰巴托树干防止侧向分支,而Slit2和Robo2 GDNF的表达下调表达的前一部分MM防止异位乌兰巴托产物(48,64年,65年]。抑制增殖作用的蛋白激酶(MAPK)信号级联已经证明降低乌兰巴托分支和分支的长度(583),而抑制semaphorin导致增加分支和肾脏扩张(63年,66年)(图3 (b))。
虽然在一个有价值的工具,在体外肾脏的文化,像任何其他生物模型,有一定的局限性。肾脏是一个三维(3 d)机关和在二维(2 d)在文化过滤空气中的相间,分支乌兰巴托发展中肾脏的形态的不同在活的有机体内同行。因此,3 d文化技术的发展,在管状上皮细胞可以生长在一个适合的环境然后在二维表面上看,是必要的。为此,方法已经开发的乌兰巴托培养淹没在细胞外基质(ECM)化合物,由基底膜基质和胶原IV、补充的鸡尾酒生长因子(67年]。
乌兰巴托生长在这种方式在体外能诱导新孤立MM开发功能肾单位(67年]。此外,乌兰巴托生长在一个3 d ECM文化缺乏接触MM展出分支模式相似在活的有机体内乌兰巴托(68年]。这种文化的定量形态学分析方法进一步允许分支乌兰巴托结构利用荧光染色法结合延时显微(69年]。他们测量的影响的各个成员TGF -β总科在乌兰巴托分支形态和BMP2和4的角色定义,TGF -β1、白血病抑制因子(生活),苯丙酸诺龙在乌兰巴托的分支。基于这些发现提出,乌兰巴托分支是由可溶性生长因子和矩阵组件。生长因子和矩阵组件将调解三个信号:(i)支持快速增长的刺激和分支,(2)抑制减少增长和分支(负反馈循环),和(3)信号停止分支和经历分化(69年]。
3.3。Nephrogenesis
毫米后的早期观察形态学变化诱导eSC关注tubulogenesis和它类似事件发生在整个肾脏文化引发的MM时乌兰巴托(11,22]。第一个事件期间和之后的详细分析MM感应是由延时显微组织生活。的早期阶段tubulogenesis被描述为(i)未分化的MM,主管接收和回复感应信号,以能动的细胞;(2)早期冷凝物,由毫米在乌兰巴托技巧在感应细胞,以失去活性;(3)小管formation-cells冷凝物中接受mesenchymal-to-epithelial(遇到)过渡极化,形成pretubular骨料腔,拉长和需要的s形形式70年]。小管会拉长,导致远端和近端小管由亨利循环连接。“身体也是肾小球的开始发展阶段,与肾小球形成s形的身体最近的地点。身体细胞附近的s形基底膜将成为足细胞,和基底膜将发展成厚肾小球基底膜(GBM)。薄的细胞层上未来的足细胞称为壁上皮细胞。之后他们会引起肾小球囊。在这个过程中,内皮细胞和系膜细胞迁移到发展中裂,引起肾小球簇。GBM足细胞,内皮细胞完全构成了肾过滤装置(71年,72年)(图3 (b),3 (c),3 (d))。
代的NIH3T3细胞(24),表达各种Wnt基因导致基因的鉴定,对于nephrogenesis至关重要。在经典transfilter实验已经发现Wnt家族蛋白质,如Wnt1 Wnt3a, Wnt4, Wnt7a,和Wnt7b能够诱导tubulogenesis在毫米24]。这些蛋白质的最有趣的是Wnt4。Wnt 4不仅是间质中表达,pretubular聚合,和肾脏囊泡,但也表示在eSC。Wnt4 Wnt9b一起,后来被确定为推动mesenchymal-to-epithelial转变的主要因素(遇到)73年- - - - - -76年]。认识是一个过程在细胞pretubular聚集成为极化,基底和顶端的管子可以区分。这个过程是与腔形成和小管的发展。Wnt9b徒通过规范化Wnt通路的上游信号Wnt4 Six2导致tubulogenesis因此促进肾元祖细胞的分化15]。Wnt9b突变体不能形成pretubular骨料和无法接受tubulogenesis73年]。