文摘
的动态变化研究肝星状细胞老化的进展是非常有限的,必要的。在这项研究中,雄性C57BL / 6小鼠被分为5组的年龄。我们发现超氧化物损害公司开始增加的中年(6个月),特别是降低抗氧化能力。按照,公司也开始从中间年龄的衰老,因为自我更新和分化能力显著下降,senescence-associated标记SA -β加了6个和老组。有趣的是,端粒长度和端粒酶活性在一定程度上增加6个组。它显示一个公司的内在自发能力对抗衰老。它可能提供理论和实验基础更好的理解公司的衰老进程。衰老和动态生物学特性的公司也可能有助于临床最佳时间延缓衰老的药物干预。
1。介绍
cross-differentiation,自我更新能力,多功能分化与重建长期造血的潜能,造血干细胞(hsc)可以分化成造血血统整个有机体的生命周期。血液细胞不断产生的肝星状细胞位于骨髓(BM)。生物体的整个生命周期,HSC水库维持生活。的主要财产干细胞自我更新的能力,这是很重要的保持HSC池寿命。值得注意的是,与年龄相关的变化HSC舱与生物的衰老,它表现为贫血、骨髓增殖性肿瘤的倾向增加(或然数),降低免疫功能,增加癌症发病率(1- - - - - -4]。老化后,肝星状细胞在大英博物馆的数量增加,而他们的重新潜在的下降。此外,年龄调整实验与肝星状细胞表现出血统的偏见倾向骨髓淋巴的潜力。
超氧化物损伤理论被认为是细胞老化的关键机制之一;理论认为,身体有良好的氧自由基产生和清除的平衡系统(5]。自体内抗氧化酶等超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽(GSH)细胞生存环境的下降,导致细胞内氧自由基的积累,细胞逐渐破坏,最终衰老发生(6]。虽然在身体衰老造血系统的基本组件保持在这一过程中,肝星状细胞的数量和功能逐渐降低(7]。
干细胞antigen-1(本来)是最常见的标志用来丰富成年小鼠造血干细胞(HSC),可以用来隔离人口几乎纯HSC当与额外的标记一起使用(8]。我们最近的研究表明,相比之下,本来+造血干细胞和祖细胞(公司)从年轻的老鼠,那些来自老老鼠本来就更少+公司,更高的p53的表达,,,,降低端粒的活动。粘附能力和CFU-Mix力量也在本来就减少+公司从老老鼠,表示一个老龄化带来的障碍(7,9,10]。
本研究旨在探讨肝星状细胞衰老的动态生理变化特征。本来就+公司分离和纯化小鼠在不同年龄段的磁性吸收细胞排序(mac)。我们调查过氧化物损伤和抗氧化能力的角色在肝星状细胞的自然衰老过程,提供实验证据和理论依据公司老化机理和抗衰老的药物开发。
2。材料和方法
2.1。道德的声明和动物治疗
雄性C57BL / 6 j小鼠买来的医学实验动物中心重庆(动物证书号码:SCXK (yu), 2007 - 0001年)和安置在一个温度,光控房间有免费的水和食物。所有的实验都是按照制度和国家指导方针和规定执行,经重庆医科大学动物保健和使用委员会。戊巴比妥钠麻醉下进行手术,所有的努力都是尽量减少痛苦。
动物被分成5组:A组(3 - 4周,体重13 - 16 g), B组(8 - 9周大,体重20 - 25克),C组(6个月大的时候,体重35 - 40 g), D组(12个月大的时候,在体重39-43 g), E组(18个月大的时候,在体重37-45 g)。
2.2。本来的分离和纯化+公司在小鼠骨髓
从股骨和胫骨骨髓收集。单核细胞是来自BM吸入物通过密度梯度分离,然后受到immunomagnetic本来的浓缩+公司(Miltenyi研究、Bergisch格拉德巴赫、德国)如前所述[5- - - - - -7]。
2.3。流仪结果
所有流量仪分析使用FACSCalibur (BD、生物科学、海德堡、德国)和数据分析了FCS,表达V3软件(新创软件、洛杉矶、钙、美国)。
2.4。检测Oxidation-Associated生物标志物
隔离后,本来+公司被PBS收集和清洗。谷胱甘肽含量、过氧化物含量、SOD活性和MDA含量检测到化学比色分析根据制造商的指示(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)。
