文摘

本研究的目的是调查是否人类脐带间充质干细胞——(hucMSC)提取液(hucMSC-exosomes)对急性心肌梗死(AMI)的保护作用。液在透射电子显微镜下特征,通过纳米粒子的液进一步检查跟踪分析。液(400μg蛋白)静脉注射管理后结扎(小伙子)冠状动脉左前降枝的老鼠。心脏功能是由超声心动图评估并使用TUNEL染色凋亡细胞数。心肌纤维化是评估使用马森的三色的染色。Ki67积极缺血性心肌细胞使用免疫组织化学测定。hucMSC-exosomes对血管形成的影响是通过管的形成和迁移评估人类脐静脉内皮细胞(EA.hy926细胞)。结果表明,小伙子的结扎冠状动脉心脏功能和诱导心肌细胞凋亡减少。管理hucMSC-exosomes显著提高心脏收缩功能和减少心脏纤维化。此外,hucMSC-exosomes保护心肌细胞凋亡,促进了管EA.hy926细胞的形成和迁移。得出hucMSC-exosomes改善心脏收缩功能,保护心肌细胞凋亡,促进血管生成。这些影响hucMSC-exosomes可能与调节bcl - 2家族的表达有关。

1。介绍

心肌梗死通常会导致心肌细胞不可逆损失和心脏功能衰竭血液供应的限制,是全世界范围内导致死亡的主要原因。尽管许多治疗历来使用,受损的心肌细胞仍不可再生,伤痕累累心肌组织仍不能恢复。它已经表明,干细胞治疗心肌梗死急性期的防止心肌细胞凋亡,促进当地neoangiogenesis,改善心肌灌注,减少局部炎症反应(1- - - - - -3]。MI的后期阶段,细胞疗法可以代替死者心肌与可行的心肌细胞,平滑肌细胞和内皮细胞,减少疤痕形成(4,5]。因此,移植的干细胞AMI后已经在临床试验中测试(6,7]。

间充质干细胞(msc)被认为是作为细胞治疗的主要候选人。msc多功能,并被证实能改善心脏功能后心肌内的移植到心肌梗塞(8- - - - - -11]。msc是广泛分布于整个身体(12)骨髓和驻留在脂肪组织外,肠、肺、肝、胎盘、羊水、牙髓和牙周韧带13,14]。最常用的细胞来源于骨髓迄今在临床试验中,脂肪组织和脐带。hucMSC更适合治疗AMI因为涉及的伦理问题越来越少;他们有很高的自我更新能力和低免疫原性15,16]。我们的研究团队之前报道的潜在疗效hucMSC和骨髓MSC在修复肝脏和肾脏17- - - - - -20.]。

轮值表等。21]报道如何移植骨髓细胞再生心肌移植的心肌梗塞形成功能肌细胞。供者细胞细胞表现出电特性类似于使细胞但显示AP的延伸和增强细胞缩短。它也表明,msc成为actin-positive与原生细胞缝隙连接形成与心室细胞(msc cocultured时22]。的结果数在活的有机体内研究支持的可能性,通过直接移植移植msc可能导致再生和分化。然而,cardiomyogenic分化通常不是观察或最多发生在极低水平。基于两项研究中,只有-5% - 0.5的已报告道细胞分化[23,24]。

Gnecchi等人发现可溶性旁分泌因子可以促进心肌再生和血管生成25]。可溶性旁分泌因子还可以招募骨髓细胞和心脏干细胞心肌损伤区(26]。然而,它是不容易确定哪些旁分泌因子(s) AMI治疗中扮演至关重要的角色,因为多样性和复杂性的旁分泌因子25]。利用人类胚胎MSC的条件培养基,timmer等人发现,只有因素大于1000 kDa有能力修复心肌缺血再灌注损伤小鼠模型。他们进一步的研究证实这些因素液释放msc (27]。MSC-derived液也调查了缺血/再灌注损伤的小鼠模型(28]。液是最有效的积极的旁分泌成分,发挥着重要作用,在细胞的细胞交流,有很大的潜力在修复受损组织的28,29日]。

