Ultrasound-Targeted微泡破坏了迁移和归航的间充质干细胞在移植心肌梗死后SDF-1 / CXCR4:一个试点研究

文摘

间充质干细胞(MSC)治疗显示了相当大的承诺治疗心肌梗死(MI)。然而,低效的msc的迁移和归航后全身灌注治疗应用有限。Ultrasound-targeted微泡破坏(UTMD)已被证明是承诺改善msc的归航缺血性心肌,但具体机制尚不清楚。我们假设UTMD促进MSC归航上调SDF-1 / CXCR4和本研究旨在探索这种潜在的机制。我们分析SDF-1 / CXCR4表达UTMD治疗后体外和体内归航的计数msc在MI地区。体外结果表明UTMD不仅导致SDF-1高架分泌,也导致了msc的比例增加,趋化因子受体CXCR4表达表面。体内研究结果显示增加的数量自导msc和更高的SDF-1 / CXCR4的表达UTMD结合msc移植组与其他组。总之,UTMD可以增加SDF-1表达式在缺血性心肌和msc移植表面趋化因子受体CXCR4的表达,它提供了一种分子机制的归航msc UTMD协助下通过SDF-1 / CXCR4轴。

1。介绍

骨骨髓来源间充质干细胞(msc)有潜在的心脏细胞再生,加速新血管形成急性心肌梗塞(MI)后1,2]。然而,一个重要的障碍临床MSC治疗的有效实施是无法达到目标组织效率高(3,4]。多个研究表明,超声波所产生的生物效应,(我们)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)可以帮助提高自导能力和MI后移植msc的效率5- - - - - -7),但UTMD机制仍不清楚。

UTMD-assisted MSC归航的机理研究近年来已经完成。一些研究显示,毛细管壁UTMD创建的毛孔,导致心肌毛细血管渗透性的增加(7,8),可能有助于促进MSC的轮回从血管到目标组织。其他一些研究发现,心肌损伤后局部微环境发挥了重要作用的趋化性和分化msc (9]。UTMD可以改变组织内的微环境引起的局部炎症反应,并提供目标组织细胞领域更适合MSC归航[10]。简而言之,目前的研究在MSC迁移的机理,并用由UTMD主要集中在形态和梗塞的心肌组织的体内微环境变化。然而,研究UTMD msc本身的影响比较少。什么是对MSC UTMD治疗后生存能力和迁移的影响?此外,表达基因或蛋白质水平的变化发生在msc吗?

SDF-1及其特定的受体,趋化因子受体CXCR4在干细胞动员发挥关键作用,趋化性,自导,移植在修复的过程中梗塞的心(11,12]。SDF-1,分泌细胞在缺血心肌或归航MSC(旁分泌作用),是最重要的控制MSC迁移趋化因子(13]。移植msc可以迁移到炎症组织沿着SDF-1浓度梯度表面通过绑定SDF-1趋化因子受体CXCR4 msc (14,15]。重要的是,绝大多数的趋化因子受体CXCR4位于细胞质中在一个高度糖基化的形式,只有一小部分culture-expanded msc表达功能趋化因子受体CXCR4在细胞膜16,17]。因此,一个有效的方法促进MSC移植和归航的upregulation SDF-1分泌在目标组织和表达的趋化因子受体CXCR4在MSC。

在这项研究中,我们假设SDF-1 / CXCR4可能UTMD-assisted MSC移植的关键因素和自导UTMD促进MSC归航的生物效应可能是通过增加SDF-1表达式在缺血性心肌和上调表达的趋化因子受体CXCR4在MSC。解决这一假设,我们准备了两种条件培养基,一个是上层清液收集从正常或缺氧培养介质的人类心脏细胞(HCM)和人类心脏微血管内皮细胞(HCMEC),另一个是心肌组织中提取获得正常的老鼠或心肌梗死模型大鼠。然后我们发现UTMD后SDF-1和膜趋化因子受体CXCR4的表达。此外,我们清点的数量归航msc绿色荧光蛋白标记,检查SDF-1 / CXCR4表达的心肌梗死大鼠缺血性心肌治疗UTMD结合静脉输液的msc。本研究的目的是确定潜在的机制UTMD改善心肌梗死后的迁移和自导系统移植msc。

