文摘
肾脏再生可能提供了一个取之不尽的组织和器官来源immunosuppression-free移植。目前获得了相当大的关注,可能会取代肾透析作为最终肾功能衰竭的治疗策略。然而,解剖并发症使肾脏再生困难。在这里,我们审查肾脏再生领域的最新进展,包括(i)诱导多能干细胞的定向分化/胚胎干细胞成肾细胞;(2)胚泡去补体;(3)使用脱细胞尸体脚手架;(四)胚胎器官移植;和(v)使用日益xenoembryos肾原性的利基新创肾脏干细胞的再生。所有这些方法代表了潜在的有前途的治疗慢性肾脏疾病患者的治疗策略。尽管许多肾脏再生障碍依然存在,我们希望创新策略和可靠的研究最终将允许修复终末期肾脏疾病患者的肾功能。
1。介绍
移植是最理想的方法,恢复患者的器官功能器官衰竭。然而,缺乏合适的可用捐献器官是一个严重的问题在世界范围内(1]。再生医学有潜力提供最终的治疗各种疾病用自体的细胞重建新的器官和取代失败的器官,并因此近年来获得了相当大的关注。
目前没有发表的临床报道关于终端的功能器官的再生治疗器官衰竭。肾脏再生是特别困难的,因为器官的解剖的复杂性(2),和重建肾脏的立方结构是很难的。肾脏功能,维持内环境稳定和负责血液过滤和尿液生产,以及内分泌功能的控制通过促红细胞生成素(Epo)和维生素d。到目前为止,所有的组成细胞的再生肾脏尚未实现。然而,有可能是肾脏再生可能通过渐进的干细胞研究的进展和细胞工程(图1)。
再生整个肾脏的可能很困难,但10%的功能恢复肾脏滤过功能可能允许撤出透析的终末期肾脏疾病患者(ESKD) [3),因此极大地提高生活的质量。肾脏功能的再生是一个巨大的现实挑战。然而,研究再生领域继续取得进展,目的是克服ESKD通过肾脏再生。在本文中,我们考虑当前肾脏再生的进步,包括诱导多能干细胞(iPSC)技术和肾生物工程,我们讨论一些相关的限制和挑战。
2。定向分化诱导多能干细胞和胚胎干细胞成肾细胞
先前的研究已经表明,多能干细胞已经被认为有可能分化成体内任何细胞类型和自组装成不同组织或器官4- - - - - -6]。已经确实被证明产生成熟的细胞在体外。已经因此代表了生物工程的一个重要的细胞类型策略旨在肾脏再生。已经被包括胚胎干细胞(ESCs)和万能。ESCs源于胚胎和生长在原始文化4),而产生的细胞则通过终末分化细胞转染原癌基因等因素,Oct4、Klf4, Sox-2 [5,6]。已经被成功地分化成不同类型的细胞和组织,包括肠(7),肝8,9,神经10,11),血液12),胰腺(13,14),和心脏血统(15]。这种方法,或者ESCs的细胞则是分化成肾或其他祖细胞,称为“定向分化”,通过序贯应用的化学物质或生长因子。
干细胞研究的最新进展人类肾元祖细胞生成,包括中间中胚层(IM)和后肾间质细胞(毫米)(16- - - - - -21]。了解肾脏发展的过程和分子机制是重要的生产适当的细胞产生肾元。肾脏来源于IM和来自输尿管的萌芽,MM以下精确计时的多个信号之间的相互作用(22]。不同的研究人类已经使用了不同的生长因子协议(hPSCs);然而,Wnt兴奋剂CHIR99021是常用的促进中胚层分化16]。
高通量化学筛选和低分子量化合物最近被用于定向分化为肾的形成。一个有效的方法已经开发了诱导肠细胞的分化hiPSCs /为其使用的激活素a和CHIR99021生成中胚层,其次是结合治疗骨形态形成蛋白7 (BMP7)和CHIR99021 [17,18]。这个协议诱导hiPSCs发展成odd-skipped-related 1 (OSR1) +肠细胞的效率大于90%18]。此外,大约1821的化合物的高通量筛选确定了两个视黄酸受体受体激动剂,AM580 TTNPB,有效地诱导人类万能干细胞的分化(hiPSCs) / ESCs成肠细胞(23]。