文摘

人类间充质干细胞(hMSCs)显示潜力巨大的治疗目的。然而,hMSCs低频的身体和困难在扩大他们的数量在体外限制了它们的临床应用。为了开发一个替代hMSCs的扩张战略在体外涂,我们组织培养聚苯乙烯与头发角蛋白提取和研究细胞的行为从2捐助者在这些表面上。涂层导致均匀分布的纳米尺度的角蛋白珠具有显著的亲水性。细胞附件化验结果表明,keratin-coated表面能够温和donor-to-donor可变性与noncoated组织培养聚苯乙烯相比。STRO-1表达持续或增强keratin-coated hMSCs讲究的上表面。这翻译成显著增加hMSC种群的克隆形成效率,当这些细胞被连续通道。人发角蛋白丰富,可能构成一个可行的替代其他动物源的生物材料。此外,我们的研究结果表明,头发角蛋白可以有效地调节微环境足够丰富hMSCs克隆形成效率高体外为临床应用。

1。介绍

多功能,自我更新人类间充质干细胞(hMSCs)承诺用于组织工程和再生医学的工具,因为他们的能力分化成无数组织血统,包括骨,软骨,脂肪和纤维结缔组织(1]。他们已经获得了来自多个成熟的组织,包括骨髓、脐带,脂肪组织(2少),提高比胚胎干细胞的伦理问题。尽管有这样的承诺,很少有hMSC临床应用,已获得监管部门的批准。广泛使用的障碍包括:有限数量的自体hMSCs可以收获的任何组织和multipotency期间的损失在体外扩张(3,4]。因此迫切需要策略,使hMSC数量的扩张在体外在不影响他们的自我更新和分化能力。

重大努力投入发展中基质支持更高层次的hMSC依恋,multipotency扩散和维护。材料如poly-L-lysine、纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白,当涂布文化表面上,所有支持hMSCs的有效维护在体外(5- - - - - -7]。其中,纤连蛋白涂层是一种使用最广泛的。糖蛋白纤连蛋白是许多细胞外基质的重要组成部分,在其负责支持细胞粘附。它包含绑定蛋白聚糖和蛋白序列α5β1,αIIbβ3,αIIbβ1,αIIbβ3,和α4β1(8]。在基底薄片层粘连蛋白,一个丰富的糖蛋白,具有许多生物活性,已被证明丰富成骨细胞在胎儿老鼠头顶细胞祖细胞在体外(9,10]。胶原蛋白I-coated表面已经被证明是提高MSC增殖(11]。

与纤连蛋白相似,人类头发角蛋白包含LDV (Leu-Asp-Val)细胞粘附的主题被整合素α4β1(12,13]。角蛋白属于中间丝蛋白家族中发现羊毛、钉子、蹄、角、羽毛、和人类的头发(14]。虽然他们被认为为主要结构的目的,他们现在已知与转导通路及其突变的原因一些上皮疾病在人类15]。他们拥有不同的优势生物材料,包括丰富,生物降解能力,内在的生物活性,是一种可行的自体来源的人工材料,可以收获16]。近年来,人们越来越感兴趣的应用人类头发角蛋白等生物医学目的伤口敷料、组织工程和药物输送。尽管角蛋白制成各种各样的格式,包括水凝胶纤维,和电影14,17,18),据报道关于他们的潜能作为表面涂层增强细胞的行为。之前我们已经表明,keratin-coated表面鼓励小鼠成纤维细胞表达大量纤连蛋白的组织培养聚苯乙烯,建议他们可以作为细胞外刺激唤起特定的细胞反应(19]。我们评估的影响keratin-coated表面hMSC函数。我们的研究结果表明,角蛋白确实可以调节hMSC活动和值得进一步优化发展他们的能力。