2。材料和方法

2.1。实验动物

所有Sprague-Dawley (SD)大鼠用于本研究提供的第三军医大学实验动物中心。本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。所有的实验都是实验动物伦理委员会批准第三军医大学。戊巴比妥钠麻醉下进行手术,所有的努力都是尽量减少痛苦。

2.2。准备人力msc和大鼠msc

人类骨髓msc被孤立的三个健康的捐赠者,年龄在26到28年,以书面知情同意根据第三军医大学伦理委员会的指导方针,和随后的研究程序经当地伦理委员会批准。文化和扩张后,人类的msc被定义为CD44, CD105 double-positive、CD34、CD45双重否定细胞用流式细胞术。大鼠msc的股骨和胫骨骨髓中分离的3 - 4周大Sprague-Dawley (SD)雄性老鼠。大鼠msc的表型特性也与积极的表面标记CD29、CD44的负表面标记CD34、CD45。在人类脂肪形成的成功和成骨分化诱导msc和大鼠msc。所有细胞培养与DMEM / F12 (Hyclone)中含有10%的边后卫在37°C (Gibco) 5%的股份有限公司₂。第三或第四通过msc被用于后续的实验。

2.3。常氧和缺氧细胞培养的HCM和HCMEC

人类胎儿心脏细胞(HCM)(目录编号为6200)和人类心脏微血管内皮细胞(HCMEC)(产品目录号6000)获得ScienCell研究实验室(CA)圣地亚哥和在培养基中维护由制造商提供的。这些细胞提供通道2和段落之间使用3和6。当hcm或HCMECs大约80%汇合的在文化,他们收获和混合比率约1 HCMEC 4 hcm。规范化的目的,混合细胞被镀在12-well盘子1×10的总数⁶细胞/(1.2毫升/)在完全培养基和cocultured 12 h。此后,细胞受到的24小时normoxia(21%啊₂,5%的公司₂)或缺氧(1% O₂,94% N₂,5%的公司₂)。治疗后收集上层的后续研究体外。

2.4。发展大鼠心肌梗死模型

手术心肌梗死(MI)模型开发的SD雄性大鼠(6 - 7周大,200 - 250 g)。老鼠麻醉有2%戊巴比妥钠腹腔注射(40毫克/公斤)。气管插管后,动物们使用啮齿动物呼吸机机械通气(Taimeng仪器,成都,中国)。心被曝光,左冠状动脉前降(小伙子)与6 - 0的结扎缝合水平非常接近(1毫米),左心房的底部。成功的证据证实了心肌梗塞心电图上典型的s - t海拔和地区黄萎病的远端心肌表面。

2.5。准备正常心肌组织提取物(NMTE)和梗塞的心肌组织提取物(IMTE)

MI的心被两天后在全麻醉。地区缺血性心肌的认真分析,剁碎,并转移到一个5毫升管包含PBS 500毫克的比例:1毫升。混合物是均质和Pro200均质器(箴科学Inc .)、美国)和离心机在4°C。上层清液(MTE)的意义是使用0.22收集和过滤μm过滤器(美国微孔)。正常MTE获得正常SD大鼠没有小伙子冠状动脉结扎。的制备方法是梗塞的MTE一样。

2.6。超声波设备和微气泡

我们使用了一个Accusonic +(地铁医疗澳大利亚企业有限公司、澳大利亚)执行UTMD体外治疗性超声系统。美国辐照参数操作如下:我们= 1 MHz频率;工作周期= 10%;负压峰值= 0.6 W /厘米²(0.35 MPa);总辐照时间= 30年代;和剂量的MBs = 10⁶/毫升。名叫Zhifuxian Lipid-coated MBs,准备在我们部门如前所述18),用于诱导声空化。Zhifuxian制备的冻干暂停两个脂质,1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG)和1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE)和激动perfluoropropane气体机械合并者。MBs的平均颗粒直径是2μ6 - 9×10 m,浓度⁹/毫升。