我们的研究也表明,CCl hucMSC-exosomes放松引起的肝纤维化₄(30.),防止cisplatin-induced肾脏氧化应激和细胞凋亡31日),和增强皮肤伤口愈合(32]。然而,hucMSC-exosomes能否减轻心肌损伤,改善心脏功能仍然是未知的。在这项研究中,hucMSC-exosomes被注入Sprague-Dawley (SD)大鼠诱导AMI后立即通过尾静脉。我们的研究表明,hucMSC-exosomes可能促进缺血心肌再生。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

分离、培养hucMSCs后建立的方法(33]。所有人提供知情同意使用的绳在本实验研究中,伦理委员会批准的医学院医学科学和实验室,江苏大学,中国。hucMSCs培养在低葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(L-DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)(美国大岛屿Gibco) 37°C调湿空气中5%的股份有限公司₂。鼠心肌细胞H9C2(2 - 1)和人类脐静脉内皮细胞(EA.hy926)购自上海细胞库、中国医学科学院。他们在高葡萄糖杜尔贝科修改鹰的培养基培养(H-DMEM)包含10%的边后卫在37°C调湿空气中5%的股份有限公司₂。

2.2。hucMSC-Exosomes的提取、纯化和表征

液被隔离后曲等描述的过程。34(图)与小修改1)。总之,10%的边后卫L-DMEM exosome-free取代10%的边后卫L-DMEM hucMSC培养密度达到80 - 90%。Exosome-free的边后卫是通过离心器的边后卫在100000 g×16 h。它被证实没有液在使用NTA exosome-free的边后卫。hucMSC的条件培养基(hucMSC-CM)后收集细胞培养与exosome-free的边后卫L-DMEM 48小时。hucMSC-CM在300×g离心20分钟,20分钟2000×g, g和10000×30分钟去除死细胞和细胞碎片。那时hucMSC-CM集中使用100 kDa分子量截止(MWCO)中空纤维膜(美国微孔)1000 g×30分钟。集中hucMSC-CM装上5毫升30%蔗糖/ D₂在100000×g O缓冲和离心器2小时(美国贝克曼库尔特优- 90 k)。上层清液的缓冲收集nonexosome分数和集中使用100 kDa MWCO离心管。垫的底部包含液收集和清洗三次磷酸缓冲盐(PBS)使用100 kDa MWCO离心管在1000 g×30分钟。nonexosome分数和液的蛋白质含量测定采用BCA试剂盒(CWBIO,北京)。0.22 nonexosome分数和液过滤μ美国膜滤器(微孔)和存储在−80°C,供以后使用。

描述hucMSC-exosomes,暂停净化液(20μL)放到Formvar /碳涂层网格和负染色在3% (w / v)磷钨酸溶液(pH值6.8)为5分钟。形态学的透射电子显微镜下观察液(飞Tecnai 12、飞利浦、荷兰)。纳米粒子跟踪分析(NTA)进行了分析使用数字显微镜LM10液系统的粒子(NanoSight、处、英国)。视频图像运动的粒子的布朗运动下使用NTA分析软件,分析了粒子浓度也被记录下来。

2.3。AMI模型的创建和验证

动物协议由江苏大学动物实验中心批准,中国镇江。雄性SD大鼠,220 - 250克,用10%水合氯醛麻醉(化学试剂国药控股公司、上海、中国)(300毫克/公斤)腹腔内注射和机械通风(奥尔科特生物科技公司、上海、中国)。一个AMI模型建立了打开胸腔,挤压心脏和快速、准确地切断(小伙子)冠状动脉左前降枝的6 - 0缝合。最后,胸部被收紧双钱包缝合关闭。这些老鼠被杀死在2天,手术后1周、4周根据不同的实验。确认是否小伙子冠状动脉结扎诱导AMI,心电图检测与小伙子结扎大鼠早在24小时。TTC染色是在手术后48 h, echocardiograph是在手术后1周。调查hucMSC-exosomes的疗效,TUNEL染色,Ki67免疫组织化学处理在手术后1周。超声心动图和马森的三色的染色在手术后4周进行。

