文摘

本研究是探讨人牙周韧带干细胞的成骨潜能(hPDLSCs)引起的柚皮苷在体外和体外。结果证实,1μ米柚皮苷执行最好的效果和一组骨基因(RUNX2,COL1A2、OPN和OCN)表达水平明显高于对照组。此外,一个典型的观察小梁结构体内,被大量成骨细胞所包围。这些结果表明,柚皮苷,在浓度为1μ米,可以有效地促进hPDLSCs增殖和分化的体外和体内。

1。介绍

牙周病是一种慢性感染性疾病,发生在牙周组织(牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨),与牙槽骨和牙骨质吸收的主要临床表现造成牙齿脱落。尽管一些报道的成功与自体和同种异体骨愈合,这是最常见的临床治疗骨折不愈合大缺陷,这些技术尚未能满足所有临床需求(1]。2004年,搜索引擎优化等。2)在《柳叶刀》杂志上报道,成人干细胞从人类牙周韧带在矿化诱导条件通过其成骨分化能力,诱导条件下的矿化成骨变异能力。细胞能够形成牙骨质、牙周ligament-like结构在免疫缺陷小鼠背部皮肤;这些结构后来被命名为人类牙周韧带干细胞(hPDLSCs) [2]。hPDLSCs是一类具有干细胞性质的血管周的积累,理论上可以分化为成纤维细胞、成骨细胞、牙骨质细胞,破骨细胞和破牙骨质细胞(3- - - - - -5]。

柚皮苷是氢氯噻嗪类黄酮素,中药中提取的主要活性成分Drynaria,和有一个已知的化学结构(图1)。柚皮苷的药理作用在促进人类间充质干细胞增殖和分化6- - - - - -8良好的文档记录。然而,很少有研究柚皮苷对人牙周韧带干细胞治疗评估。Nanohydroxyapatite (nHAC)脚手架是一种纳米仿生骨材料和纳米结构非常接近自然骨。它有一个高约80 - 90%的孔隙度和孔隙大小约为100 - 600μ米,可降解80%以上在6个月。因此,它所需的孔隙度、生物相容性、降解率(9- - - - - -11]。最重要的是,我们已经表明,naringin-stimulated hPDLSCs可以增殖nanohydroxyapatite支架移植到老鼠时,发展为矿化组织。

在目前的研究中,我们探讨了柚皮苷对人牙周韧带干细胞的增殖和成骨分化。确定最佳的柚皮苷浓度成骨分化后,我们把hPDLSCs复合nanohydroxyapatite脚手架的免疫缺陷小鼠确认体内成骨的影响,为进一步的研究提供理论基础研究和临床实践。

2。材料和方法

2.1。柚皮苷的化学结构

柚皮苷(图1)是一种二氢睾酮类黄酮。因为没有A和B之间的接合环,柚皮苷显示多种生物活性和药理作用。

2.2。隔离和文化人类牙周韧带的干细胞

分离、培养人牙周韧带干细胞根据之前报道与少量修改协议(2]。总之,人类前磨牙()提取原因矫正从10健康成人志愿者。牙周韧带组织从根表面分离使用手术刀,剁碎成最小的大小。切碎的牙周韧带组织在消化酶消化45分钟(3毫克/毫升胶原酶I型(美国σ)和4毫克/毫升Dispase II[美国σ])在37°C。单细胞悬浮液被播种到细胞培养菜(美国BD)包含增长a-MEM媒介(美国Hyclone)补充20%胎牛血清(的边后卫;美国Gibco)然后孵化37°C公司为5%₂。单细胞殖民地观察和通道0 (P0)细胞培养。然后,通道3到5 (P3-P5)细胞被用于这项研究。

2.3。免疫组织化学

hPDLSCs被播种到12-well板块(5×10³细胞/ 24小时)。这些细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下15分钟,封锁与1% BSA 30分钟。然后,一夜之间,细胞被孵化在4°C和rat-anti-Stro-1 CD146(美国Abcam)。洗后用PBS、羊anti-Rat免疫球蛋白二次抗体被添加和孵化与固定hPDLSCs 37°C 1 h。结果检测到荧光显微镜(ECLIPSE Ti-E、尼康、日本),没有二次抗体作为一个空白的控制。