2.7。体外实验分组

人类msc被收集和播种到6-well板的密度5×10⁵cell /毫升(2毫升/)新鲜完整的媒介。细胞粘附后,1毫升/培养基被和1 mL条件培养基(在下面描述)随机添加到每个。MBs与生理盐水稀释后缓慢增加。6-well盘子轻轻摇晃,然后,UTMD进行传感器底部的盘子。UTMD之后,msc是立即放置在一个孵化器。经过24小时的潜伏期在37°C公司为5%₂,所有组的msc是收获的细胞生存能力评估和趋化因子受体CXCR4检测,收集所有组的上层清液SDF-1, VCAM-1, ICAM-1 ELISA。每个实验独立重复六次。

两种类型的条件中被添加到msc的培养基和体外相应分组被分为两个部分。

(1)收集的条件培养基是浮在表面的正常或缺氧培养HCM和HCMEC媒介。

测试组设计如下:MSC在普通的DMEM / F12培养基培养组(控制);MSC +正常上层清液组(M + NS);MSC +正常上层清液+ UTMD组(M + NS + U);缺氧上层清液组(HS);MSC +缺氧上层清液组(M + h);MSC +缺氧上层清液+ UTMD组(M + h + U)。

(2)条件培养基是心肌组织提取物(MTE)获得正常老鼠或心肌梗死模型大鼠。

测试组的设计根据以下方案:MSC在普通的DMEM / F12培养基培养组(控制);MSC +正常MTE组(M + NMTE);MSC +正常MTE + UTMD组(M + NMTE + U);梗塞的MTE集团(IMTE);MSC +梗塞的MTE组(M + IMTE);MSC +梗塞的MTE + UTMD组(M + IMTE + U)。

2.8。ELISA

SDF-1的浓度,VCAM-1或ICAM-1上层清液由ELISA检测。所有ELISA试剂盒购自研发系统(美国明尼苏达州)和执行根据制造商的指示。特别是缺氧上层清液组和梗塞的MTE组non-MSCs组和样品需要被稀释在与其他组相同的方式ELISA检测规范化的目的。

2.9。评估细胞的生存能力

使用CCK-8 msc测量装备的可行性根据制造商的指示(Beyotime、上海、中国)。简而言之,所有的样品和空白控制msc是收获,播种在96 -孔板和2×10³细胞/ (100μ信用证),10μL CCK-8解决方案随后补充道。2 h孵化后,在每个细胞的吸光度为450 nm使用酶联免疫测定分析仪(美国贝克曼DU800)。细胞生存能力(%)的吸光度的比值计算示例msc和空白控制msc。

2.10。趋化因子受体CXCR4检测

流式细胞仪是用来检测趋化因子受体CXCR4的表达msc使用PE-conjugated趋化因子受体CXCR4表面抗体(美国12 g5, Santa Cruz)。PE-CXCR4 (20μ信用证样本)和治疗msc在4°C孵化为30分钟,水洗,离心机,并在500年resuspendedμL PBS用流式细胞仪分析口径血细胞计数器(美国圣地亚哥Becton Dickinson)。

荧光实时定量PCR分析探讨趋化因子受体CXCR4的mRNA的表达。24小时后孵化条件中等,总RNA提取使用试剂盒从msc试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。然后合成第一链cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类,大连,中国)。趋化因子受体CXCR4与以下引物:放大感觉5′-TTCTACCCCAATGACTTGTG-3′和反义5′-ATGTAGTAAGGCAGCCAACA-3′。作为内部控制,GAPDH还与以下引物:放大感觉5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTG-3′和反义5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。ABI棱镜7300序列执行实时PCR检测系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)使用SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司)。趋化因子受体CXCR4 mRNA表达的比例相对于GAPDH mRNA表达计算。此外,相对趋化因子受体CXCR4 mRNA表达规范化与来自对照组。

免疫印迹分析进行了检测趋化因子受体CXCR4的表达蛋白在msc。msc治疗细胞溶解和细胞总蛋白(40μg) 12% SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离和转移到PVDF膜。TBS + 0.1%的膜被Tween-20 (TBS-T)含5%脱脂牛奶2 h,然后孵化一夜之间在室温下用兔子anti-CXCR4抗体(Abcam 1: 500年,剑桥,英国)最后孵化与山羊anti-rabbit IgG抗体(Beyotime 1: 100年,中国上海)第二天1 h。蛋白质乐队进行扫描和蛋白质表达的趋化因子受体CXCR4被测密度术量化对GAPDH和规范化。