确定大鼠AMI模型是否成功创建,心电图记录的小伙子冠状动脉结扎后24小时使用生物信号记录系统(10 t PowerLab ADInstruments,上海,中国。然后,一些老鼠牺牲使用过量的麻醉剂。他们的胸腔被打开了,心被移除,沉浸在生理盐水。心被切成5左心室短轴的横向部分动脉结扎以下网站,用1% TTC染色(美国σ)37°C,持续15分钟。心肌梗塞是测量的大小。超声心动图检测执行的其他老鼠心脏功能使用高频彩色超声仪器(加拿大VisualSonics Vevo2100)在手术后1周。

2.4。注入hucMSC-Exosomes和评估心脏功能

调查hucMSC-exosomes的影响,老鼠被分成三组,每组六个老鼠。AMI +液组:hucMSC-exosomes (400μg蛋白)悬浮在200μL PBS通过尾静脉输注。AMI + PBS组:200μL PBS是通过尾静脉注入。虚假的组接受小伙子冠状动脉结扎和外来体注入除了他们的箱子被打开了,小伙子下的缝合线通过冠状动脉。为了进一步证实液的影响,hucMSC-CM没有液也被用于这项研究。

超声心动图进行4周后注入液或nonexosome分数。相关参数记录:左心室内部直径的舒张(LVID; d),左心室内部直径的收缩(LVID; s),左心室容积的舒张(LV卷;d),左心室体积的收缩(LV卷;s),左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)。

2.5。TUNEL检测、梗塞大小测量和免疫组织化学

凋亡细胞的数量在缺血区被TUNEL分析测量使用原位细胞凋亡检测设备(博士德)根据制造商的指示。微观十地区记录和计算出的TUNEL-positive细胞Image-Pro + 6.0。

免疫组织化学,组织部分与稀释孵化主要抗体鼠Ki67(1: 200)(圣小腿)阻断特异性的地区有5%的牛血清白蛋白。然后,组织部分与biotin-conjugated孵化anti-rabbit免疫球蛋白G和链霉亲和素生物素和彩色3,3′-diaminobenzidine。最后,心肌组织在边境地区与正铁血红素染色后拍摄。细胞阳性Ki67被Image-Pro + 6.0计算。

结扎的心肌组织以下在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,切成5μm系列的部分然后用于马森的三色的染色。使用立体显微镜图像捕获(Motic smz - 168,中国),分析了使用Image-Pro + 6.0。

2.6。缺氧实验在体外

为了研究是否hucMSC-exosomes保护H9C2(2 - 1)细胞对缺氧损伤,三个实验小组设计如下。Normoxia组:H9C2(2 - 1)细胞培养在含有10%的边后卫H-DMEM 37°C调湿空气中5%的股份有限公司₂。缺氧+液组:H9C2(2 - 1)细胞培养在H-DMEM包含0.2%的边后卫和hucMSC-exosomes (200μg / mL)在37°C调湿空气中5%的股份有限公司₂,2%的人啊₂,93% N₂。缺氧+ PBS组:H9C2(2 - 1)细胞培养在相同条件下的缺氧+液组除了hucMSC-exosomes (200μg / mL)取而代之的是等距PBS。十二小时后,蛋白质从细胞中提取检测bcl - 2家族成员的表达。

2.7。免疫印迹

hucMSC-exosomes或H9C2(2 - 1)细胞细胞溶解radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区和phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备。相等数量的蛋白质被加载并运行在12% SDS凝胶,然后转移到PVDF膜(美国微孔)。膜被封锁的5%脱脂奶1 h和孵化与稀释主要抗体[CD9 (1: 500;Bioworld)、CD63 (1: 300;SAB)、bcl - 2 (1: 500;Bioworld),伯灵顿(1:500;Bioworld)和GAPDH (1: 2000;一夜之间CWBIO)]在4°C。细胞膜在山羊anti-rabbit孵化或anti-mouse抗体(1:2000; Bioworld) at 37°C for 1 h. The target proteins were detected using the Luminata Crescendo Western HRP substrate (Millipore, USA) and the results were analyzed by AlphaView SA.