hiPSC记者使用的高通量筛选系统,绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列被OSR1基因位点,允许小分子增加了OSR1 +细胞的诱导率通过流式细胞术定量识别。GFP表达检测使用一个光敏电阻Fortessa细胞分析仪配备了高通量取样器(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。他们建议小的化合物是更便宜和更一致的生长因子和因此可能更适合产生肠细胞(18,23]。本研究证明了监测的可行性hiPSCs nephrogenic-differentiation能力,提供了一种新的策略调查的效率和特异性的方法实现肾hiPSCs分化。
许多研究都试图从已经生成MM祖细胞直接分化。夏等人试图区分已经进入输尿管的芽逐步治疗(乌兰巴托)谱系细胞的细胞则/为其与纤维母细胞生长因子2的组合(FGF2)和BMP4 2天,紧随其后的是联合治疗与激活素a和BMP2 2天。4天之后,类似即时细胞表达我们,OSR1, WT1和LHX1生产。乌兰巴托标记HOXB7、RET和GFRA1调节这些细胞在一个额外的2天的分化,这意味着已经可以驱动对乌兰巴托progenitor-like细胞。此外,在体外已经生成细胞的分化与UB-committed IM的命运可能将自发地组装成复杂,嵌合三维(3 d)结构在coculture与小鼠胚胎肾细胞(19]。然而,分化效率很差,虽然原因尚不清楚。
直接分化战略已经取得了显著的进步在过去的几年里20.,21]。Takasato et al。20.和田口等。21)指出,肾元祖细胞是来自已经被。肾脏的发育起源是众所周知的。Takasato et al。20.)诱导的原条为其使用苯丙酸诺龙(或CHIR99021)和BMP4。协议,两组相似(20.,21用于诱导IM),但随后的协议从后原条不同分化。形成的分化为肾小泡结合分离胚胎小鼠肾脏细胞研究Takasato et al .,涉及人类细胞小鼠肾脏结构的集成(20.]。相比之下,田口等人证明了诱导肾结构更为合理的协议如肾单位和近端小管(21]。他们提议的概念“posteriorization”诱导肾元祖细胞从已经在老鼠和人类模型(21]。简单地说,肾元祖细胞的MM可以来自后方的IM。Brachyury,由T基因,编码是一个代表原条,后新生的中胚层的标志24]。后方位于T +中胚层是一个假定的轴向祖细胞的一部分,最近确认为尾身体躯干的来源(25]。他们还认为有差异后方位于毫米之间的发展过程和在前面中胚层组织如心,已成功地诱导T +状态已经被通过的,最初短的分化(26]。即时通讯的能力不同暂时(E8.5与E9.5)和空间(前后的),和OSR1 +或处于PAX2 +细胞被认为代表一个齐次人口(21]。本研究表明,乌兰巴托的前兆是坐落在前面在肠细胞缺乏T E8.5已经分开,MM本地化的T +后新生的中胚层。令人惊讶的是,T +后新生的中胚层是OSR1负但包含肾元祖细胞(21]。Lineage-tracing实验表明,MM前身可以追溯到OSR1 +后IM E9.5和T + / OSR1 +后中胚层E8.5 [21]。相同的研究还建立了一个有效的协议后新生的中胚层诱导后肾的肾元祖细胞的使用结合high-CHIR99021 (10μ米)和BMP4 posteriorization,其次是与mid-CHIR99021联合治疗(3μ米)和BMP4的视黄酸和激活素A .最后一步涉及添加low-CHIR99021 (1μ米)和FGF9 1天。他们终于验证了基因表达的时间动力学感应过程的每一步。Wnt信号对posteriorization[很重要25,27]。