2.11。Transwell迁移分析

transwell迁移试验的测试组是相同的如上所述,除了删除缺氧的上层清液组和梗塞的MTE组。此外,AMD3100 SDF-1 / CXCR4轴的抑制剂,用于迁移试验。短暂,msc是收获,resuspended serum-poor介质,播种上院(100μL, 1×10⁶/毫升)的24-well transwell板与8 -(美国康宁合演)μ米孔隙过滤器。组织要求我们治疗,人类msc被播种到6-well板块首先,受到UTMD,然后播种到参议院。组中包含AMD3100, msc预处理通过coculturing AMD3100 (5μg / mL)(σ)30分钟。分配给不同的上层清液或心肌组织提取物组被放置到每个众议院(500μL)。5 h孵化后,没有迁移的细胞用棉签参议院被移除。细胞的下表面膜沾0.1% (w / v) 20分钟的结晶紫解决方案,和他们的数量在200 x光显微镜下计算放大在五个随机选择的字段。每个实验重复三次重复。

2.12。MSC标签和植入

大鼠msc和64 MI模型大鼠用于动物实验。经过1周的建模、心肌梗死大鼠随机分为四组:PBS(1毫升)注入仅仅作为对照组(案子,),msc移植组由1×10⁶细胞悬浮在1毫升的PBS通过尾静脉注射移植(MSC,),美国辐照和MB注入(0.1毫升/公斤)组(嗯,),UTMD和MSC移植组(MSC +,)。我们诊断系统(西门子ACUSON S2000,美国)被用来执行UTMD。美国探测器放置在前胸部10分钟的谐振频率2.0/5.0 MHz机械指数为1.3。MSC +嗯组,MBs静脉注射之后,MSC的注入。

此外,我们与绿色荧光蛋白(GFP)标记大鼠msc (Cyagen、广州、中国)使用GFP慢病毒转导根据制造商的协议。MSC GFP-MSCs被用于跟踪归航细胞组()和MSC +嗯组()。48 h后的细胞移植,移植细胞的生存取决于GFP-positive细胞的数量在冻结部分(8μ米)由MI心下激光扫描共焦显微镜。GFP-positive细胞的数量是通过随机计算五个字段从每个老鼠的两组。

2.13。免疫印迹和免疫组织化学(包含IHC)

的蛋白表达和分布SDF-1和趋化因子受体CXCR4在心肌梗死区被免疫印迹和包含IHC评估。动物牺牲经过七天的治疗和心脏快速收获。

心的子集被用于免疫印迹(描述),其余都在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,在4 -分段μ为包含IHC米厚度。抗体用于包含IHC如下:兔子anti-SDF-1主要抗体(1:50,Santa Cruz),兔子anti-CXCR4主要抗体(1:50,Abcam),和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 100年,Beyotime)二级抗体。

2.14。统计分析

所有的数据表示为均值±SD。《独立报》以及应用的比较两组之间的GFP阳性细胞的数量。单向方差分析(方差分析)进行了统计比较的数据,除了GFP阳性细胞的数量。使用SPSS 13.0软件进行统计分析,和被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。UTMD SDF-1分泌和MSC生存能力的影响

上层清液组,SDF-1的浓度在M + NS + U组(pg / mL)增加了大约60%相比,M + NS组(pg / mL)。HCM的上层清液收集从缺氧培养介质和HCMEC (HS组)含有一定量的SDF-1 (pg / mL)。当msc cocultured与缺氧中(M + h组),SDF-1水平增加了约34% (pg / mL)。UTMD治疗后(M + h + U组),SDF-1的浓度进一步升高约22% (pg / mL)。MTE分数,数据显示一个类似的结果(图1(一))。此外,与对照组相比,msc治疗的可行性UTMD下降了大约只有7%在上层清液和-9% MTE组(图1 (b))。