tubulogenesis收益和肾元形式,他们接受广泛的伸长和分割(图3 (b))。发展中管变得极端和近端和远端是有区别的。极化是由Notch信号控制机制(77年,78年伸长[],而Rho-kinase信号模式79年]。此外,抑制Rho-signalling在体外导致在乌兰巴托的缺陷类似Wnt9b变异动物(73年,79年,80年),再次证明体外/体外肾脏文化是发展一个强大的工具来揭示分子机制。有人建议,两极分化已经开始pretubular骨料,不同程度的钙粘蛋白和Lhx1观察;例如,细胞表达较高的钙粘蛋白和Lhx1都是代表未来的远端部分肾元(81年]。虽然远端肾单位的一部分是神经性的轨迹切口同族体蛋白2 (Notch2)独立、近端端要求等级2正常发展。老鼠缺乏Notch2完全缺乏肾小球和近端小管。此外,标记特定的近端segment-cadherin 6 (cadh6)和Lotus Tetragonolobus凝集素(需要)和早期podocytes-WT1缺席(77年)(图3 (c))。近端小管的发展开始于鼠标在E14灯头和近端小管开始表达刷状缘抗原(38),而远端小管的发展和E15表达Tamm-Horsfall糖蛋白(TH) [38]。然而,延长管连接近端和远端部分,亨利循环,没有观察到“三明治”文化条件下(82年]。
直到最近,Sebinger等人强调了表面张力的影响增长的媒体在乌兰巴托的分支,并进一步研究了支持材料对基因表达的影响和培养胚胎肾。修改后的培养方法试图最大化乌兰巴托分支事件和增加培养组织的存活时间。结果进一步表明Henle-like结构在循环的发展体外肾脏雏形文化(83年]。
发展中足细胞VEGF表达引起的血管内皮细胞和发展glomerulus-the肾小球簇(84年,85年]。新生鼠的内源性VEGF与抗体被注入,或中VEGF基因移除,展览肾小球没有毛细管塔夫茨和其他血管缺陷(84年,85年]。然而,删除VEGF2专门从足细胞表明VEGF的重要性向内皮细胞通过旁分泌信号VEGF2受体(85年),这表明足细胞的作用正确的“绿带运动”的内皮细胞衬里。
大多数信息glomerulogenesis已经产生的遗传模型和不是在体外文化,一大部分原因要归咎于这一事实在体外发达肾小球无血管的。这个问题已经得到了解决的植入小鼠肾脏雏形的绒毛膜尿囊的膜(CAM)鸡蛋,使肾小球vascularisation [38,86年,87年]。凸轮移植肾的基本原理表明,内皮细胞的起源和肾小球的脉管系统可能的主机起源(CAM)年轻时(E11.5)肾脏基础知识被用于种间文化(鹌鹑,主机/鼠标,捐赠)或混合血统的旧(E12.5)肾脏基础使用(86年,87年]。有趣的是,“绿带运动”被鹌鹑和鼠标沉积导致完全混合结构(87年)进一步表明内皮细胞和足细胞有助于“绿带运动”的形成。肾脏的发育过程和基因的相互作用在tubulogenesis glomerulogenesis被杜丝勒(描述的详细评论88年,89年),Vainio et al。90年,91年],席尔et al。72年]。
4所示。Grobstein分析和寻找干细胞/祖细胞
50多年前,奥尔巴赫和Grobstein分解MM,允许它使用eSC reaggregate电感器,它也可以分解(92年]。虽然组织存活几天,早期的发展阶段发生后reaggregation。这证明了机械或化学组织崩溃不会影响到它的感应能力,同时发送和接收信号的92年]。戴维斯集团进一步解构Grobstein化验,做了个实验,证明了自组织生长的限制发展中肾脏和提供了一个环境中假定的肾脏的肾原性的潜能祖细胞可以调查(93年]。在他们的研究中,他们完全分离后肾的肾(毫米和乌兰巴托)之间的孤立E11.5和E13.5解剖和酶治疗。