2.4。克隆形成单位的成纤维细胞的分化试验

评估克隆形成,P3 hPDLSCs与4%福尔马林固定,然后以0.1%甲苯胺蓝染色。聚集50或更多的细胞被得分作为殖民地。钙积累是诱导21天,然后被染色茜素红s中2%是每周更新两次。4周后,细胞被固定为4%多聚甲醛和沾油红色的o检测脂滴。

2.5。MTT扩散分析

美国σ股票二甲亚砜(DMSO)培养液(Hyclone,中国)是由溶解20毫克柚皮苷(国家控制药品和生物制品研究所、中国)在DMSO (345μL)。然后,股票的解决方案是10倍连续稀释(10 nM 100μ米)αmem加上10%胎牛血清(12];2×10³hPDLSCs /被播种在96 -孔板αmem包含10%的边后卫。然后,媒体被刷新αmem含有10%的边后卫和各种浓度的柚皮苷后24 h。hPDLSCs淫羊藿的浓度是诱导1到5天;20μL (MTT(四唑盐)解决方案(5毫克/毫升在PBS, pH = 7.4)后被添加到每个井中移除。孵化4 h后,上层清液和150年被抛弃了μL (DMSO溶液添加到每个好完全溶解晶体振荡通过10分钟。490纳米的吸光度是由一个酶联免疫吸附试验阅读器(Bio-Tek Elx 800年,Winooski, VT,美国)。细胞αmem含有10%的边后卫没有柚皮苷被用作一个空白的控制。细胞生存能力是决定通过比较治疗和样品空白的OD值控制。

2.6。测量的碱性磷酸酶活性

细胞被播种在96 -孔板(2×10³细胞/)和培养3,5,7天(37°C, 5%有限公司₂)。细胞是细胞溶解0.1% Triton x - 100 (Ambion生命技术)。高山活动对硝基苯磷酸溶解产物是由(PNPP)水解方法使用一个商业分析工具(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。吸光度在520纳米测量和数据归一化总蛋白质含量的布拉德福德定律,这是测量细胞内碱性磷酸酶的含量。

2.7。柚皮苷hPDLSCs诱导的成骨分化

hPDLSCs细胞被播种在96 -孔板的密度2×10⁴细胞/在αmem含有10%的边后卫无成骨的补充剂。24小时后,柚皮苷浓度从10纳米到1μm细胞培养没有柚皮苷被用作一个空白的控制。在21天,PBS的细胞被洗两次,10分钟固定在95%的乙醇,0.1%的染色茜素红S (pH值8.3)在37°C 30分钟。用蒸馏水洗涤后,钙结节光学显微镜下观察。

2.8。RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,实时定量PCR分析

经过7天的培养,总RNA提取使用试剂盒RNA提取试剂(豆类、大连、辽宁、中国)。互补脱氧核糖核酸合成与PrimeScript RT大师混合(豆类)。rt - PCR是由ABI 7300实时PCR系统使用预混料交货标签(豆类)。使用循环参数如下:变性在95°C 15分钟和30放大周期(15 s在95°C, 25 s 60°C,和10 s在72°C)。引物是RUNX2,COL1A2骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)(表1)。的表达β肌动蛋白是作为内部控制。

2.9。体内移植

医疗服务的协议、维护本研究和治疗的动物是兰州大学动物保健机构委员会批准。移植前,总共4.0×10⁶hPDLSCs接种到培养基,并刷新了柚皮苷流体文化(1μ米),细胞被孵化一周。6小鼠免疫功能不全的米色(Vitalriver,北京)随机分为2组:与药物治疗小鼠移植细胞和老鼠不服药治疗。局部麻醉的数量是根据小鼠体重来计算的。移植开始时,操作区域与聚乙烯吡咯酮碘消毒和3%的水合氯醛(100 mL / g)是腹腔注射麻醉。之后,我们创建了一个全层切开在老鼠背部皮肤和移植诱导细胞。手术缝合线一周后被移除。

