文摘

系统性动脉高血压(SAH),临床综合征的特点是持久的动脉压力,往往伴有异常如微血管稀疏,有缺陷的血管生成,血管内皮功能障碍。间充质干细胞(msc),通常诱导血管生成,改善内皮功能,在SAH缺陷。中央本研究的目的是评估是否启动的msc内皮生长介质(EGM-2)增加他们的治疗效果在自发性高血压大鼠(月)。成年女性月是腹腔内注射的车辆管理的解决方案msc在常规培养基培养(DMEM加上10%的边后卫,),或者msc在常规培养基培养EGM-2 (pMSC,紧随其后的是72小时)。启动的msc减少了基底细胞死亡率在体外。管理pMSCs显著诱导减少长期(10天)动脉压力,减少心脏肥大,endothelium-dependent血管舒张反应乙酰胆碱的改善,增加骨骼肌微血管密度与车辆和MSC组。很少发现移植细胞在心脏和肾脏。综上所述,我们的研究结果表明,启动msc促进干细胞疗法治疗SAH的。

1。介绍

系统性动脉高血压(SAH)是一种临床综合症,其特征是收缩压水平接近或大于140毫米汞柱,舒张压接近或大于90毫米汞柱,影响大约15 - 20%的全球人口(1]。取得了很大的进步与SAH的发病机制的理解,有很多可用的药物维持血压的理想的水平。然而,有许多悬而未决的问题关于这种综合症的病理生理基础,我们没有一个明确的治疗高血压患者,尤其是高血压患者的抵抗力。因此,尽管明显的进步在过去的几十年里,SAH仍然作为一个巨大的公共卫生问题,值得深入研究开发新的和更有效的治疗方法。

为了达到这个目标,自发性高血压大鼠的实验模型(自发性高血压rats-SHRs)是在研究实验室广泛利用,因为它是一个很好的模型来研究基本长官;此外,它的发病机制非常类似于人类的长官。关键改变月包括同情多动症(2],微血管稀疏[3),而内皮功能障碍(4,5]。

间充质干细胞(msc),也称为骨髓基质细胞或多功能间充质基质细胞,有塑料的属性遵循标准培养条件下,有能力的在体外内层分化为成骨细胞,脂肪细胞,表达一个典型表型概要文件(6,7]。msc具有重要neoangiogenic行动,经研究表明这些细胞的高容量的秘密很多生物活性的因素参与新血管的形成,如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF),纤维母细胞生长因子2 (FGF-2),而(Ang-1)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)、白细胞介素- 6 (il - 6)、胎盘生长因子(PLGF)和蛋白质Cyr61(61年cysteine-rich血管生成,诱导物),其他(8- - - - - -10]。此外,相信周代表了msc、本地化的整个有机体与血管相关(11]。周和血管内皮细胞表现出一种相互依存的关系,其中可溶性因子和物理交互作用导致血管结构,对形成和维护(12]。因此,它是可能的,msc对内皮功能起到调节作用。这些想法可能加强msc在SAH病理生理学的作用,特别是作用于外周血管阻力,妨碍新微脉管形成和/或调节内皮功能。

考虑内皮功能障碍和微血管稀疏是重要的变化在高血压状态(4,5),这些参数可以产生疗效的提高与动脉高血压有关。此外,考虑到治疗的潜力从骨髓干细胞/祖细胞改善血管稀疏和/或内皮功能障碍在萎缩,我们的假设是msc的启动与内皮基础培养基+生长因子(内皮生长medium-EGM-2),这似乎加强他们具备干细胞,血管生成能力,和治疗的潜力,可以生成一个安全、高效的动脉高血压的治疗选择。

2。材料和方法

2.1。动物的选择

所有动物都从动物设施获得自然科学和生物科学研究所的Triangulo米内罗的联邦大学。动物们保持在稳定条件下免费的水和食物。所有的实验程序在本研究符合就业指导实验室动物保健和使用的由美国国立卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。