它们形成聚合物从分离肾脏随后通过离心分离和培养这些聚合使用标准的机关文化,如图1 (e);他们称之为dissociation-reaggregation或3 d试验。减少细胞凋亡、岩石抑制剂添加到文化长达24小时;然而,延长接触岩石抑制剂阻止肾单位的发展。诱导肾脏发展仅限于单一肾元水平,发展中肾元是没有连接成一个树状结构,层次发展中胚胎肾组织。此外,类似的发现提出了只有dissociated-reaggregated MM诱导eSC和展示发展肾元段除了降序亨利循环的肢体。此外,分离MM可以成功地操纵;例如,一些基因表达下调或过表达,然后用于3 d分析探讨这些基因在肾脏发展中的作用[94年]。Grobstein测定到的修改dissociation-reaggregation技术提供了一种方法,允许引入外源细胞胚胎肾环境为了测试他们的肾原性的潜力。胚胎肾影响ECM的分离,因此使外源性细胞的运动和可能融入发展中肾脏结构。外源性细胞可能是各种各样的起源,虽然干细胞的最高利益。根据其来源、干细胞分为胚胎干细胞(ESC) [43]或成体干细胞(ASC) [95年]。ESC多能,能够分化成几乎所有的细胞类型,但ESC的使用限制在世界的某些地方由于伦理问题;成体干细胞在另一方面是多功能和分化潜力有限生成特定的细胞类型。诱导多能干细胞(iPS)多能胚胎干细胞和体细胞产生(96年]。工作在小鼠ESC(制)表明,尽管他们没有抑制肾脏发展dissociated-reaggregated后肾,他们只能够融入发展中输尿管的味蕾,但不是肾元。然而,他们的潜力可以增强对肾脏谱系分化。一旦公司使用悬浮培养分化(拟胚体试验)来表达中胚层标记Brachyury (T),他们被分类和混合与分离E13.5胚胎肾脏基础知识。后三天在文化、mESC-derived中胚层细胞显示集成到输尿管的芽结构,类似于未分化的制,但也成肾元,包括近端小管(PT)和肾小球。此外,mESC-derived中胚层细胞,这种细胞整合到近端小管,实际上是功能、运输荧光标记的阴离子分子从PT腔的间质97年]。
实验小鼠骨骨髓来源间充质干细胞(mBMSC)表明这些细胞的能力有限导致肾发展(98年]。尽管mBMSC表示肾标记,如Osr1 Sall1, Lim1, GDNF,除了后肾的肾在reaggregation实验中,他们只局部发展与低频率的肾脏结构和聚合优先WT1阳性细胞。mBMSC进一步显示肾脏发展不利影响,描述了通过降低细胞凝聚MM的质量和数量少的肾单位。这种负面影响可以被刺激与新生儿肾细胞条件培养液(NKC)。治疗条件培养液的数量也增加了mBMSC融入肾元(98年]。
人类BMSC的新疗法的发展极大的兴趣。在研究调查人类BMSC的肾原性的潜力(hBMSC)发现人类和小鼠BMSC显示类似的特征(98年]。reaggregates,添加hBMSC瀑样发展产生不利影响,尽管刺激NKC救援肾脏发展条件培养基,它并没有改善hBMSC集成(98年]。另一个人类细胞类型测试与巨大的潜力为人类治疗人类羊水干细胞(hAFSC)。由于减少了排斥和缺乏道德风险问题,hAFSC ESC的将是一个伟大的替代组织工程和细胞治疗。hAFSC有能力集成到肾脏囊泡和逗号的s形的身体,在显微镜下注射到肾脏基础知识(99年]。注射hAFSC显示表达分化标记,如带occludens 1 (ZO1) claudin, GDNF [99年]。此外,克隆行hAFSC被发现导致肾组织的形成(One hundred.]。此外,与hAFSC dissociation-reaggregation实验和小鼠肾脏基础,Siegel等人证明了肾的mTOR通路发展的至关重要的作用。遗传击倒mTORC1或mTORC2蛋白质hAFSC减少细胞的能力融入发展肾结构。