2.5。细胞循环分析,本来就+公司
细胞循环分析的FITC BrdU流工具包(BD、生物科学、海德堡、德国)根据制造商的指示。流仪分析使用FACSCalibur (BD、生物科学、海德堡、德国)和细胞循环数据分析与多周期的软件(凤凰、日本)。
2.6。CFU-Mix形成体外
最初,4×104本来就+公司在24-well培养板(美国纽约合演,康宁,康宁)与单独使用甲基纤维素培养基H3434(干细胞技术,加拿大温哥华),和细胞培养在湿润的气氛中有5%的公司2在37°C 2周。最后,数字CFU-Mix形成光学显微镜下计数。
2.7。Senescence-Associatedβ牛乳糖细胞化学的染色
的senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加活动本来就决定+公司使用细胞衰老检测设备(美国生物学实验室,圣地亚哥,CA)根据制造商。总之,1×105本来就+公司被染色染色溶液没有有限公司24小时37°C2在6-well盘子。细胞计数和衰老细胞的分数(SA -阳性β加)评估。
2.8。RNA提取和rt - pcr
6×106本来就+公司的每个小组收集。根据制造商的总信使RNA提取协议使用试剂盒试剂(豆类、日本),OD260 / OD280 RNA: 1.8 ~ 2.0。第一链cDNA是由lamv逆转录工具包(美国表达载体)。独特的PCR引物见表1。DNA被初始放大孵化在94°C 5分钟紧随其后40周期为15秒94°C的变性,退火60°C 60秒,72°C扩展1分钟。PCR产物受到1%的琼脂糖凝胶电泳。光强度量化使用数量(Bio-Rad)之一。的相对表达水平的光强的比值计算目标基因的内部参考。
2.9。免疫印迹分析
检查P53的表达,P19,cyclinD1、到CDK2、CyclinE细胞衰老的标志,在本来就新鲜孤立+从每组公司,我们进行免疫印迹分析。细胞细胞溶解在缓冲(20更易/ L Tris-HCl, pH值7.5,150更易与L氯化钠,1% Triton x - 100,和完整的蛋白酶抑制剂混合物平板电脑(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)]和离心机在4°C 1000 g 5分钟。细胞的蛋白质浓度测定BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)。细胞溶解产物(40μg /)受到sds - page和转移到PVDF膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。膜涂抹与初级孵化p53抗体(Abcam,剑桥,英国),P19 (Abcam,剑桥,英国),(美国ANBO),(美国)Ptglab cyclinD1(美国ANBO),到(美国Ptglab) CDK2(美国ANBO)和CyclinE (Abcam,剑桥,英国)或ACTB(美国Ptglab)。相应的辣根peroxidase-conjugated抗体作为第二抗体(ZSGB-BIO,北京)。膜是可视化使用增强化学发光检测系统(皮尔斯)。的水平β肌动蛋白是作为内部控制。相对强度量化使用数量(Bio-Rad)之一。
2.10。测量端粒长度的印迹
本来的端粒长度测量+公司从每组根据前面描述的方法(11]。总之,提取后,DNA完整性检查,消化,解决通过凝胶电泳,转移到膜上,与标记探针杂交,暴露在x射线胶片使用轻拍。端粒长度是衡量西方生物技术公司。
2.11。银染色TRAP-PCR检测端粒酶活性
的本来就+公司是在冰上均质和细胞溶解,离心后的上层清液收集。浓度测量。PCR反应混合物包含5μL 10 x陷阱缓冲区,1μL核苷酸,1μL Taq-DNA聚合酶,1μL TS底漆,2μL提取的端粒酶,39岁μL DEPC水孵化为30分钟23°C telomerase-mediated TS引物的延伸。反应混合物添加1μ在94°C L残雪底漆放大5分钟然后在94°C受到35周期30年代,50°C 30年代,90年代和72°C。陷阱反应产品10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和检测到SYBR绿色(基因Inc .)染色。酶活性的比值=荧光强度/蛋白质浓度。端粒酶活性与酶活性的比值成正比。端粒酶活性来衡量西方生物技术公司。