的确,高浓度的CHIR (Wnt受体激动剂)被用于结合BMP4维护后新生的中胚层posteriorization阶段(21]。他们建立了感应的MM T +尾前兆。他们还建立了逐步分化的协议ESCs老鼠和人类万能后肾的肾元祖细胞,从而使肾脏生成使用多个stage-specific生长因子(21]。Coculture拟胚体,含有肾元祖细胞,小鼠胚胎脊髓,肾脏tubulogenesis行之有效的诱导物,导致三维管状结构的形成表达标记肾小球和肾小管的特征(21]。虽然作者无法证实尿生产或其他肾脏功能,这对于肾脏再生直接微分法似乎是迄今为止最完整和可靠的研究。
生成精确的肾祖细胞对整个肾脏的发展至关重要新创。诱导肠细胞的分化成精确的肾祖细胞将允许一个完整的3 d肾脏结构从已经被建造。然而,成功的方法再生再生肾之间的功能性血管系统和收件人仍然未知。此外,在活的有机体内再生肾脏功能尚不清楚。然而,进一步发育生物学和生物工程的进步可能解决这些问题,让整个肾脏再生。
3所示。囊胚互补
注入已经成囊胚,最初的受精后胚胎阶段,两行细胞同步发展,合并后的胚泡生成一个嵌合的身体。在这种方法的第一次报告,正常的ESCs被注入囊胚2-deficient recombination-activating基因的老鼠,没有成熟的B和T淋巴细胞,产生体细胞嵌合体ESC-derived成熟B和T细胞(28]。这种“囊胚互补”系统是应用于多种组织和器官的重建,包括胸腺上皮细胞(29日,心30.],卵黄囊造血作用[31日),生殖细胞(32),肝细胞(33),胰腺(34,35),和肾36]。最近的一项研究使用囊胚互补生成一个功能器官,小林等人表明,注入老鼠Pdx1万能−/−(pancreatogenesis-disabled)小鼠胚泡产生新生鼠/鼠标嵌合体与胰腺几乎完全来自老鼠万能(34]。老鼠和老鼠PSC-derived胰腺产生胰岛素,PSC-derived胰腺胰岛移植的改善高血糖糖尿病啮齿动物模型(37]。本研究表明,PSC-derived细胞子代可以占领和开发空发展利基。此外,这些结果也表明,种间的囊胚互补可以用来生成器官来自捐赠者已经在活的有机体内使用异种的环境(36,37]。这个囊胚互补系统已经应用到整个肾脏重建(36]。Nondeficient小鼠细胞则是从kidney-deficient小鼠囊胚注入缺乏SAL-like 1肾脏发育所必需的蛋白质,和新生儿小鼠肾脏几乎完全来自注入万能(36]。然而,血管和神经系统都不是由细胞iPSC的起源,因此肾脏是不完全补充。再生肾脏免疫组织化学分析表明,肾血管系统,包括肾节段、大叶性,interlobar,弧形,小叶间小动脉,是来自两个宿主细胞的嵌合结构和供体细胞则36]。精确的尿分析没有进行过滤和吸收尿液是否生产尚不清楚。此外,注入老鼠进kidney-deficient小鼠胚泡的细胞则未能产生鼠肾脏在老鼠身上。这个结果意味着老鼠参与相互作用的关键分子间质和乌兰巴托与老鼠也没有交叉作用。代异基因的器官使用种间胚泡因此需要一个宿主动物菌株缺乏所有肾血统(36]。
与囊胚互补相关的最重要的问题是道德问题。是不可能排除的可能性产生了种间嵌合体大脑包含来自已经被注入。尽管很难建立一个异种的囊胚互补系统,克服了异种的障碍,这一策略似乎是最有前途的方法之一,肾脏再生。
4所示。成人肾脏干细胞/祖细胞重建