3.2。效果UTMD VCAM-1的表达和ICAM-1体外

调查的影响的upregulation UTMD VCAM-1 ICAM-1表达式,分析了上层清液经不同群体使用ELISA-based数组,和蛋白质的浓度归一化对那些来自对照组。数据表明,缺氧上层清液(HS集团)或梗塞的MTE含有大量VCAM-1和ICAM-1与对照组相比。UTMD这些蛋白质在上层清液的浓度增加(图2(一个)(图)和MTE组2 (b))相比,治疗组。

3.3。趋化因子受体CXCR4基因和蛋白质表达在体外

趋化因子受体CXCR4 mRNA的表达是由实时PCR在24 h后coculture条件培养液(图3(一个))。在上层清液组,趋化因子受体CXCR4 mRNA的表达增加M + NS + U组()相比,M + NS组(达成的最高水平)和M + h + U组()。MTE组,结果类似于上层清液。

数据3 (b)和3 (c)显示趋化因子受体CXCR4的表达蛋白免疫印迹。与未处理组相比,趋化因子受体CXCR4的表达蛋白质UTMD-treated组高。结果与趋化因子受体CXCR4 mRNA水平一致,表明UTMD-treated msc表达的趋化因子受体CXCR4信使rna和蛋白质比未经处理的msc。

3.4。与FCM细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达

细胞膜的本地化趋化因子受体CXCR4 FCM(图是定量评价4(一))。的数据表明,上层清液组,细胞表面趋化因子受体CXCR4表达的百分比在M + NS + U组()是8.07倍高于M + NS组()(图4 (b)),而M + h + U组()是1.32倍高于M + HS集团()和14.36倍高于对照组()。msc的百分比表达表面趋化因子受体CXCR4在M + NMTE + U组()是6.79倍高于M + NMTE集团()(图4 (c)),而M + IMTE + U组()是1.49倍高于M + IMTE集团()和22.23倍高于对照组()。结果表明,无论是在正常条件培养基或在缺氧条件培养基,UTMD可以移植msc在体外表面趋化因子受体CXCR4的表达。

3.5。体外迁移分析

检测的效果UTMD msc在体外迁移,transwell迁移试验进行上层清液和MTE组。如图5,迁移到众议院的msc被结晶紫染色(图5(一个)),细胞的数量记录如下:(浮在表面的组织图5 (b))(1)对照组,;(2)MSC + NS组,;(3)MSC + NS + U组,;(4)M + HS集团;(5)M + h + U组,;(6)M + h + U + AMD3100集团。迁移细胞的数量MTE组如图5 (c):(1)对照组,;(2)MSC + NMTE集团;(3)MSC + NMTE + U组,;(4)M + IMTE集团;(5)M + IMTE + U组,;(6)M + IMTE + U + AMD3100集团。这些数据表明,在正常条件培养基和缺氧条件培养基,UTMD-treated msc移植更有效地治疗组相比,由AMD3100阻塞。

3.6。寻的msc的识别

48 h后GFP慢病毒转导,明亮的绿色荧光可以被观察到的细胞质和细胞核几乎所有msc在激光扫描共焦显微镜(图6(一))。我们也证实了稳定表达GFP的亚文化msc。GFP-positive msc是位于缺血性心肌和边境地区基本上不存在,但在正常心肌。GFP-positive细胞的平均数量在MSC组和MSC +集团进行了计算,结果表明,两组之间有显著差异。MSC GFP-positive细胞的数量+嗯集团()相比显著增加MSC集团()(数据6 (b)和6 (c))。

3.7。由包含IHC SDF-1和趋化因子受体CXCR4的表达,免疫印迹

免疫组织化学染色显示,SDF-1和趋化因子受体CXCR4主要是局部缺血性心肌细胞质和边境地区。SDF-1——或者CXCR4-positive细胞的数量相对较小的对照组。更积极的细胞中观察到MSC组和组。阳性细胞的数量在MSC +集团是最大的,而且在某些片,阳性染色SDF-1和趋化因子受体CXCR4分布在大量的细胞,几乎占整个照片(图7(一))。