2.12。统计分析
数据分析以及和方差分析使用SPSS 17.0版软件和表示为()。差异被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。本来的净化+HSC / HPC
流式细胞术显示,本来的百分比+公司在收集跨国公司只是隔离前(1.02±0.19)%,但本来就分离的纯度+HSC / HPS mac后(93.66±0.83)%。五组差异不显著(图在统计数据1)。
(一)
(b)
3.2。在本来就超氧化物损伤和Antisuperoxide能力+公司
从A到E组,SOD的活动每个样本分别为27.51±1.11 U / g, 38.23±3.50 U / g, 28.85±0.65 U / g, 17.52±1.27 U / g和12.67±0.89 U / g。这是与年龄的变化显著相关(,)(图2)。谷胱甘肽含量每组分别为28.78±0.77μ米,31.48±2.03μ米,47.62±4.93μ米,39.10±2.19μM和25.63±1.23μM,分别。谷胱甘肽含量和年龄之间的显著相关性被发现(,)(图2)。从A到E组,每一组的吸光度值正比于过氧化物为0.114±0.005、0.109±0.005、0.133±0.002、0.141±0.005、0.151±0.009,分别。过氧化物含量的变化反映出吸光度值被发现与年龄显著相关(,)(图2)。MDA含量本来就+公司在每一组分别为2.06±0.54 nmol / mg, 0.81±0.35 nmol /毫克,2.69±0.62 nmol /毫克,7.06±0.95 nmol /毫克,分别和11.44±1.19 nmol /毫克。MDA的内容被发现有与年龄正相关(,)(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。股价的变化β加染色中本来就+公司通过老化
SA -β岁加染色,细胞被染蓝了蓝色颗粒在细胞质中。SA -β加阳性细胞逐渐从E组显著增加(图3)。
(一)
(b)
3.4。本来的细胞周期+公司通过老化
从A组E,本来+公司显示的每组显著增加细胞循环逮捕在G1期,随着G0 / G1期的比例增加,和S期比例降低显著(图4,)。
3.5。本来CFU-Mix体外形成的比率+公司通过老化
的数量CFU-Mix本来的形态+公司将逐步从A组E组,说明本来的集落形成能力+公司逐渐减少老化(图5)。
3.6。老化的影响Senescence-Associated基因的表达,,,本来就和P53信使rna+公司
PCR结果表明的表达,p53,,本来CyclinD1信使rna+公司从组E是逐渐增加的。在E组,这些基因的mRNA水平明显高于其他组(图6,)。
(一)
(b)
3.7。老化的影响Senescence-Associated蛋白质P53的表达、P19,,到CyclinD1 CDK2、CyclinE本来+公司
通过免疫印迹,蛋白质的水平,,CyclinD1、P53和P19逐渐增加,按照mRNA的表达。同时,到的蛋白质含量,CDK2、CyclinE逐渐减少老化(图7)。
(一)
(b)
3.8。老化的影响在本来就端粒长度和端粒酶活性+公司
从A组E,本来的端粒酶活性比+公司分别为1.424,1.492,0.925,1.235,和0.570,分别(图8),而端粒长度是24.6 kb, 25.5 kb, 22.3 kb, 23.8 kb,分别和19.5 kb(图9)。
(一)
(b)
(一)
(b)
4所示。讨论
理论上,从器官的观点发展,3-4-week-old老鼠相当于1-2-year-old人类,丽江老鼠是等价的年轻人在15到20岁,6个月大的老鼠相当于中年人类在40到50岁,12个月大的老鼠相当于中年人类大约60岁和18个月大的老鼠相当于人类70多岁老(12]。
