两路开关单元Fusion-Inducible转基因神经干细胞基因治疗Antiglioma表达系统

文摘

最近进展的神经干细胞(NSC)基于tumor-targeted基因治疗表明,NSC向量表达人为改造病毒fusogenic蛋白质,VSV-G H162R,可能导致肿瘤细胞死亡酸性肿瘤微环境下特别是合胞体形成;然而,造成效率仍有提升空间。认为coexpression的另一个antitumoral基因VSV-G可以增强旁观者效应,综合监管系统,触发转基因表达在细胞fusion-inducible方式已经提出。在这里,我们已经开发出一种两路开关单元fusion-inducible转基因表达系统(DoFIT)推动转基因表达对VSV-G-mediated NSC-glioma细胞融合。在这个双星系统,由glioma-specific coregulated转基因表达启动子和目标序列的微rna (miR)在nsc高度表达,但在神经胶质瘤细胞低表达。因此,转基因的表达是“关闭”的米尔NSC向量,但与神经胶质瘤细胞细胞融合后,米尔稀释,失去了抑制的效果。同时,合胞体,转基因表达“开启”glioma-specific启动子。我们的在体外和在活的有机体内实验数据表明,DoFIT成功地消除了荧光素酶报告基因表达在NSC向量,但激活后专门VSV-G-mediated NSC-glioma细胞融合。

1。介绍

在过去的十年发展已取得显著进展的神经干细胞(nsc)作为一种新型基因传递向量antiglioma治疗(1]。nsc多功能干细胞产生的三个基本神经血统,神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞,在中枢神经系统。当脑部肿瘤存在,nsc能够通过大脑实质迁移,通过现有的或非典型的路线,在肿瘤病灶,包括最初的网站和遥远的“卫星病灶”[1]。在动物模型中,强劲的肿瘤趋向性nsc已广泛用于靶向治疗基因,如自杀基因胸苷激酶(TK),脑部肿瘤。这些研究表明转基因安全委员会向量可以渗透原始肿瘤质量和追逐推进肿瘤卫星无论注射位置和其与肿瘤之间的距离并通过overexpressing治疗显著抑制肿瘤生长的转基因产品(2- - - - - -6]。然而,发现常数表达式的自杀基因TK脱靶nsc引起显著的细胞毒性影响正常脑组织(7]。因此,它提出了一个安全问题,使用这些NSC向量可能恶化的病人的情况。

利用NSC向量的细胞毒性效应,我们以前设计一种新型抗肿瘤基因,疱疹性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G) H162R突变体,消除肿瘤细胞特别是在酸性下肿瘤微环境(8]。VSV-G是一类fusogenic膜糖蛋白(消费品)基因可以通过感应施加强大的旁观者造成影响的多核合胞体在肿瘤细胞(9]。然而,肿瘤的fusogenic能力acidosis-targeted H162R突变体弱于野生型;因此造成功效仍还有很大的提升空间。以前的研究已经表明coexpression自杀基因(10,11),溶瘤病毒(12,13),antitumoral趋化因子(14),和细胞因子(15,16与消费品可以增加肿瘤造成的影响。因此,我们另一个转基因的原因,归纳,如自杀基因TK, NSC /神经胶质瘤合胞体可以提高治疗效果的一种手段VSV-G-expressing NSC向量。

意识到这一点,同时避免脱靶的副作用,需要限制转基因表达细胞fusion-inducible的方式。双开关是最初的安全工程实践,关闭或打开电路的积极和消极两个方面,在电气设备防止电击危险,这是一个例子,使用冗余来提高安全性。最近的两项研究类似的策略应用于合成细胞两路开关电路,微rna转录靶向和(miR)转基因表达的调节来实现精确控制(7,17]。在这两个研究,肿瘤促进剂被用来激活转基因表达目标条件下,虽然高度表达内源性大鹏被击倒在日常条件下转基因表达。获得的数据表明,这些磁带两路开关表达特异性显著高于single-promoter表达式磁带作为日常“发起人泄漏”减少了“米尔堵塞”。