免疫印迹结果表明缺血性心肌SDF-1水平更高的MSC集团()和恩集团()与对照组(),MSC +嗯集团()最高水平相比其他组(数字7 (b)和7 (c))。

4所示。讨论

本研究探讨UTMD-assisted迁移的机制和自导的msc缺血性心肌通过SDF-1 / CXCR4轴。体外结果表明UTMD可以促进SDF-1 msc分泌,导致增加SDF-1在上层清液的浓度。同时,UTMD调节msc趋化因子受体CXCR4表达表面的比例以及在msc趋化因子受体CXCR4基因和蛋白的表达。体内的研究发现,与其他群体相比,UTMD结合静脉输液的msc导致更多的归航msc和SDF-1和趋化因子受体CXCR4的表达增加心肌梗死区域。通常知道msc已经广泛应用于各种疾病的治疗,因为他们的多功能分化和免疫调节能力19,20.]。治疗效果依赖于msc自导目标组织的效率。MSC移植体内的过程是复杂的,涉及多种细胞因子、趋化因子、黏附分子和其他蛋白质,但SDF-1 / CXCR4轴是最重要的分子通路MSC移植和导航21,22]。通过体外和体内实验中,我们的结果表明,SDF-1 / CXCR4也是一个至关重要的因素促进msc在UTMD归航,可上调SDF-1 / CXCR4的表达,提高移植msc的迁移和导航能力。

在这个工作我们的研究结果表明,更高浓度的SDF-1蛋白质检测的上层清液UTMD-treated组相比,治疗组(图1(一)),是否在正常或缺氧条件培养基。这表明UTMD可以提高SDF-1 msc分泌。这种促进作用的原因之一可能是受益于超声波的生物效应。作为一种电离能量,超声振动可以引起材料的运动(如细胞质颗粒)在组织或细胞内,从而发挥作用的微妙的按摩。产生的空化效应,破坏MBs与我们的辐照,对细胞膜流动性有不同程度的影响,内吞作用,细胞骨架,细胞器,和其他组件,这是密切相关的蛋白质合成和细胞间传输的粒子和其他材料(23]。的机制UTMD upregulation缺血性心肌SDF-1表达的可能是更复杂的体内。这项研究的结果表明,更高水平的SDF-1表达式中MSC组和组相比,PBS输液组,和MSC +嗯集团表示,最高水平的SDF-1相比其他组(图7)。调节表达SDF-1嗯组可能引起的生物效应。MSC组表达增加可能导致的旁分泌活动植入MSC、虽然UTMD-mediated响应的综合效应和自导MSC的旁分泌作用可能在MSC +嗯组负责。

这项研究的另一个重要的发现是,与未经处理的msc相比,UTMD-treated msc有越来越多的细胞表面趋化因子受体CXCR4表达不同的度,达到最大的价值M + h + U组M + IMTE + U组的14.36倍或22.23倍高于对照组,分别(图4)。报道,只有极少数culture-expanded msc表面趋化因子受体CXCR4表达(16,24]。因为招聘的趋化因子受体CXCR4正沿着SDF-1 msc梯度在心脏复苏中扮演着重要的角色25,26),改善表面趋化因子受体CXCR4表达自己培养的msc是重要的治疗应用。直到现在,许多方法已报告移植功能趋化因子受体CXCR4表达,包括viral-mediated趋化因子受体CXCR4转导(27),用一个细胞因子治疗msc鸡尾酒(28),培养的msc在缺氧条件下(29日,表面改性,通过融合重组趋化因子受体CXCR4蛋白(30.]。本研究发现UTMD可以增加膜趋化因子受体CXCR4的表达在msc。有三个潜在的机制。首先,UTMD的生物学效应可能直接促进丰富的胞内趋化因子受体CXCR4的转移到细胞膜。第二,所产生的冲击波和微型喷气发动机流MBs在气蚀的破坏导致细胞膜的破裂和可逆的形成细小的毛孔被称为“sonoporation”[31日),有效地增强了细胞膜渗透率(32),可以提供一个物理传输通道的跨膜蛋白趋化因子受体CXCR4。第三,UTMD可以上调表达的趋化因子受体CXCR4基因和蛋白质(图3),趋化因子受体CXCR4胞内储存也可以帮助增加本地化趋化因子受体CXCR4表面。