2。材料和方法

2.1。人类的头发角蛋白的提取

丢弃的头发从当地沙龙在新加坡,混合,用洗涤剂洗广泛,进一步用乙醇清洗之前,在室温下用电吹风。干头发然后浸泡脱脂的氯仿和甲醇的混合物(2:1,v / v)为24小时。后续提取角蛋白是由混合硫化钠的头发到0.125米(Na2年代;Sigma-Aldrich)在去离子水和孵化的混合物4 h 40°C。由此产生的混合物被过滤和去离子水透析对5 L纤维素油管(MWCO: 12400;Sigma-Aldrich)。提取的蛋白质浓度测定的660 nm蛋白质化验(热科学、美国)根据制造商的指示。

2.2。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和Coomassie蓝染色

确定样本质量通过sds - page, 20μg中提取角蛋白样品的混合5μL锂十二烷基硫酸盐(像)样品缓冲(美国表达载体)和2μL(样本还原剂(德勤10 x)(美国表达载体)和超过20的总量μ用去离子水L。每个样本被加热变性在75°C 10分钟之前加载到预制NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris凝胶(美国表达载体)。电泳是在恒定电压120 V 90分钟0.05% NuPAGE morpholinepropanesulfonic酸(拖把)SDS运行缓冲(美国表达载体)。随后,分离蛋白质在凝胶沾SimplyBlue Coomassie SafeStain(美国表达载体)60分钟,使退色一夜之间在去离子水瓶。可视化之前,这种凝胶是干DryEase Mini-Gel烘干系统(美国表达载体)。

2.3。角蛋白涂层

NunclonΔ表面组织培养聚苯乙烯(安全和)菜(100毫米;热科学、美国)和24-well NunclonΔ表面安全和板块(美国热科学)涂上了80μ克/毫升(4毫升和138年μL,职责。一夜之间)的角蛋白溶液在4°C。涂层后,表面与磷酸盐缓冲盐水清洗一次(PBS)和离开站在室温下15分钟。裸露的菜肴和井作为消极的控制。

2.4。水接触角测量

静态水接触角测量在室温下,keratin-coated和裸(控制)的表面,使用FTA32接触角和表面张力分析仪(分析技术、新加坡)。共有十二个测量每个表面都被记录下来。

2.5。原子力显微镜(AFM)

使用单光束硅悬臂探针表面形貌记录(Veeco RTESP:共振频率300 KHz,名义上的尖端曲率半径10 nm,和力常数40 N / m)在开发模式中,在毫微秒示波器iii a(美国Veeco仪器)原子力显微镜。

意思是表面粗糙度值( 每样品)的四个随机领域,从3独立实验,计算使用6.13毫微秒示波器r1软件(数字仪器,美国)。在必要时,数据集记录之前受到一阶压扁吗 值。

2.6。人类间充质干细胞(hMSC)文化

人类msc是孤立的,像前面描述的那样20.从人类骨髓单核细胞(BMMNCs;美国Lonza)从两个年轻男性捐赠者的年龄,20 - 23日系指为捐助者和人类b . msc孤立特征(21在使用前)。细胞被维护在hMSC维护媒体由低葡萄糖(1000 mg / L)杜尔贝科修改鹰媒体(DMEM;Biopolis共享设施,* *、新加坡),10%胎牛血清(FCS)(美国Hyclone), 100单位/毫升penicillin-streptomycin(美国表达载体Gibco),和2毫米谷酰胺(美国表达载体Gibco),在37°C和5%的公司2。细胞被播种在3000 /厘米2在每个通道和培养2或3通道keratin-coated和裸盘,直到他们到达subconfluency之前接受附件,扩散,标记表达评估。

2.7。细胞连接试验

细胞被播种在3000厘米2在80年板涂有或没有μg / mL角质并允许坚持2到6 h。此后,独立的细胞被PBS和其余连接细胞被取消使用0.125% trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸(EDTA)和计算使用番石榴ViaCount FLEX试剂和番石榴easyCyte ViaCount分析软件8 ht台式流式细胞分析仪(美国默克密理博),显示供应商的指令。