随着年龄的增长,肝星状细胞的自我更新和分化能力下降。这导致减少数量的肝星状细胞增殖和分化的能力受损。因为成熟血细胞的血统是肝星状细胞的分化,整个外周血细胞减少,再生障碍性贫血的风险。结果表明,肝星状细胞衰老和老年白血病是密切相关的,对于老年人来说,急性髓系白血病(AML)的风险随着年10]。超氧化物歧化酶(SOD)是一个重要的体内抗氧化酶,它可以催化歧化超氧化物阴离子和生成过氧化氢(H2O2)和氧(O2)[13]。在这项研究中,我们发现,SOD本来的内容+公司随着年龄的增长,降低总的趋势在整个生命周期:从青少年到成年早期,它迅速增加,达到峰值,然后逐渐下降。这一趋势与本来的趋势是一致的+公司发展和老化,这表明中年的体内抗氧化能力下降的开始。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂,提供含巯基的大多数活细胞体内。含巯基的组可以保持在一个适当的氧化还原状态的蛋白质。在目前的研究中,我们发现,随着年龄的增加,总谷胱甘肽含量的总体趋势是类似于本来的趋势+公司形成和发展:在中年,到达峰值后下降缓慢。它表明,中年的体内抗氧化能力下降的开始阶段。
超氧化物通常是指超氧化物阴离子,这是一个激进的氧气分子和一个强大的氧化剂。它可以刺激产生的白细胞抗微生物感染。过氧化物会导致超氧化物损伤与许多疾病密切相关。在这项研究中,我们发现过氧化物含量增加与衰老:从少年到青年,它下降,达到了最低点显示较强的抗氧化能力,然后慢慢增加。这种趋势表明,中年的超氧化物累积,这本来是一致的+公司老化。
MDA是产生脂质过氧化自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸。MDA的生产作为生物标志物来衡量过氧化物水平应力在一个生物体(14]。我们发现,MDA在本来的内容+公司保持在低水平的前两个月的生活,保持稳定的水平在接下来的四个月,六个月后显著增加。这一结果表明,过氧化物中本来就损坏+在青少年和年轻成人阶段公司是轻微的类似水平但显著增加的中年阶段。
衰老细胞通常表现为扩大规模和增加的水平β加。在这项研究中,我们观察到β加活动本来就+公司逐渐增加,而集落形成能力下降了老化,指示逐渐衰老和功能本来的损失+公司。
从上面的结果,我们推测,在衰老的过程中,因为积累的风险因素,如缺乏维生素、微量元素的代谢紊乱,内分泌影响,紫外线辐射,或电离辐射的潜在威胁,本来的抗氧化能力+公司明显减少。它打破了细胞氧化和抗氧化作用的体内平衡,导致超氧化物的增加伤害。积累的过氧化损伤可能是负责本来的衰老+公司和老年白血病和再生障碍性贫血的潜在风险。最近的研究表明,尽管造血系统的基本组件保持在老化过程中,本来的自我更新和分化潜能+公司减少,暗示本来的衰老+公司(15]。
在这项研究中,细胞循环流式细胞仪分析显示,本来+公司显示G1期逮捕与衰老,显著增加的比例G0 / G1期和S期比例的减少。在这项研究中,rt - pcr和免疫印迹显示mRNA的表达,、p53和的本来就+公司随着年龄的逐渐增加和蛋白质P53、P19,,cyclinD1逐渐增加而到,CDK2、CyclinE下降。这些变化与细胞循环分析是一致的。这个结果建议的角色rb和-Mdm2-p53 -信号通路在本来的自然衰老+公司。端粒长度和端粒酶活性分析显示相同的老龄化趋势,首先增加(从童年到青年),然后之后明显减少。有趣的是,端粒长度和端粒酶活性有反弹的年龄,但是之后急剧减少。它表明,尽管本来的衰老+公司开始在中年,肝星状细胞显示内在抗衰老的能力恢复在衰老的开始。然而,抗衰老的能力逐渐失去了身体在长大。因此,它隐含的存在自然老化阶段早期抗衰老的能力。它也启发我们,也许我们可以通过药物干预提高这种抗衰老的功能还是早期老化阶段是抗衰老的最佳时间。这些是我们最感兴趣的,我们想在未来继续讨论和研究。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢中国国家自然科学基金的资助(没有。30973818)和中国教育部科学基金会(没有。20125503110006)。