在这里,我们提出了一个两路开关单元fusion-inducible转基因表达系统(DoFIT),使治疗转基因感应在VSV-G-mediated NSC /神经胶质瘤合胞体形成。在这个双星系统中,由glioma-specific coregulated转基因表达启动子和目标序列的米尔nsc但低表达在神经胶质瘤细胞中高度表达。因此,米尔是用来“关掉”NSC的转基因表达载体;然而,VSV-G-mediated细胞与神经胶质瘤细胞融合后,米尔稀释,其抑制效果消失了。与此同时,合胞体,glioma-specific启动子“开关”转基因表达。我们的数据表明,这种组合控制使用转录靶向和米尔监管导致高转基因表达在神经胶质瘤但微不足道的日常表达在一个小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类恶性胶质瘤细胞系U87和U251从美国购买类型文化集合(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,50 U /毫升青霉素,50μ克/毫升链霉素。

nsc来自人类诱导多能干细胞(万能)使用一个附着单作分化方法如前所述[18]。总之,iPSC殖民地脱离6-well细胞培养板电镀机械切割后7天。然后,被分离的细胞则使用TrypLE表达分离酶(表达载体)和镀到0.1% gelatin-coated 6-well细胞培养板的密度10⁶每在NSC培养基培养,这是一个1:1的混合物DMEM / F12(表达载体)补充2% B27(表达载体),2毫米谷酰胺,50 U /毫升青霉素、50μ20 g / mL链霉素,ng / mL EGF (Sigma-Aldrich)和20 ng / mL bFGF的表达载体。一半的细胞培养介质改变每2天。经过7天的分化、细胞融合和分裂在达到90%的比例1:2。经过1个月的扩张,nsc来自万能。nsc消化使用TrypLE细胞通道和亚文化的比例1:每周2次。

2.2。质粒结构

pGL4.11 (Promega)携带luc2P报告基因被用作起始骨干建设两路开关转基因表达通过多步subcloning磁带。首先,本研究中使用的所有启动子上游的报告基因。其次,4×microRNA目标序列(mirT)被设计为完全互补各自的微rna(小写的表1)和3种不同的链接器间距每个目标序列。的各自的意义和反义链4×mirT寡核苷酸磷酸化,退火,然后插入报告基因的下游。控制争夺目标序列(ScrT)相同大小的设计基于缺乏显著的相似性任何已知的microRNA并subcloned到同一地区(表1)。

2.3。荧光素酶检测

Subconfluent 48-well板与质粒转染细胞编码荧光素酶报告基因在400 ng /好,使用1.2μL Fugene 6(罗氏)根据制造商的协议。24 h后,细胞被冻融法和细胞溶解上层清液测定荧光素酶活动使用荧光素酶检测系统(Promega)根据制造商的指示。所有样本化验一式三份。

2.4。MicroRNA qPCR

小RNA孤立使用PureLink MicroRNA隔离设备(表达载体)和处理已经没有dna涡轮细胞DNase (Ambion)。Poly (A)尾矿和cDNA DNAse-treated小RNA的合成进行了使用Ncode很MicroRNA互补脱氧核糖核酸合成装备(英杰公司)根据制造商的协议。正向引物中存在分析设计基于整个成熟的微rna序列,与额外的3 A s提高扩增特异性(表3′末端2)。反向引物使用的通用引物表达SYBR绿色微rna存在工具包(表达载体)。5 s rRNA被选为内部参考基因PCR量化。确定绝对拷贝数,标准曲线生成使用合成LIN-4 RNA寡核苷酸。

qPCR进行iQ5 rt - pcr检测系统(BioRad)。所有的反应都是一式三份。

2.5。动物实验

五BALB / c小鼠麻醉(132μ氯胺酮和8.8 g / gμg / g甲苯噻嗪)和接收stereotactically引导注射10⁶U251细胞在10μL通过30-gauge PBS汉密尔顿注射器到正确的前脑允许神经胶质瘤的形成。1周后,10⁶DoFIT-NSCs注入左前脑和神经胶质瘤异种移植的前脑,分别。在接下来的两天,在活的有机体内荧光素酶报告基因表达水平是衡量新创建Xenogen - 100 bioimaging系统(卡钳)。

2.6。统计分析

所有数据被表示为意味着南达科他州±。统计学意义的差异是由学生的决定以及或双因素方差分析分析(方差分析)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。选择Glioma-Specific启动子

首先,我们希望选择一个启动子在神经胶质瘤细胞具有较高的活动,但在nsc低活动。根据文献,astroglial lineage-specific发起人GFAP [7),肿瘤特异性启动子生存素(19),glioma-specific发起人HMGB2 [20.)被选为候选人。启动子活动被荧光素酶测试化验iPSC-derived NSC行NSC1 NSC2和神经胶质瘤细胞株U251 U87。,结果被强烈的普遍推广的活动规范化巨细胞病毒(图1(一))。结果表明,HMGB2启动子活性最高的神经胶质瘤细胞系中启动子。然而,它的平均活动NSC和神经胶质瘤细胞系的区别仅仅是3.9倍,因此需要内生米尔作为额外的障碍,以避免潜在的启动子漏。”