SDF-1 / CXCR4相互作用,作为一个整体,是msc移植和导航的关键33]。在我们的体外迁移试验(图5),UTMD-treated msc显示显著提高迁移能力与未经处理的msc相比,这可能会导致表面的upregulation趋化因子受体CXCR4表达。此外,缺氧条件培养基结合UTMD导致最大MSC移植,这可能受益于表面的交互调节趋化因子受体CXCR4表达和增加SDF-1缺氧中包含的媒介。AMD3100, SDF-1 / CXCR4抑制剂,可以阻止UTMD的促进作用,并证实SDF-1 / CXCR4相互作用的关键作用UTMD-assisted MSC迁移。至于研究体内,UTMD行为不仅在心肌组织,而且在msc围坐在缺血性心肌,导致促进msc的旁分泌作用和导致SDF-1分泌的增加。SDF-1表示MI地区越多,越多的趋化因子受体CXCR4积极的msc可以迁移和家庭对缺血性心肌SDF-1梯度,并且进一步,SDF-1可以与UTMD自导msc分泌的形成良好的循环。在我们体内的结果,我们发现的数量GFP-positive MSC归航MI地区MSC +嗯组显著高于MSC组(图6)。与此同时,SDF-1 / CXCR4表达高于前者(图7)。结果重申UTMD的生物效应可以促进移植msc的迁移和归巢;此外,它表明体内SDF-1 / CXCR4相互作用可能连续循环的作用在促进MSC移植的方式不同于体外transwell迁移试验。

VCAM-1 ICAM-1,两种类型的粘附分子与msc归航,ELISA检测体外,结果表明,UTMD可以提升自己的分泌物(图2)。在体外研究中,这些蛋白质被msc分泌增加的水平。如果应用UTMD体内,它还可能会促进缺血性心肌内的其他细胞分泌这些粘附分子。一起SDF-1 / CXCR4相互作用,增加VCAM-1和ICAM-1有利于MSC移植和保留在目标组织。

还有一些其他的方面需要被解释在这个研究。首先,缺氧的文化HCM和HCMEC或梗塞的心肌组织提取物作为MI模拟体外。前使用的绝大多数细胞在心脏,可能有利于规范化的目的,因为在每一组固定数量的这些细胞。然而,后者的一个优势是,它更接近于体内的MI环境。在任何情况下,从两组实验获得的结果基本上是一致的。其次,过度的超声辐照往往导致不可逆转的损害细胞和微血管(34,35),适当UTMD治疗是很重要的安全方面的考虑。在这项研究中,我们使用了体外照射条件中引用文献[34,35),msc的可行性只比对照组下降了7% -9%(图1 (b))。UTMD应用到老鼠时,我们使用诊断因为降低美国能源可能更安全、更有利于移植msc比我们治疗的生存。当然,一些主要参数,如声强度、治疗时间、MB剂量,必须在未来的研究来达到优化的目的更多的SDF-1 / CXCR4 upregulation和msc死亡。第三,尽管我们已经确定,UTMD可以改善由流式细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达,进一步研究使用更精细的检测手段(如放射性同位素本地化)在未来的研究应该进行直接确认这个结果,进一步证明了膜趋化因子受体CXCR4来自细胞内趋化因子受体CXCR4存储。最后,当前的方法来增加心脏修复的MSC治疗效率,如使用UTMD、遗传操作、细胞体外预处理,或生物材料,在大多数研究中证实了动物模型。尽管积极的结果,啮齿动物,甚至大动物模型和人类疾病只是简单化。至于UTMD,广泛的临床应用有一定的距离,因为真正的安全性和有效性尚未评估和完善。许多学科在未来需要改进,包括UTMD应用程序的时间、地方和系统性影响UTMD-assisted旁分泌活动,和UTMD对人类心脏功能的影响。

综上所述,本研究探讨了UTMD如何改善缺血性心肌msc的迁移和归航。我们发现UTMD可以增加SDF-1在MI地区和表面的表达水平的趋化因子受体CXCR4在msc阐明的一个潜在的机制upregulation SDF-1 / CXCR4。目前的研究提供了理论参考UTMD-assisted MSC归航,和这个新的治疗方法可能承诺在干细胞治疗心血管疾病。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了中国自然科学基金(批准号81101062和81101062)。作者特别感谢杨程Mengyang邓博士和他们的援助和实验设施。

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