前5天治疗,动物受到间接使用尾动脉阻塞动脉压记录方法和间接压力监测器,LE5000模型(Letica科学仪器,巴塞罗那,西班牙),它允许的间接测量收缩期动脉压力。在这项研究中,我们只使用女性月的收缩期动脉压(SAP)高于160毫米汞柱。

2.2。间充质干细胞隔离

从骨髓msc得到男性的月如前所述[13]。简单地说,从股骨骨髓了,胫骨、肱骨和离心分离,和额外的差速离心使用Ficoll-Paque 400 g进行了40分钟;然后,材料resuspended在常规介质组成的杜尔贝科的修改鹰介质,DMEM(表达载体),和10%胎牛血清的边后卫(Gibco),补充与100 U /毫升青霉素G和100年μg / mL链霉素(表达载体),然后镀成T75烧瓶血压得到较好的控制。72小时后,贴壁细胞分离与0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(表达载体)和山肩20000细胞/厘米²。在提取获得的细胞被认为是P0,而且,在每一个新的金属堆焊,细胞先进一段。在目前的研究中,我们使用msc第四和第七章节之间的所有程序。每个实验协议在72年的前几个小时,在传统媒介或内皮细胞培养生长培养基(美国Lonza EGM-2) + 10%的胎牛血清的边后卫(Gibco),补充与100 U /毫升青霉素G和100年μg / mL链霉素(英杰公司)、氢化可的松、人类基本的纤维母细胞生长因子(hFGFb)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和抗坏血酸和肝素(美国Lonza)。

2.3。msc Immunophenotypic表征

immunophenotypic表征的msc(在第四到第七段)在启动完成之前使用流式细胞仪和单克隆抗体标记,CD11b, CD29, CD31、CD34、CD45、CD117 (cKit)(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学有限公司;美国圣地亚哥eBiosciences CA),共轭,藻红蛋白(PE),这与同系物老鼠反应抗原。细胞表型分析20000事件对于每一个样本,使用FACSCalibur流式细胞分析仪与CELLQUEST软件(Becton, Dickinson和公司,圣何塞,CA)。

2.4。细胞分化

msc在文化刺激第四到第七段,使用特定的协议分化成成骨细胞和脂肪细胞。细胞分化协议是基于Neuhuber et al。13]。

诱导的成骨分化,msc在成骨诱导培养介质组成的DMEM加上15%的边后卫,青霉素和链霉素1%,100 nM地塞米松,50μglycerol-phosphate M ascorbate-2-phosphate, 10毫米。每3 - 4天,成骨诱导介质代替,十八天,分化进行分析利用茜素红染料(西格玛奥德里奇,美国),红色污渍骨基质。

诱导脂肪形成的差异化,msc在脂肪形成的诱导培养基培养,组成的DMEM加上15%的边后卫,青霉素和链霉素1%,1μ地塞米松,0.5毫米isobutylmethylxanthine 10μg / mL胰岛素,和100年μ吲哚美辛。3天之后脂肪形成的感应中,媒介取代脂肪形成的维护中24小时,组成的DMEM加上15%的边后卫,1%,青霉素、链霉素和10μg / mL胰岛素。24小时后,脂肪形成的维护中再次被脂肪形成的诱导培养基为3天,当它取代脂肪形成的维护中进行进一步的24小时。完成3周期后的媒体变化,细胞维持5天在维护中,当分化进行分析使用油红色染料(西格玛奥德里奇,美国),这污渍脂质橙色。

2.5。细胞死亡

通过流式细胞仪进行细胞死亡评估使用FITC膜联蛋白V凋亡检测装备II (BD Pharmingen)根据制造商的指示。短暂,msc被镀的密度25000细胞/厘米²72小时的培养后,在传统媒介或EGM-2,细胞分离,悬浮在膜联蛋白V缓冲区,和孵化FITC-annexin V和碘化propidium流式细胞术阅读。设备指令后,在体外基底细胞死亡率决定细胞的百分比是染色的染料。