从许多成人器官分离干细胞/祖细胞证明自我更新能力并能产生终末分化细胞。这个肾脏干细胞/祖人口消失在成人肾脏,可能是因为失去的利基(37,38]。然而,肾干细胞/祖细胞仍然存在于特定位置的成人肾,如肾乳头(39),肾小管上皮细胞(40),肾小球囊(41],S3的近端小管(42,43]。北村等人最近报道,成人肾脏干细胞/祖细胞来源于S3的成年大鼠肾脏肾元能够重建3 d kidney-like结构在体外(44]。Kidney-like结构时形成一个集群的肾脏干细胞/祖细胞悬浮在一个细胞外基质凝胶和培养的几种生长因子(神经胶质细胞衍生神经营养因子、基本FGF,肝细胞生长因子、表皮生长因子,和BMP7)。的集群分离S3-segment悬滴法引发的细胞在3 d文化(44),而二维培养条件无法重建kidney-like结构。令人惊讶的是,重建kidney-like结构包括肾脏子结构,包括肾小球、近端小管,亨利循环,远端小管,和收集管,但不是脉管系统。他们建议一个集群的组织干细胞/祖细胞可能有能力重建器官的最小单位区分为专门的细胞起源的正确的利基。肾脏干细胞/祖细胞来源于S3的成年大鼠肾脏已被证明表达干细胞标记物如本来,c - kit,巢蛋白,和Musashi-1一起肾谱系标记如PAX-2和WT-1 [44]。他们认为这些细胞类似于后肾间充质细胞,根据标记蛋白表达。然而,集群可以分化成collecting-duct-like细胞或mesangial-like细胞,不认为是源自毫米(44]。在这方面,是否成人肾脏干细胞能够分化成其他血统比乌兰巴托或毫米还有待回答。kidney-like结构没有血管,不产生尿液。然而,成人肾脏干细胞仍知之甚少。未分化的潜在致肿瘤性hiPSCs是一个关键问题,这些细胞作为临床来源,而成年干细胞/祖细胞已报告时nontumorigenic注入小鼠模型(45- - - - - -47]。这些报告提高成人干细胞可能代表一个更安全的可能性比已经被临床来源。是否有可能建立成人干细胞/祖细胞与multipotency肾脏重建,他们可能有前途的肾脏修复和再生的细胞来源。
5。脱细胞尸体的脚手架
本机肾细胞外基质(ECM)据报道为细胞提供一个支架播种,为干细胞分化成整个器官(48]。ECM在肾脏发育和修复中扮演着重要的角色48- - - - - -52]。ECM分子及其受体影响器官形成和修复通过提供一个支架的空间组织细胞,分泌和储存生长因子和细胞因子,通过调节信号转导(48- - - - - -53]。从整个human-cadaveric ECM支架和动物器官可以由detergent-based去细胞生成1,54]。这种策略被奥特et al。55)开发功能性鼠的心。一个全心与完整的3 d几何和血管支架是由冠状动脉灌注与洗涤剂到尸体的心脏。老鼠的心脏当时播种新生儿心肌细胞和大鼠主动脉内皮细胞,随后诱导形成的收缩心肌中风执行工作(55]。脱细胞尸体的支架也被用于其他器官系统,包括肝脏(56],呼吸道[57,神经58],肌腱[59)、阀门(60),膀胱(61年),和乳腺62年]。此外,一些研究decellularization-recellularization技术用于肾脏再生。许多动物被用于去细胞的研究,包括大鼠(63年],恒河猴[64年),和猪(65年]。然而,这种方法产生的再生肾脏没有足够的肾功能产生尿液和促红细胞生成素。歌等人最近描述了成功再生的整个肾脏移植后产生的尿液(66年]。值得注意的是,他们生成3 d非细胞肾灌注去细胞支架的尸体的老鼠,猪,和人类的肾脏。内皮和上皮细胞被灌注添满,导致肾建设可行的组织的形成。然而,注入细胞分化的机制,并策划与脉管系统产生尿肾元尚不清楚。脱细胞尸体支架与大量血栓的问题,尽管有很强的抗凝预防。虽然这一策略仍有许多障碍,它展示了再生医学对器官移植的影响及其潜在的解决方案捐献器官的短缺。
6。组织工程的生物人工肾:肾小管辅助装置