2.8。细胞增殖实验

连续一段人类msc(段落5至7)从井中除去0.125% trypsin-EDTA subconfluency。细胞生存能力和数字然后由番石榴ViaCount系统如上所述。

2.9。流式细胞术

确定hMSC表型,CD49a流式细胞术和STRO-1水平进行评估。人类msc通道5或7被移除的菜肴使用TrpLE选择(美国表达载体Gibco)和中和hMSC维护媒体。随后,他们在各自的清洗和resuspended主要抗体稀释染色缓冲区,它由2% FCS和0.01% (w / v)的叠氮化钠(美国Sigma-Aldrich)在PBS。藻红蛋白(PE)共轭鼠标反CD49a主要抗体(美国BD生物科学)是稀释在染色缓冲区1:50和孵化hMSCs 60分钟在黑暗中在4°C。细胞被洗了两次,然后在染色resuspended缓冲区和BD FACSArray生物分析仪分析。STRO-1主要抗体被斯坦Gronthos教授,请提供学校医学科学,健康科学学院,阿德莱德大学,澳大利亚,杂种细胞上清液中直接稀释的hMSCs在室温下45分钟。细胞被探测PE-conjugated山羊anti-mouse IgM(美国表达载体)45分钟在4°C在黑暗中,在洗之前和分析如上所述。获得的数据进行了分析与软件版本7.6.5 FlowJo(树明星,Inc .)、美国),在2%闸门控制各自的同形像。相关的同形像的主要抗体作为消极的控制。实验进行了一式三份和结果表示为阳性细胞的平均百分比表面标记分析。

2.10。纤维母细胞克隆形成单位(CFU-F)测定

CFU-F试验,150 hMSCs通道5或7被播种/ 100毫米盘和维护增长一段14天。媒体改变了7天,之后每隔2天。细胞培养是在第14天终止,殖民地使用0.5% (w / v)结晶紫染色(美国Sigma-Aldrich) 100%甲醇(美国默克公司)和顺序与PBS和去离子水冲洗。殖民地在每道菜是由两个不同的个体数盲样的身份。只有殖民地没有接触邻国殖民地和由50多个细胞或直径≥2毫米被考虑。

2.11。统计分析

所有定量值被表示为±标准差, 或6,这取决于实验。使用学生的统计分析 以及或单向方差分析,借助GraphPad棱镜version 6(美国GraphPad软件)。 值小于0.05显示显著差异。

3所示。结果与讨论

hMSCs有限的可用性仍然是一个重大障碍的路径实现其全部临床潜力。使用先进的细胞培养策略,结合新一代的生物材料,显然是未来的发展方向,这样可以获得足够的干细胞数量可能在最短的时间内(4,22]。虽然与动物ECM蛋白质涂层表面有很长的文献出处,这样的方法会阻碍他们最终翻译由于监管限制。因此我们要求来检查一个新颖的方法,涂料的安全和使用来自人类头发角蛋白。

3.1。Keratin-Coated组织培养聚苯乙烯的制备和表征

角蛋白提取协议利用这里了~ 20毫克/毫升的溶液浓度。与以前的工作相一致,coomassie中sds - page凝胶显示存在两个不同的分数(图中提取的样本1)。利用免疫印迹,我们先前已经表明,这两个乐队39 - 45 kDa I型(酸性)角蛋白,而单一的乐队在50 - 55 kDa II型(基本)角蛋白(17,23]。


图1
sds - page分析,从头发中提取的蛋白质。巷1:蛋白质梯子;巷2:代表coomassie中样本hair-extracted蛋白,角蛋白的存在两个主要的分数是显而易见的。