2.10。移植组织的免疫组织化学分析

移植的移植8周后被收获,与4%多聚甲醛固定24小时。苏木精和伊红())染色和免疫组织化学染色法进行组织部分。主要抗体用于包含IHC染色是兔子反骨gamma-carboxyglutamate蛋白质(东方)抗体(1:200稀释,博士德,武汉,中国)和兔反骨桥蛋白(OPN)抗体(1:200稀释,博士德,武汉,中国)。洗后,样本处理FITC-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 64稀释,博士德,武汉,中国)。新矿化结构的图像从荧光显微镜(ECLIPSE Ti-E、尼康、日本)。

2.11。统计分析

所有测量数据收集并表示为±标准差。SPSS 18.0被用于数据分析使用方差分析(方差分析)紧随其后以及,显著值定义的值< 0.05。

3所示。结果与讨论

3.1。隔离和文化人类牙周韧带干细胞(hPDLSCs)

牙周韧带组织从根表面分离使用手术刀和碎成最小的块(数字2(一个),2 (b),2 (c))。经过7天的文化中,单个细胞出现(图2 (d))。在第十天,我们观察到,贴壁细胞显示梭状形状(图2 (e))。14天,hPDLSCs激增积极表现出细胞的定向安排(图2 (f))。

3.2。描述孤立hPDLSCs

Stro-1和CD146是典型的牙周膜干细胞的表面标记。细胞表面标记(Stro-1)是由FITC绿色荧光(图3)。电池(CD146)由FITC绿色荧光。甲苯胺blue-positive染色hPDLSCs表示粘多糖的存在的软骨矩阵(图4(一))。成骨分化过程中,矿化结节形成,使用茜素红染色显示在21天(图4 (b))。关于脂肪形成的分化,细胞显示,脂滴后21天的脂肪形成的差异化(图4 (c))。

3.3。细胞增殖实验

hPDLSCs细胞增殖的研究过程中,观察细胞增殖的普遍趋势。此外,柚皮苷浓度对细胞增殖行为存在剂量依赖的相关性(图展出5)。在10 nM柚皮苷的浓度,我们没有看到一个空白的控制和治疗组之间的显著差异。柚皮苷浓度增加到100海里时后第四天,空白的控制和治疗组之间的差异是重要的(),与细胞的增殖率增加20%以上用柚皮苷治疗。在1的浓度μ柚皮苷,治疗组在增殖率始终表现出显著增加空白控制()。然而,当我们进一步增加了柚皮苷浓度高达100μ米,我们发现,柚皮苷在这些浓度对细胞增殖有不利影响。因此,我们只调查了疗效的柚皮苷浓度从10纳米到1μ在接下来的实验。

3.4。测量的碱性磷酸酶活性

碱性磷酸酶活动是一个定义良好的骨和能体现差异化的程度。随着浓度的柚皮苷从10 nM为1μ观察M,大幅提升高山表达式从3天到7和空白相比控制()。此外,高山表达水平与柚皮苷的浓度呈正相关,但柚皮苷在10 nM的表达显示有点影响高山从3天到7。第七天,1μ米柚皮苷显示最重要的碱性磷酸酶活性(图的差异6)。

3.5。成骨分化

PDLSCs在成骨分化培养基培养14天,和hPDLSCs成骨分化状态是由染色茜素红s .柚皮苷(10 nM的治疗1μ米),形成钙结节被发现增加,尤其重要的治疗柚皮苷浓度的1μM(图7)。

3.6。rt - pcr分析骨基因

标准成骨分化的基因表达标记(如RUNX2胶原蛋白我OPN,和OCN)被发现与柚皮苷浓度呈正相关,基因表达最高的1.5倍以上的治疗1μ米柚皮苷(图8)。

3.7。体内植入结果

他走时染色建议新骨组织(数据的生成9(一个)和9 (b)),对照组和治疗组。然而,两组之间的差异显著(图9 (b))。成骨细胞早期发育和骨小梁组织围绕nanohydroxyapatite只能在治疗组。免疫荧光染色显示边界网关协议和OPN的表达和排泄的成骨分化hPDLSCs nanohydroxyapatite周围。Image-Pro + 6.0被用于定量分析的荧光强度,和平均光密度(IOD总和/面积总和)被用作衡量表达式。治疗组表现出超过50%增加边界网关协议和OPN的表达。