2.6。细胞移植

msc在传统媒介和培养,细胞移植前72小时,细胞保持在传统媒介或EGM-2媒介。72 h后,细胞被分离从烧瓶和细胞生存能力是评估通过台盼蓝排斥试验。只有文化细胞生存能力高于95%被用于移植。在以前的细胞注入,这些细胞被沾CM-DiI细胞追踪(美国分子探针),然后腹腔注射5×10的浓度⁶可行的细胞/动物。实验小组是由动物接受MSC在常规培养基培养(MSC,),动物收到msc影射EGM-2介质(pMSC,),控制动物收到1毫升的车辆(生理盐水,)。

2.7。试验协议

收缩期动脉压(SAP)监控通过尾动脉阻塞方式5天前和治疗后10天。这个观察期结束时,血流动力学参数的直接记录,所有的动物麻醉了三溴乙醇(250毫克/公斤,i.p。)和右股动脉乳胶过敏。24 - 48小时后手术恢复,动脉血压直接记录在60分钟使用一个模拟数字转换器(di - 720 usb Dataq仪器,Inc .,阿克伦,哦,美国)和数据采集软件(Windaq Pro + Dataq仪器,Inc .,阿克伦,哦,美国)1 KHz的采样率。最后这段录音后,一个新的麻醉会议(硫喷妥钠,40毫克/公斤,i.p)、导管插入左侧颈总动脉注射乙酰胆碱(3-25η0.5克/公斤)或硝普酸钠(4μ克/公斤)间接评估系统性内皮功能基于endothelial-dependent减压反应和endothelial-independent血管舒张,分别。最后的实验协议,心脏重量测量,收集和肾脏,心脏和骨骼肌。

2.8。功能分析

SAP的平均值、平均动脉压(MAP),舒张动脉压(DAP)和脉冲间隔(PI)计算每60分钟段录音。在心血管变异性研究中,动脉压力的信号(美联社)处理使用软件(Alberto门博士PRE24软件,请提供大学米兰,意大利)生成beat-to-beat时间序列的π,衣冠楚楚,SAP。这些值的方差在每个时期被认为是一种时域变化指数。

π的可变性,衣冠楚楚,SAP还评估在频域中使用自回归谱分析方法。先前的研究中描述的理论和分析程序(14,15]。简单,打节拍时间序列的π,衣冠楚楚,和SAP分为串行部分的200次,其中所有的连续段重叠50%(100次)前一段(韦尔奇的方法)。使用平稳时间序列片段,使用Levinson-Durbin自回归参数估计的方法,根据Akaike模型顺序选择的标准14- - - - - -16]。然后,在每个单独的固定段200次,频谱分解执行使用适当的软件(Alberto门博士LA24软件,请提供大学米兰,意大利)。正常化过程,仅适用于π的可变性,是由分裂的力量低频组件(frequency-LF低,0.20 -0.80赫兹)或高频率(高frequency-HF 0.80 3 Hz)总光谱功率,即减去从非常低频段的力量(frequency-VLF很低,0.01到0.20 Hz),并把结果乘以100 (14,15]。获得的光谱参数为每个单独的固定段200次调解,和60分钟的录音带来的平均值计算为每一个动物。

内皮功能的测试,对不同剂量的乙酰胆碱和动脉压反应硝普酸钠进行评估基于比例地图在每个剂量的管理,减少使用Acqknowledge软件,3.5.7版本(美国Biopac系统)。

2.9。微血管密度

研究骨骼肌毛细血管密度,免疫组织化学标记使用(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl磷/氮蓝四唑)BCIP /电视台液体基质系统(西格玛奥德里奇,美国)。使用此方法,转换一个衬底中碱性磷酸酶存在内皮细胞产生一个深蓝色的污渍。简单,以前冻腓肠肌肌肉碎片在低温恒温器分段和允许与BCIP /电视台反应底物在室温下10分钟和contrastained伊红染色。使用一个倒置显微镜(Axio观察者Z1、卡尔蔡司、德国),20个随机领域获得的,分析是由计算血管染色的数量在蓝色和整个细胞的数量在每个字段。微血管密度确定船舶之间的比例和整个细胞的数量。