3.2。选择一个NSC-Specific米尔

选择米尔高NSC但低表达在神经胶质瘤细胞,我们检查之前的微阵列数据上面的NSC和神经胶质瘤细胞株(未公开的数据)。因此,hsa - mir - 199 a - 5 - p, hsa - mir - 199 - a - 3 - p,和hsa - mir - 214的所有成员mir - 199 a / 214集群位于1 q24.3,被选为候选人。米尔存在来找出他们在NSC1绝对表达水平,NSC2 U87, U251(图1 (b))。结果表明,mir - 199 a - 3 - p在NSC线条表达水平最高,达4.5,10 k副本/ pg小RNA NSC1 NSC2,分别。此外,其特异性NSC和神经胶质瘤细胞系之间也是最高的在所有候选人大鹏展翅,超过682倍。U87和U251,其表达水平远远低于100册/ pg小RNA,这是不足以消除转基因表达根据以前的报告21]。因此,mir - 199 - 3 - p被选为最佳的转基因表达的抑制在NSC对神经胶质瘤的目标向量。

3.3。两路开关Glioma-Specific转基因表达盒

Glioma-specific转基因表达盒HMGB2共同控制下启动子和4×mir - 199 - a - 3 - p目标序列(pHMGB2-mir199a3pT)。此外,排除不利于转录的可能性由于长时间重复序列引入3′utr,不匹配的控制构造pHMGB2-ScrT米尔目标序列长度相同的3′utr生成(图2(一个))。原pHMGB2构造和上面的2个新的结构被荧光素酶测试化验U251 NSC1。结果表明,pHMGB2-ScrT相比,pHMGB2-mir199a3pT获得减少NSC1的荧光素酶活性高达98.7%。此外,组合调节构造显示无显著减少U251的转基因表达的相对于其他构造(图2 (b))。因此,两路开关构造pHMGB2-mir199a3pT被证明有很大的抑制在转基因表达由米尔调控nsc在不影响启动子诱导的神经胶质瘤细胞。

3.4。DoFIT介导细胞Fusion-Inducible转基因表达在体外

首先,一种既合胞体形成试验进行测试的能力VSV-G导致nsc和神经胶质瘤细胞之间的细胞融合。NSC1与pVSV-G,转染质粒编码VSV-G突变H162R,和彩色的橙色染料迪勒然后cocultured U251的比率1:1在pH值为7.4,6.8,和6.2,分别。酸碱7.4代表了正常的生理,pH值6.8是典型的酸性肿瘤细胞外的pH值(酸碱度_e),和pH值6.2代表最优低pH值,有利于fusogenic VSV-G的函数。结果表明,VSV-G nsc之间可以协调高效的细胞融合和神经胶质瘤细胞在pH值6.8和6.2,而不是7.4中性pH值(图3(一个))。

其次,检查pHMGB2-mir199a3pT能否调解细胞fusion-inducible转基因表达在体外、细胞融合荧光素酶检测应用于NSC1 / U251 coculture。NSC1转染了pHMGB2-mir199a3pT连同pVSV-G或模拟矢量。然后转染细胞与U251 cocultured比1:1在pH值为7.4,6.8,和6.2,分别。24小时后,荧光素酶活性测定。结果表明,在pH值7.4,没有诱导转基因表达。在pH值为6.8,只有pHMGB2-mir199a3pT / VSV-G诱导。诱导率是三倍相比pHMGB2-mir199a3pT /模拟。在pH值6.2,pHMGB2-mir199a3pT / VSV-G和pHMGB2-mir199a3pT /模拟诱导(图3 (b))。因此,它表明DoFIT pH值可以调节肿瘤_e端依赖细胞fusion-inducible转基因表达在体外。

3.5。DoFIT介导神经胶质瘤Site-Targeted转基因表达在活的有机体内

进一步检查DoFIT能否调解glioma-targeted转基因表达在活的有机体内,动物研究是使用一个原位神经胶质瘤的小鼠模型。总之,U251是植入正确的BALB / c小鼠前脑事先允许神经胶质瘤的形成。1周后,10⁶DoFIT-transfected nsc注入控制左前脑和glioma-xenografted右前脑,分别。在接下来的两天,荧光素酶报告基因表达水平的老鼠是使用活体动物成像测量的平台。结果表明,DoFIT-NSCs可能介导转基因表达glioma-xenografted前脑但保持沉默在控制左前脑(图4(一))。此外,平均发光的前脑水平升高了20%从第一天到第二天(图4 (b)),这可能是由于神经胶质瘤更多NSC到达网站和更多的细胞融合事件。