促进mTOR途径活性的差别,对这些马铃薯球蛋白增加导致hAFSC融入发展肾结构(One hundred.]。dissociation-reaggregation中的另一个人类细胞类型测试(3 d)分析人类ESC (hESC)。显示细胞分化向肾家族通过肾脏的正常发展阶段,即原条,IM, MM (101年]。分化hESC集成在所有发展中肾子结构,而未分化hESC干扰肾发展,相应的也在类似的实验小鼠ESC的特点(97年]。分化hESC不仅集成到所有肾脏子结构混合后用鼠标肾祖细胞,但也发展成肾结构只在离心,最后一步在dissociation-reaggregation形成三维颗粒分析,独立于任何感应101年]。协议的ESC向肾谱系分化可能很快就被成功应用于hiPSC的分化,从而避免问题拒绝和绕过伦理问题。
看来,在体外器官发生reaggregated组织阻止肾小球的一步发展是由于缺少血管化。最近,Xinaris等人进行的实验显示,reaggregated细胞确实有可能产生血管小球,如果暴露在合适的环境中102年]。类似于上述dissociation-reaggregation实验,它们形成聚合物从分离小鼠后肾的肾和培养他们在体外5天。骨料的预处理之后4小时与血管内皮生长因子(VEGF),他们聚集在肾胶囊植入单方面进行肾切除手术无胸腺的老鼠;除了收件人老鼠也注射VEGF。三周后他们恢复的骨料老鼠,发现肾小球聚集发展,这些小球吸引了来自老鼠的血管。他们进一步发现,管状结构连接到肾小球滤液(包含102年]。这些发现可能感兴趣的人类干细胞的组织工程尝试添加到指导啮齿动物肾脏细胞群。
虽然3 d分析被证明是非常有用的测试不同细胞的肾原性的潜力,该技术的缺点是,发展中乌兰巴托并不像收集管树发展在活的有机体内。这些实验表明,胚胎发育可以复制在体外并表示复杂的局限性在体外器官形成当前的一天。细胞的主要限制是材料使用和需要控制的相互交互的祖细胞。
5。肾再生和组织工程
肾脏再生涉及的潜在方法原位使用干细胞或修复受损组织新创组织工程的功能移植组织。因此,有一个追求导致或促进细胞再生修复或肾发展(如上所述),或者作为组织工程的细胞来源的方法。组织工程实现的使用细胞,生物工程材料和合适的生化因素,目的是生成可移植功能肾组织。正在寻求最佳的细胞来源和修改Grobstein试验提出了作为一个好的平台测试候选人的肾原性的潜在细胞(97年,98年,One hundred.- - - - - -102年]。主要障碍是离解,reaggregation化验,乌兰巴托不生成一个树状分层次支能够排泄尿液收集系统。这个缺点可能克服与使用在体外使用一个合适的干细胞类型培养乌兰巴托。孤立的乌兰巴托已种植在体外在3 d ECM的设置和培养乌兰巴托能够诱导新孤立毫米(67年,103年]。此外,一些乌兰巴托派生细胞系如Madin-Darby犬肾(MDCK)或3 (mIMCD-3)小鼠髓集合管细胞能够接受分支在3 d ECM的文化系统,然而,成功所需要的不同的生长因子UB-like分支。当小骨料乌兰巴托细胞系与新鲜cocultured孤立的MM,他们诱导tubulogenesis,但分支不可能观察到(103年]。然而,使用微型图象水凝胶,管状结构从分散mIMCD-3细胞生成和CMUB-1鼠标输尿管的bud-derived细胞系。这些生成的管状结构腔形成和展出在体外萌芽对生长因子浸泡珠(104年]。另一方面,调查MM派生的细胞系,BSN,鼠诱导后肾间质(RIMM-18)和培养初级MM细胞并不胜任信号从新鲜孤立乌兰巴托和tubulogenesis不会发生;这些细胞系也不能诱导乌兰巴托分支(103年]。