2.10。移植细胞的检测

之前冻结的心和肾碎片在低温恒温器分段和DAPI染色细胞核染色(西格玛奥德里奇,美国)。组织分析了利用激光共焦显微镜(LSM 710年,卡尔蔡司,德国)定位CM-DiI细胞追踪染色的细胞标记红色。

2.11。统计分析

所有参数都表示为均值(±sem)。正常(Kolmogorov-Smirnov)和方差同质性(Bartlett)测定所有数据。参数数据,组织之间的差异进行了分析使用单向方差分析或双向方差分析重复测量图基紧随其后的多重比较测试。对于非参数数据,组织之间的差异进行了分析使用Kruskall-Wallis方差分析或Mann-Whitney测试在适当的时候。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。对msc

描述本研究的干细胞研究是执行的国际社会对干细胞疗法和间充质干细胞和组织委员会(7]。msc展出他们所有的特征,如塑料粘附能力,成格式(图1(一)),在体外使用特定分化成骨、脂肪形成的分化中展示其multipotential属性(数据1 (b)和1 (c))。正如所料,msc immunophenotype一致公认的定义,即CD45⁻、CD29⁺,CD117⁻、CD31⁻,CD11b⁻,CD34⁻;然后,细胞培养污染与造血干细胞,白细胞,内皮细胞和巨噬细胞(图中就被淘汰了1 (d))。

3.2。细胞死亡

细胞死亡的研究显示显著减少在体外基底细胞死亡率,因此,可行的细胞的百分比的增加在msc培养72小时EGM-2细胞培养相比传统媒介(图2)。

3.3。测量动脉血压和心率

基底的收缩期动脉压值治疗前各组之间没有差别(生理盐水组毫米汞柱;毫米汞柱MSC集团;和毫米汞柱pMSC集团)。然而,SAP间接测量的时间进程跟踪显示减少长期(10天)的张力的水平(约10 - 15毫米汞柱)ip管理msc培养72小时后EGM-2(图3(一个))。同样,如图3 (b)的移植pMSCs产生显著减少直接记录平均动脉血压水平相比,车辆或msc在DMEM培养(毫米汞柱和毫米汞柱,毫米汞柱,分别地。)。治疗没有诱导改变心率(HR)动物因为没有差异三个实验组,每组(图3 (c))。

3.4。据美联社和人力资源变化

治疗与msc在常规培养基培养和培养在EGM-2 DAP的方差进行了修改,这是不同的与生理盐水组相比。低频(LF)的DAP光谱成分MSC组在统计学上低于生理盐水组(表1)。

人力资源变化的分析显示差异在低频和低频(ν)组件MSC,这在统计学上低于生理盐水组。所有其他数据没有显示任何变化(表2)。

3.5。内皮功能测试

血压水平的变化,以应对不同剂量vasorelaxant药物作用于血管内皮(乙酰胆碱)或血管平滑肌(硝普酸钠)允许内皮功能的研究。如图4,内皮功能评估是基于相对降低动脉血压,以应对不同的剂量的乙酰胆碱,和我们的研究结果显示,动物治疗血管舒张反应的改善与msc影射EGM-2介质相比,车辆或msc在DMEM培养注射Ach 6.25 ng /公斤(%与%,%,分别地。)和12.5 ng /公斤(%与%,%,分别地。)。管理Ach 3.125 ng /公斤剂量产生的改善血管舒张反应动物对待pMSC车辆相比,而不是msc在DMEM培养(%与%,;%与%,)。Ach 25 ng /公斤剂量也产生一个改善血管舒张反应pMSC组,虽然它不是统计学意义与生理盐水或MSC集团(与%,%,分别地。)。没有对所有剂量的硝普酸钠组,差异代表一个独立于内皮血管舒张反应。