2.8。管形成和内皮细胞的迁移

96 - 50钱伯斯被涂上一层μL(基底膜基质(BD生物科学)和放置在37°C为30分钟。EA.hy926细胞(1.5×10⁴150年)被停职μ无血清培养系统L H-DMEM包含hucMSC-exosomes (100μg / mL)和人工基底膜下镀。控制井含有150μ无血清培养系统L H-DMEM等于PBS。孵化后在大气中5%的股份有限公司₂在37°C 10 h,三个随机领域在倒置显微镜下拍摄和管子的数量统计。

为了测试内皮细胞的迁移,EA.hy926细胞(2.5×10⁴200年)被停职μL血清H-DMEM和镀上舱Transwell钱伯斯(美国康宁公司)。然后众议院500年充满了μ无血清培养系统L H-DMEM包含hucMSC-exosomes (200μg / mL)。控制井含有500μ无血清培养系统L H-DMEM等于PBS。在文化的氛围中湿润空气有限公司为5%₂在37°C 12 h,剩下的细胞的膜是用棉球擦拭掉,而通过膜的细胞迁移和4%多聚甲醛固定30分钟和15分钟与结晶紫染色。最后,三个随机领域在倒置显微镜下拍摄和细胞计数。

2.9。统计分析

使用SPSS 16.0软件进行统计分析。数据表示为±标准差。学生的以及用于实验和相对对照组进行比较。单向方差分析之后,事后测试是用于分析方差在所有组。的值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。表征hucMSC-Exosomes

透射电子显微镜观察hucMSC-exosomes透露球形囊泡的存在,与一个典型的杯状。显示的大小分布剖面均匀的人口从20到85海里(数字2(一个)和2 (b))。的粒度分布和粒子图像图hucMSC没有液(nonexosome)和液也被NTA记录下来。没有在nonexosomes粒度分布(图2 (c))。hucMSC-exosomes的平均蛋白质含量和平均粒子浓度为3.98毫克/毫升和4.41×10¹⁰分别为粒子/毫升(图2 (d))。发现这个孤立hucMSC-exosomes CD9和CD63的表达高水平(图2 (e))。

3.2。hucMSC-Exosomes改善AMI大鼠心脏收缩功能

AMI模型是由冠状动脉切断的小伙子。生物信号记录系统的结果显示,可见病理性Q波检测与小伙子结扎动物早在24小时(图3(一个))。由超声心动图心功能分析显示左心室前壁的收缩童子结扎动物成为弱于虚假的对照组(图3 (b))。TTC染色显示左心室前壁的一部分在小伙子的结扎动物苍白,这代表在整个左心室缺血区域,占19%(图3 (c))。

确定hucMSC-exosomes的影响,分析了心脏功能使用超声心动图hucMSC-exosomes注入后4周。超声心动图在胸骨旁的长轴视图显示左心室前壁的收缩是强exosome-treated动物相比,PBS处理或nonexosome分数(图4(一))。我们进一步评估LVEF、LVFS LVID; d, LVID;年代,LV卷;d,和LV卷;年代。被虚假的组的动物相比,LVEF和LVFS都显著降低AMI + PBS对待动物(),而LVID;年代,LVID; d, LV卷;d, LV卷,年代都是AMI + PBS组显著增加(LVID; d和LV卷;d (),LVID;和LV卷;年代()]。然而,LVEF和LVFS都显著增加exosome-treated组相比,PBS对照组(),而LVID;年代在PBS exosome-treated组低于对照组()。没有显著区别exosome-treated和接受pbs动物在LV卷;年代,LVID; d,或LV卷;d(图4 (b))。为了进一步证实液的重要性和特殊性,相关参数进行评估的动物没有液注入了hucMSC-CM 4周后。结果表明,LVEF和LVFS都显著减少动物治疗AMI + nonexosomes相比动物处理液()(图4 (c))。