组织工程的发展领域是细胞疗法的延伸,在生物科学和工程技术相结合来创建结构和设备,以取代失去的组织或器官功能(67年,68年]。生物人工肾的发展(改革)代表之间的交集再生医学和肾脏替代治疗52]。肾小管辅助装置(RAD)包含生活肾近端小管细胞已经成功地改造,它演示了差异化的吸收、代谢和内分泌功能类似于正常的肾脏在动物实验中在体外和体外(69年]。简单地说,肾近端小管部分是从肾脏,肾小管祖细胞选择和扩展70年]。的培养基中生长的小管祖细胞培养基含有特定添加剂(68年]。高通量血液滤过的RAD墨盒包含聚砜中空纤维涂pronectin-L被用作支架装置(68年]。肾近端小管细胞被播种到中空纤维和播种墨盒是连接到一个生物反应器灌注系统,extracapillary的空间充满了培养基和intracapillary空间与培养基灌注。细胞墨盒使用播种后至少14天。RAD单位包括支流层的肾近端小管细胞特征包括微绒毛,紧密联接的复合物,内吞作用的囊泡了透射电子显微镜(68年]。执行的组织工程人工RAD微分重吸收和分泌运输,因为特定的主动转运蛋白存在于近端小管细胞在活的有机体内。然而,这些传输函数是低效率比本地近端小管(68年]。同一组报道,RAD尿毒症的环境中能够保持活力与急性肾功能衰竭尿毒症的狗当放置在与传统hemofilter系列和体外血液电路(71年]。此外,他们还与改革进行临床试验72年- - - - - -74年]。再生医学和生物工程的结合从而为整个肾脏的再生提供了保证。
7所示。胚胎器官移植
我们试图再生功能,可移植的整个肾脏可以产生尿和肾激素,如Epo(促红细胞生成素)使用xenoembryo和人类间充质干细胞。哺乳动物的胚胎后肾,肾间叶原基,被认为代表一个潜在来源的再生功能整个肾脏(75年- - - - - -83年]。胚胎后肾移植到宿主动物(老鼠)能够获得其血液供应从主机(75年]。事实上,anephric老鼠的生存延长肾脏功能的基础上提供的一个移植鼠肾间叶原基、输尿管的网状主机输尿管(83年]。此外,产生的后肾移植肾激素包括促红细胞生成素和肾素,升高血压的宿主动物(77年,78年]。Metanephroi从猪胚胎植入老鼠的网膜中聚集有关受阻(79年)或免疫缺陷小鼠的肾胶囊下(81年开发功能齐全的肾单位。尿素氮和肌酐的水平高于囊肿液产生的移植metanephroi比血清从移植主机动物(81年),表明排尿。后肾移植也可以减少血管钙化与慢性肾功能衰竭大鼠(79年]和维持血压anephric与诱导大鼠急性低血压(78年),这意味着移植metanephroi进行多个肾脏功能,除了排尿。这些结果表明,后肾移植可以用来克服缺乏捐赠的肾脏移植。
我们最近表明,异种器官移植后肾可提供内生msc分化成Epo-producing机会的组织(84年]。使用特异性引物聚合酶链反应和序列分析显示,异种器官移植metanephroi,要么从老鼠到鼠标或从猪猫,Epo表达宿主动物的来源。这表明Epo-producing细胞起源于宿主动物和发展产生促红细胞生成素在移植后肾。我们进一步表明Epo-producing细胞并非来源于整合船只,而是从循环主机从骨髓msc动员。值得注意的是,传统的后肾移植需要不断的和强大的免疫抑制,避免体液排斥与异种的障碍,可引起不良反应包括致癌性和严重的排斥反应。出于安全目的,因此异种器官移植应该被丢弃在不再需要时,通过引入cell-fate-regulating系统包括一个自杀基因可以表达需求。为了避免异种的障碍,我们使用metanephroi隔绝转基因ER-E2F1 suicide-inducible老鼠。E2F1是一种转录因子,调节细胞增殖和凋亡的异位表达。xenotissue组件因此可以通过细胞凋亡,离开自体Epo-producing组织(84年]。Xenometanephroi本身因此会获得一些在宿主体内网膜肾脏功能,以及提供一个适合主机干细胞再生肾组织可以使用宿主细胞重建组件。这些技术可能有助于减少长期免疫抑制剂的副作用管理和解决围绕异种器官移植的伦理问题(85年,86年]。