裸的表面形貌和keratin-coated安全和使用AFM研究。如图2(一个)裸安全和表面表现出一系列面向随机线特征对原始文化的文物板材料。这些也被观察到的背景keratin-coated表面。然而,除了这些,keratin-coated表面一层随机显示,但均匀分布,直径在40 - 50 nm点状的特性。这些特性是纳米尺度的角蛋白珠中清楚地观察到3 d AFM图像。平均粗糙度( 裸的)和keratin-coated安全和表面 纳米和 分别nm。我们先前表明,纳米尺度的角蛋白小球细胞培养表面增强纤连蛋白生产成纤维细胞(19]。与msc、McMurray等人表明,纳米电子束光刻加工成聚已酸内酯的特性促进其增长(24]。同样,人类胚胎干细胞也应对不同表面nanotopography [25]。测量水的接触角进行确认角蛋白吸附在表面亲水性的影响。如图2 (b)意思是水接触角 °裸安全和和 °为keratin-coated安全和,表明角蛋白吸附后创建一个更亲水表面。

(一)原子力显微镜
(一)原子力显微镜
(b)水接触角测量
(b)水接触角测量
图2
不加涂层的表面特征和keratin-coated安全和。(一)2 d和3 d AFM图像显示地形表面和平均粗糙度( )。(b)水接触角测量显示增加亲水性在角蛋白涂层; 。
3.2。细胞吸附和扩散

本研究中使用的两种群hMSCs来自个人相同的性别和年龄。尽管如此,观察细胞反应的差异,可能是由于固有的遗传变异。未经涂布的表面,donor-to-donor变化在细胞附件效率是显而易见的(数据3(一个)和3 (b))。两个小时后播种,~ 80% hMSCs从捐赠者已经附加到裸露的表面,而只有~ 62%的捐赠B hMSCs。然而,这种差异成为无关紧要的6小时后,两组hMSCs注册接近90%附件。相比之下,keratin-coated表面似乎减轻这个捐赠的可变性。两组hMSCs显示类似附件率,达到80% ~ 60%,2小时~ 6小时。两hMSC人口记录可比扩散率在三段落(P5 P7)裸和keratin-coated表面(数字3 (c)和3 (d))。这表明角蛋白不妥协供体细胞的增殖能力。

(一)捐赠一个附件
(一)捐赠一个附件
(b)捐赠b附件
(b)捐赠b附件
(c)捐赠激增
(c)捐赠激增
(d)捐赠B细胞增殖
(d)捐赠B细胞增殖
图3
细胞的吸附和扩散。比例的附件(a)捐赠的hMSCs裸和(b)捐赠b, keratin-coated安全和表面/ 2和6 h; , 。累积细胞数量的hMSCs从捐赠者(c)和(d)捐赠B裸和keratin-coated安全和表面/ 2通道; 。
3.3。干细胞标记物的表达

STRO-1和CD49a被选为关键hMSC生物标志物在这项研究中;CD49a, 整合素亚单位,调节MSC粘附ECM蛋白质如胶原蛋白和层粘连蛋白(21,26,27]。这里,STRO-1表达不同的初始水平对MSC的数量(图5 - 8%4(一)),它是在预期的范围内可行的主要细胞(28,29日]。STRO-1表达式捐赠的hMSCs通道5明显高于keratin-coated表面而不加涂层的表面。没有观察到的差异在STRO-1表达式通过7在供体细胞。捐赠者B, STRO-1表达提高了3%当培养keratin-coated表面两个段落(P5 P7),而扩张裸表面显示稳步下降(图4 (b))。类似于细胞附件结果,keratin-coated表面减轻donor-to-donor可变性,至少可以维持,有时提高STRO-1表达式。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
干细胞标记流式细胞术分析表达式。人类从捐赠者msc和捐助B培养裸或者keratin-coated表面从通道4通道7。干细胞标记STRO-1 (a和b)和CD49a (c和d)评估通过5和7。所有情节都显示相对百分比表达水平。代表散点图(FSC, 设在SSC, 设在)显示控制的活细胞,而直方图显示表面标记的分布表达式; , 。