3.3。hucMSC-Exosomes减少心脏纤维化,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖

马森的三色的染色显示,没有可见的蓝色区域虚假的集团,而心脏纤维化exosome-treated组的比例明显比PBS对照组(图5)。心脏修复与减少心肌细胞凋亡密切相关。有更少的凋亡细胞,与TUNEL染色,心肌的exosome-treated组相比,接受pbs组(数字6(一)和6 (b))。此外,Ki67阳性细胞检测左心室梗塞的边境地带的免疫组织化学染色。Ki67阳性细胞在exosome-treated动物,在接受pbs组相比均有显著增加(数据6 (c)和6 (d))。

调查hucMSC-exosomes的凋亡效应,伯灵顿和bcl - 2蛋白的表达在大鼠心肌细胞H9C2(2 - 1)是利用免疫印迹检测。暴露于低氧条件12 h后,伯灵顿的bcl - 2的比例exosome-treated H9C2(2 - 1)细胞显著高于控制细胞(数字6 (e)和6 (f))。

3.4。hucMSC-Exosomes促进血管生成

心肌修复和改善心脏收缩功能可能与促进血管生成。在体外研究表明,管状结构在液治疗EA.hy926细胞明显多于控制()(数据7(一)和7 (b))。此外,EA.hy926细胞的迁移hucMSC-exosome-treated组显著高于接受pbs组(孵化12 h(数据后)7 (c)和7 (d))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们成功地分离和液从hucMSC特点。我们证明hucMSC-exosomes管理局(注射)。AMI后显著提高LVEF和LVFS减少心脏纤维化。然而,hucMSC-CM没有液显示几乎没有影响促使心脏功能恢复,表明hucMSC-exosomes介导心肌再生。此外,hucMSC-exosomes预防心肌细胞凋亡和促进细胞增殖在边境地区。此外,液促进心肌修复也促进血管生成有关。在体外我们证明了hucMSC-exosomes可以促进管EA.hy926细胞的形成和迁移。

众所周知,exosomal内容包括信使rna, DNA,小分子核糖核酸、蛋白质(我。e、酶、生长因子和细胞因子),和不同类型的跨膜蛋白,包括tetraspanins膜联蛋白,细胞内的细胞粘附分子。所携带的蛋白质或microrna hucMSC-exosomes可能与促进细胞保护和血管生成。据报道,几种类型的细胞,例如,心肌细胞(35和内皮细胞36),可以吸收液。在我们的研究中,液是通过尾静脉注射。他们将很快推进后血液流动。因此,这种可能性被尾巴内皮细胞实验或与这些细胞融合是非常低的。然而,当液达到组织或器官的血液流动非常缓慢,例如,董事会缺血性心肌,液的运动可能会放缓,这可能会大大增加机会幸存细胞内化的或与这些细胞融合。因此,液可以转移分子从一个细胞到另一个通过膜泡贩运和可能在细胞间信号,所以它往往是推测,交付货物的RNA分子可以解释生物效应。它已经表明,液可以转移蛋白酶治疗心肌缺血再灌注损伤(37]。

我们的在这个研究结果表明hucMSC-exosomes显著增加bcl - 2在心肌细胞暴露于低氧环境。bcl - 2是视为一个重要的凋亡蛋白。亚斯兰等人的结果还表明,MSC-derived液增加ATP水平,降低氧化应激,PI3K / Akt通路激活增强心肌活力,防止不良装修后心肌缺血/再灌注损伤(38]。

此外,hucMSC-exosomes也增加了Ki67表达式在边境地带的AMI大鼠。Ki67蛋白是严格与细胞增殖有关。识别的类型细胞增生,我们打算做双染色与心肌细胞标记,例如,α辅肌动蛋白和Ki67确认扩散细胞心肌细胞。

总之,hucMSC-exosomes提升心脏修复后通过保护心肌缺血性损伤细胞凋亡,促进细胞增殖和血管生成。这项研究可能提供一种新的机制hucMSC可以有效地用于临床治疗的AMI。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81270214)。