8。使用一个肾原性的利基Xenoembryos增长
我们利用了开发xenoembryo作为器官发生使用干细胞利基肾血统。之前使用这种策略,我们表明,异型生物质生长发育过程xenoembryos允许外源骨髓间充质接受人类上皮转换和形成一个肾元产生尿液和促红细胞生成素(87年- - - - - -89年)(图2)。后肾的开发期间,MM最初从肾原性的绳尾部分的形式90年)和分泌GDNF,导致附近的沃尔弗氏管产生乌兰巴托(91年]。我们生成后肾器官培养的microinjecting GDNF-expressing转染hMSCs出芽的网站,和收件人胚胎生长whole-embryo文化系统。Viral-free执行操作使用thermoreversible GDNF聚合物(92年]。捐赠者hMSCs集成到基本的后肾和形态分化成管状上皮细胞,间质细胞,肾小球上皮细胞(88年]。然后我们将发达后肾移植到接受者的网膜允许血管集成功能肾单位。作为一个结果,一个hMSC-derived neokidney生成,含有人类肾元与主机相关的脉管系统(88年]。这neokidney产生尿液浓度较高的血清尿素氮和肌酐的收件人。这表明neokidney,网膜,尿液由血液滤过(88年]。此外,hMSC-derived neokidney分泌人类促红细胞生成素对贫血的诱导宿主动物(93年]。这种“器官工厂”因此能够保持正常的激素调节维持Epo水平。然而,目前的系统无法重建输尿管或收集小管源自于乌兰巴托。以确定msc可以分化成乌兰巴托祖使用小鸡胚胎,hMSCs表达我们被注入鸡乌兰巴托祖地区(90年]。细胞迁移的尾延伸沃尔弗氏管,集成到沃尔弗氏导管上皮细胞,并表示LIM1,展示的能力hMSCs分化成沃尔弗氏导管细胞的影响下当地xenosignals [89年]。这些结果表明,有可能重建整个肾脏移植肾干细胞谱系在合适的时间和地点再生毫米,乌兰巴托的衍生品。肾干细胞谱系msc易于获得大量和相对廉价的建立。msc可以收获与成体干细胞来自患者。因此我们hMSCs作为细胞来源用于肾脏再生和成功地分化成一个肾单位的结构由GDNF-transfection注入xenoembryo。还需要进一步的研究来验证使用其他成人肾脏干细胞(42]或肾元祖细胞(21由万能干细胞诱导。为了未来的临床应用肾脏再生,我们也验证了成体干细胞的影响接触尿毒症毒素长期和指出一些差异在具备干细胞的基因表达标记在msc ESKD患者。这些结果表明,这些细胞可能不是一个合适的肾脏再生来源(94年]。
基于我们之前的有前景的结果,我们目前正在调查的可能性大规模收割metanephroi从猪,因为猪的肾脏的体积几乎是相同的,在人类92年]。发达的最终大小后肾似乎印在开发的早期阶段在宿主胚胎。另一项研究也表明,种间嵌合体的体型和体重(metanephroi来自xenoembryos)符合接收者的物种(34]。我们希望,通过克服这些挑战,这种策略可能会提供一个新颖的方向产生捐赠肾脏移植的合适的大小和功能。
9。结论
本文总结了最近的研究涉及使用肾干细胞和肾生物工程整个肾脏再生功能新创。尽管重要的最新进展,重建一个完整的肾脏功能仍然困难,许多问题仍未得到解决。ESCs /万能的直接分化为肾元祖细胞尚未成功地生成成熟的功能组织在活的有机体内。再生的肾脏可以用于临床实践之前,一个方法生成功能齐全的肾组织产生尿液和促红细胞生成素有待开发。此外,再生组织必须能够长期生存和功能。未来的研究在干细胞生物学和生物工程有望解决这些问题和开门为肾脏再生新的治疗策略旨在修复肾脏损伤和恢复功能。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。