CD49a表达式捐赠文化keratin-coated表面似乎低于裸表面在章节5和7(图4 (c)),尽管这种差异没有统计学意义。相比之下,表达CD49a捐赠者B keratin-coated表面的一半,在裸露的表面通过5(图4 (d))。然而,通过通道7的表达水平CD49a keratin-coated表面已经从19%上升到38%,这是相当水平,之前报道(21),类似于裸表面的表达水平。全面地考虑,似乎,虽然CD49a表达有点压抑,hMSC粘附和增殖没有妥协当keratin-coated表面培养(数字3(一个)和3 (b))。这表明hMSC粘附keratin-coated表面被减轻通过其他整合素α子单元,也许α4变体,也认识到LDV细胞粘附图案出现在头发角蛋白(13]。

3.4。克隆形成

STRO-1表达式不仅与识别(30.)和维护hMSC具备干细胞(26,31日),还涉及组织旁分泌信号。Psaltis等人最近证明STRO-1-positive hMSCs释放更高水平的细胞因子能增加心肌细胞增殖和管形成由内皮细胞(32]。也知道STRO-1强烈的表达与hMSCs的克隆形成能力(31日]。的确,我们CFU-F试验结果表明,这两个捐赠者hMSCs持续或增加STRO-1表达水平,培养keratin-coated表面时,也形成了更多的殖民地在同一段落。如图5集落形成的效率在所有文化中只有一个通道后显示无显著差异在不同的表面(通道5)。然而,通过7,扩大后连续3通道在不同的表面,hMSCs来自捐赠者的克隆形成效率培养keratin-coated表面增加了~ 25%,而未经涂布的表面保持不变。

(一)CFU-F捐赠一个试验
(一)CFU-F捐赠一个试验
(b) CFU-F化验为供体b
(b) CFU-F化验为供体b
图5
克隆形成的效率(a) a和b (b)捐赠捐赠hMSCs扩大后裸或keratin-coated安全和1通道(P5 P4,评估在P5)和3通道(P7 P4,评估P7)。相应的显微图上面的柱状图描述代表hMSC殖民地与结晶紫染色; , 。

许多策略被使用在试图保持干细胞的质量在体外扩张(22),与文献报道关于biomaterial-coated表面有些变量和有时是矛盾的。所承诺的生物材料包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和多种异构脱细胞矩阵(5- - - - - -11]。一个混杂因素是底层涂层的底物的性质了。衬底的表面和机械性能需要仔细考虑提供公平的比较不同的涂层材料。歌等人证明了人类胶原蛋白type-1-coated硅胶膜表面导致减少hMSC扩散。相比之下,人类纤连蛋白涂在同一硅胶膜表面增强hMSC附件但不影响他们的扩散33]。在这里,角蛋白涂层进行严格的安全和表面。在类似的实验中,钱和萨尔兹曼发现,安全和表面涂有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白没有导致任何差异的扩张和神经元分化的msc。相比之下,安全和表面涂有50毫克/厘米2人工基底膜,主要由鼠层粘连蛋白、胶原IV型,和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,不仅增强神经元分化,还大大改善了msc的增殖能力5]。在这里,涂层安全和头发角蛋白的解决方案在80年μg / mL导致显著降低涂料的密度650 ng /厘米2(19),导致有效维护STRO-1表达增加克隆形成。

4所示。结论

从两个人类间充质干细胞捐赠者在2 d安全和培养表面涂上头发角蛋白为80μ克/毫升。涂层表面的表面粗糙度增加,亲水性增加;他们也能温和donor-to-donor可变性的细胞连接效率而不损害他们的增殖能力。人类MSC附件上通过CD49a keratin-coated表面没有监管。hMSC人口的最重要的是,STRO-1表达式keratin-coated表面保持或显著增加,而转化为更高的克隆形成效率。第一次在一起,这些结果表明使用keratin-coated表面丰富的潜在的天真和功能性hMSCs。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Pietradewi Hartrianti和玲玲有同等的贡献。

确认

作者要感谢资金来自教育部的支持,新加坡(一级AcRF RG42/13) Kee Woei Ng和机构的科学、技术和研究(* *),生物医学研究理事会和医学生物学研究所,新加坡。