而从乌兰巴托工程功能肾组织和MM细胞系,理想情况下来自患者自身的细胞,面临着严峻的挑战,由于肾脏的复杂性,类似的策略已经成功实现了结构更复杂的组织,如阴道和尿道重建(105年,106年]。肾组织工程的一个主要障碍是正确的工程肾组织血管化。修改后的Grobstein分析可能是一个有用的工具来执行或研究在体外血管化,因为它允许coculture各种细胞(例如,“成功”肾干细胞与内皮细胞在胚胎肾环境。虽然后肾下培养体外条件发展无血管的小球,它可能支持发展中肾小球血管系统,就像一个由凸轮提供。
一个潜在的战略产生更大的组织结构或整个器官是3 d打印。然而,3 d打印肾脏受到挑战的需要增加“油墨”培养所有必要在大量印刷前不同的细胞类型。进一步的发展,生物材料兼容的3 d打印和必要的精度3 d打印机生成的高度复杂的架构肾脏及其脉管系统(107年,108年]。但3 d打印技术已经实现了更复杂的组织,如软骨。气道夹板,打印从生物材料(聚已酸内酯)与tracheobronchomalacia新生,已经成功移植(109年]。更复杂的软骨,印刷使用水凝胶充满人类派生的软骨细胞可能允许直接软骨修复在不久的将来110年]。工程师植入式功能性组织,另一种方法或整个器官,是种植内皮和/或上皮或祖细胞在脱细胞成人器官(111年- - - - - -114年),这可能是来自已故的捐助者。去细胞的过程会删除所有细胞物质和树叶ECM的器官完好;还有一些生长因子的ECM仍然存在。去除细胞材料的进一步消除了人类白细胞抗原(HLA)分子的器官移植排斥从而最小化问题,只要使用的细胞,器官来源于肾脏收件人。这种方法的主要障碍是需要定义不同细胞类型的分布到所有隔间的器官。研究人员假设ECM的归巢机制将朝着正确的指示一个天真的干细胞分化。然而,即使正确的细胞来源可以分化成各种肾细胞类型标识(115年,116年),介绍了细胞可能不会遵循现有的随机矩阵布局但填充器官并生成自己的ECM。细胞增殖必须限制限制增生或肿瘤形成的可能性。此外,人类肾脏的大小是一个挑战对于必要的细胞数量和氧气供应期间的文化。然而,尽管仍存在许多障碍,一项研究报告的成功去细胞大鼠肾脏及其重新上皮和内皮细胞(114年]。
而试图创建一个生物人工肾非常有前途的,仍有许多障碍需要克服开发潜在的治疗肾病患者。目前的实验主要是对啮齿动物和如果成功执行将会转换成非人类灵长类动物在进入人体试验和临床应用。
6。总结
整个器官的培养一直是一个雄心勃勃的目标自1950年代初;在过去的十年里这个激进的想法来到。一个方法被发展的核心领域是Grobstein化验。作为一个相对简单和廉价的方法,它提供了一个平台,可以改变以适应需要新奇的想法。,修改Grobstein分析有点反映主流概念和科学的趋势在过去的几十年里它的介绍。
它帮助探索肾发展的基本机制。在早期阶段,间充质感应和能力一直在探索的问题。组织,如胚胎脊髓或可以作为天然抗病诱导剂的唾腺和化学诱导物,如锂和CHIR99021、后肾间质的定义。必不可少的方法描绘基因控制和影响肾的发展从outbranching沃尔弗氏管,如Ret和GDNF,层次分支的输尿管的花蕾,像Wnt9b, MM的感应和维护,如FGF2 Bmp7,功能肾单位的形成,例如,Cdh6。Grobstein试验还允许测试的潜在肾发生的不同的干细胞类型。干细胞如人类和小鼠BMSC和人类和小鼠ESC和hAFSC及其分化和集成测试潜在的被描述。结果肾脏器官再生医学文化引导,最终的目标是重建或工程师移植功能肾组织。目前采取的方法重新脱细胞器官的3 d打印技术,改造后肾的分离肾祖细胞。所有方法都受到肾脏的结构复杂性和寻求最优再生使用的肾脏细胞来源。然而,成功的生物工程结构简单的组织领导克服挑战的方式生成生物人工肾在未来。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Aleksandra Rak-Raszewska和彼得·豪泽诉同样起到了推波助澜的作用。