4所示。讨论

我们这里显示组合DoFIT转基因表达系统,而夫妻glioma-specific发起人HMGB2和mir - 199 - 3 p调节,使高水平的转基因激活在VSV-G-mediated NSC /神经胶质瘤细胞融合但在NSC向量的非标靶条件下保持沉默。

每年,大约有189000记录新的脑部肿瘤病例诊断和全世界142000人死亡,其中80%是由于神经胶质瘤(22]。尽管神经胶质瘤发病率相对较低,这种癌症的高致命性性质导致了15个月的中位生存时间为多形性成胶质细胞瘤的患者,第四级神经胶质瘤(23]。尽管手术切除,放疗、化疗,由于肿瘤细胞的广泛入侵通常癌症复发治疗抵抗的正常脑实质和收购(24]。因此,迫切需要开发NSC-based antiglioma基因治疗能够目标多个入侵颅内肿瘤病灶,从而提高这个致命的疾病的治疗效果。

nsc的巨大潜力在癌症基因治疗强调的重要性,一个健壮的、大规模的可靠来源,标准化生产人类nsc能够满足良好的临床实践的要求。人类万能的使用提供了一个可访问的和稳定的来源产生无限量的nsc细胞疗法(4]。同时,iPSC-based治疗方法绕过敏感伦理问题的人类胚胎干细胞(25)和安全担忧同种异体移植的免疫排斥反应。在这项研究中,两个iPSC-derived NSC线路已生成,可能是转基因测试我们的系统在体外和在活的有机体内。

值得注意的是,我们的研究表明,内生米尔的内在差异表达模式可以利用隔离之间的转基因表达密切相关的细胞谱系。在这项研究中,几个glioma-specific推动者被测试。然而,NSC之间他们的特异性和神经胶质瘤细胞株足够满意,可能由于一些类似的特征之间共享NSC和神经胶质瘤细胞。幸运的是,大量的研究从不同的组织展示了采用内生microrna的抑制转基因表达的可行性细胞特定类型的方式(7,21,26,27]。同样,通过合并目标序列高度表达的内源性米尔NSC的转基因表达盒,NSC和神经胶质瘤细胞株之间的选择性增加约100倍,表明强烈的内生能力米尔监管来减少潜在脱靶转基因表达“发起人泄漏造成的。“与之前的研究一致,我们的数据表明,米尔低于100册/ pg小RNA没有显著的抑制对转基因表达的影响(21]。

更重要的是,动物实验使用原位脑部肿瘤小鼠模型表明,我们的组合系统实现非常健壮的双相转基因表达在活的有机体内。DoFIT-NSCs注入正常前脑显示检测荧光素酶基因的表达;与此同时,神经胶质瘤的向量网站表现出强烈的发光信号,甚至信号增加第二天。这是我们以前的研究表明,合理的会有更多的NSC向量迁移进入肿瘤网站和更多VSV-G-mediated发生细胞融合(8]。因此,这也证明了我们的二元监管体系能够废除不相干的转基因表达在不影响目标表达式在活的有机体内。

5。结论

总之,我们的工作展示了一个诱导,nonleaky转基因表达系统功能在NSC-based基因传递向量VSV-G-mediated NSC /神经胶质瘤细胞fusion-inducible转基因表达。我们的数据展示,它能够触发健壮的荧光素酶报告基因表达在NSC /神经胶质瘤细胞融合在肿瘤的pH值_e在体外在神经胶质瘤的网站在活的有机体内。最重要的是,一个微不足道的转基因表达水平在非目标区域观察,表明增加安全通过应用一个额外的米尔监管障碍。进一步改进该系统的可能导致最优的发展目标恶性神经胶质瘤细胞基因传递向量。

利益冲突

所有作者没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Yumei朱罗和Detu贡献同样这项工作。

确认

这项研究受到了新加坡卫生部国家医学研究委员会(NMRC / 1284/2011),新加坡教育部(moe2011 - t2 - 1 - 056),和生物工程和纳米技术研究所(生物医学研究委员会,机构科学、技术和研究,新加坡),中国国家自然科学基金青年学者计划(81401206),广州市医疗科技计划(20141 a011091),和广州医科大学(2012 a09 2013 y08)。

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