3.6。心脏相对体重

符合动脉血压降低,治疗与msc影射EGM-2减少心脏肥大,心脏重量与体重比的基础上,与生理盐水(与,),但不与MSC集团(与,=不重要的)。绝对没有差异,体重和心脏重量(图中三组5)。

3.7。微血管密度

如图6,治疗与MSC影射EGM-2产生显著增加的比例/血管细胞的数量比生理盐水和MSC组,表明这些细胞能诱导新血管的形成在活的有机体内。

3.8。移植细胞的检测

CM-DiI细胞追踪染色的msc移植前允许细胞的检测在活的有机体内经过10天的治疗。尽管他们需求量很低,可以检测到细胞的MSC和pMSC团体在动物的心脏和肾脏(图7)。

4所示。讨论

在目前的工作中,我们证明了之前启动msc的有利影响注射治疗动脉高血压在自发性高血压大鼠的实验模型。如前所述,我们选择月因为他们很容易操作和有大量可用的数据和高血压发病机制非常类似于人类。

启动方法研究已经评估和证明等模型的有效免疫调制,启动的MSC与MSC干扰素刺激免疫抑制特性(17),心肌梗死的有利影响启动MSC直接他们遵循cardiomyogenic分化之前注射治疗心肌梗死已经证明(18]。考虑与EGM-2 MSC刺激,康尼锡et al。19]表明amnion-derived msc在EGM-2培养5 - 7天产生的速度增加在体外纤维母细胞细胞增长,改变了他们对endothelial-like形态,和能够拿起乙酰化低密度脂蛋白和基底膜基质形成endothelial-like网络分析,尽管他们不表达成熟内皮细胞标记血管性血友病因子和血管内皮钙粘蛋白。此外,刺激msc与表皮生长因子(EGF)增加细胞增殖和能动性和强化的能力msc分泌血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),这可能表明这些细胞的血管生成能力的改善和他们的治疗潜力20.]。研究也表明,成纤维细胞的生长因子(FGF)维护msc增殖,同时保留其multipotentiality期间处于未分化状态。换句话说,FGF似乎促进msc具备干细胞自我更新和维护在体外(21]。

在目前的研究中,MSC的刺激与EGM-2减少了基底细胞死亡在体外。这些结果可以解释为在EGM-2生长因子的存在,因为这些因素对msc标记凋亡效应,如igf - 1 (22],FGF-2 [23),VEGF (24]。

本研究的一个重要的发现是重要的长期降低动脉血压水平,大约有10 - 20毫米汞柱,这种效应似乎与内皮功能的改善有关。执行上下文中的细胞治疗心血管疾病,一般来说,促进受损组织的再生,例如,组织受伤由于心肌梗塞。考虑到动脉高血压的主要危险因素与心血管事件有关,我们的方法是关于组织损伤的预防而不是治疗。通过这种方式,减少动脉压力水平是相当有益的,尽管这没有达到减少正常的价值观。根据我们的数据,研究表明效益提升的MSC移植monocrotaline-induced肺动脉高压的环境中,肺血管床阻力减少,右心室收缩压,右心室weight-body重量比,和肺血管阻力,这些影响似乎与改善endothelium-dependent血管舒张(25,26]。肾血管性高血压的上下文中,每周2×10的移植⁵msc阻止进步增加收缩压(SBP)、改善肾形态和微血管稀疏,并降低纤维化,蛋白尿,促炎细胞因子(27]。从我们的实验室数据28,29日静脉输液的10所示)⁷白色单核细胞从骨髓中提取的男性月成女性月(同源的移植)降低动脉压(美联社)约15 - 25毫米汞柱连续两周,提高乙酰胆碱的血管舒张反应在活的有机体内。尽管哦et al。30.]最近描述了长期记忆的激活T细胞和最终的同种异体移植排斥的msc、降低动脉血压观察到在我们的研究中最有可能并非归因于一个随意的免疫排斥和所带来的系统性炎症反应的激活,因为月同基因的(28]。