3.8。讨论

牙周疾病,慢性inflammation-induced崩溃牙周韧带组织,经常会导致牙槽骨损伤和成年人牙齿脱落。先前的研究表明,MSCs-based牙周治疗可以抑制免疫反应,促进骨再生(13,14]。PDLSCs孤立于牙周韧带。他们有多种分化潜能,尤其是牙骨质、牙周ligament-like结构。他们经常被认为是第一个候选人牙周组织修复(15]。

柚皮苷、定义良好的化学结构的化合物是Drynaria的主要活性成分之一,一个广泛用于中药促进骨组织(有效的代16]。柚皮苷是一种黄酮类成分是天然的抗氧化剂。菅野等人研究了H柚皮苷的影响₂O₂全身的细胞毒性和老鼠P388白血病细胞凋亡。他们的研究结果表明,柚皮苷是一种有用的药物具有抗氧化和抗凋亡属性(17]。柚皮苷也改善了抗氧化状态通过提高抗氧化酶的活性和非酶的抗氧化水平,利用其抗氧化和保护神经细胞凋亡的作用18]。在另一项研究中柚皮苷的心血管效应的机制,研究人员发现,柚皮苷治疗可以显著抑制衰减HG-induced细胞凋亡的线粒体功能障碍和调制p38信号通路的激活19]。

良好的增殖潜力是细胞分化[的先决条件12,20.]。本研究的结果表明:1μM的柚皮苷的最佳性能。基于细胞增殖分析,我们发现,随着药物浓度的增加,细胞表现出更好的增长趋势。然而,有趣的是,当药物浓度继续增加到10μ米,上有一个负面影响细胞生长。我们推导出10μ米的柚皮苷抑制细胞生长。其他的研究显示了类似的结果。戴和他的同事们(6]研究柚皮苷的促进效应(0 - 200 ng / mL) hBMSCs扩散;他们的研究结果表明,一定浓度(1 - 100μg / mL)的柚皮苷可能提高hBMSCs的增殖和成骨分化。然而,在200年的细胞的数量μg / mL柚皮苷迅速下降,表明这个(或更高版本)的柚皮苷浓度严重有毒细胞生长(6]。刘等人诱导成骨分化的hAFSCs柚皮苷对他们的治疗潜力21];他们发现,柚皮苷可以增加增殖和碱性磷酸酶活性(高山)hAFSCs范围1 - 100μg / mL,而抑制作用是观察到200年μ克/毫升。因此,刘和他的同事证实,柚皮苷有确定hAFSCs成骨分化的影响21]。

RUNX2扮演着一个重要的角色在成骨细胞分化和骨形成和已被确定为目标的机械压力诱导成骨细胞的细胞信号。MAPK信号转导通路的激活和Ras / Raf-dependent ERK1/2激活,RUNX2和成骨细胞可以激活22,23]。此外,成熟的成骨细胞的分化阶段可以合成和分泌OPN和OCN,反映成骨细胞的表达水平(24]。在目前的研究中,重要的表达RUNX2OPN, OCN,胶原蛋白我发现表明hPDLSCs的活跃的分化。

增殖和成骨分化的结果在体内与体外的过程相一致。明显的骨小梁,包围表面成骨细胞,观察向nanohydroxyapatite嵌入。与此同时,他走时染色显示,骨小梁的成熟度的实验组比对照组。此外,免疫荧光结果表明OPN的平均光密度和OCN实验组比对照组更大。结合的柚皮苷干预成骨分化hPDLSCs加速和硬组织的形成是受益在很短的时间内(25]。

4所示。结论

在这项研究中,柚皮苷用于刺激hPDLSCs体外和体内。结果表明,柚皮苷,骨碎补的主要活性化合物,具有识别hPDLSCs增殖和成骨分化的影响。目前的体内研究是两个月的时间;因此,长期疗效评价的柚皮苷在未来需要进行。

利益冲突

作者宣称没有经济利益,无论是直接还是间接的,在产品或信息列出。

确认

本研究支持的龙源研究基金创新人才(B, 041230)和中央大学的基础研究基金(861500)。