美联社的直接测量(金标准)进行干细胞移植后10天,表示长期减少美联社,这是符合其他研究[31日]。这一时期的选择从我们的实验室评价是因为之前的数据记录大约15天使用骨髓单核细胞的影响(28,29日]。在一个粗略的相关性,考虑月的寿命约73周(32),人类的平均寿命大约70年33),我们可以考虑,单一管理MSC的治疗效果,大约1.5周的老鼠,将人类高血压的有效期为1.5年。常用的药物来控制SAH需要每天使用,造成干扰和治疗依从性低,限制了药物治疗高血压的疗效。然后,细胞治疗方法很有趣,因为它演示了一个持久的降压效果。

为了确定msc的抗高血压作用机制,本研究调查改善参数已知缺陷在月如同情自主多动症,内皮功能障碍和微血管稀疏。自主神经系统的调节心血管系统是通过人力资源评估和美联社变异,结果表明pMSCs低血压患者的影响似乎并没有改变有关sympathetic-vagal平衡。另一方面,提高了内皮功能与pMSC对治疗的反应,这是根据其他作者,包括劳et al。34]。同样,低血压患者的影响pMSCs与微血管密度增加有关这些动物,表明这些细胞的一个重要血管生成的影响。msc的血管生成潜力是有据可查的文献在不同条件下,如缺血和tumoral血管生成(34- - - - - -36]。缺乏有利影响诱导MSC在常规培养基培养在美联社,内皮功能障碍,和微血管稀疏被从我们实验室以前数据,合理的演示功能障碍的MSC增殖和分化的属性获得月相比纯种京都的老鼠(未发表的数据)。

以前的数据在文献中描述的分布腹腔内注射msc、被发现位于肝脏、肺、肾、脾,表明这些细胞可以传播和灌输不同的器官37]。在这项研究中,心脏和肾脏中标识的移植细胞治疗后10天。肾脏长期血压调节中起着重要的作用,和这些器官可能表明存在pMSC肾功能可能这些细胞的作用,这是在SAH受损。减少心脏肥大pMSC组中观察到的最有可能继发于美联社的减少,尽管这个器官细胞的检测可能表明一些额外的保护作用。值得注意的是,单一的观察移植细胞的器官并不一定表明他们玩一些生物的作用,但必须进行进一步的研究来阐明这个问题。

目前研究的一个主要限制关于血管生成因素缺乏评估的配置文件启动后msc与EGM-2系统性移植后受体萎缩。在我们看来msc的启动与EGM-2增加他们的血管生成,因此通过增加血管新生因子分泌抗高血压效应。更是印证了这一假说的发现报告的高桥et al。38),描述了由脂肪分泌的血管生成因子的增加tissue-derived MSC在EGM-2七天之后的文化。此外,与VEGF治疗msc (10]或FGF-2 [39),这两个组件的EGM-2介质,能够诱导在体外MSC对endothelial-like细胞的分化。然而,应该进行更多的实验来解决这个问题在不久的将来。

总之,考虑到msc构成有效,容易分离,安全nontumor形成,高膨胀能力在体外细胞,这些细胞是一种很有前途的替代传统治疗动脉高血压。我们证明它可以加强msc治疗前的治疗效果,而我们的研究结果似乎表明,启动msc与内皮基底介质促进干细胞疗法治疗系统性动脉高血压。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比),巴西政府的一个机构,为博士奖学金Thalles拉莫斯Almeida Marilia Beatriz古巴、当归克里斯蒂娜•阿尔维斯,马科斯费尼达席尔瓦,博士后奖学金(PNPD /斗篷)Marcus保罗里贝罗马查多,和金融支持格兰特(PNPD /斗篷- 2008 - 2013)Valdo何塞·迪亚斯·达席尔瓦。作者也要感谢CNPq(蹂躏Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府)对金融支持赠款(没有。309521/2013-0也没有。Valdo何塞·迪亚斯·达席尔瓦467129/2014-2)。