文摘

基于干细胞疗法治疗人类疾病的良好前景;然而最近的一些临床研究的结果没有显示水平所需的功效作为一线治疗,因为经常在这些研究中移植细胞的命运是未知的。因此监测实时的命运在活的有机体内移植细胞是至关重要的验证全部潜能的干细胞为基础的治疗。最近的研究表明如何实时在活的有机体内分子成像帮助识别潜在障碍临床翻译和设计策略,可能导致成功的干细胞移植和改进的结果。目前,没有成本有效和高效的标签技术跟踪下的细胞在活的有机体内条件。吲哚菁绿(协调小组)是一种安全,经济,和优越的标签技术在活的有机体内光学成像。协调小组是fda批准的代理和几十年的使用有明确协调小组进行人体临床应用的有效性。在这项研究中,我们已经优化国际协调小组标签条件最佳的光学成像和证明,协调小组可以成功地用于标记细胞在活的有机体内细胞跟踪应用程序在SCID小鼠损伤模型。

1。介绍

活细胞在活的有机体内细胞跟踪可以通过与分子探针标记细胞进入细胞的主动/被动运输和被困细胞(如直接标签)。另外,细胞可以被超表达特定的记者整合到细胞的基因组的基因通过病毒或病毒的向量(例如,报告基因标签)。尽管报告基因成像需要基因操纵和带来了潜在的安全问题,这是首选标签策略因为信号生成依赖于细胞的可行性。信号从细胞生成标签通过技术可以可视化使用荧光成像等成像系统(FLI)或生物荧光成像(BLI)。每个成像系统的优缺点进行了总结最近研究阮et al。1]。分子成像在再生医学的总体目标是提高治疗效果,降低细胞毒性。结果到目前为止临床前和临床研究表明,细胞成像可以而且应该被纳入更多的研究动物和人类的细胞移植。细胞移植是一个非常快速发展的技术在再生医学领域的应用。然而,无法追踪细胞在活的有机体内安全、高效已经成为平移使用细胞疗法的应用程序的一个主要障碍。目前,用于各种各样的技术在活的有机体内成像包括磁共振成像(2),通过荧光报告基因标签(3)和生物荧光成像(4),单光子发射计算机断层扫描(SPECT) [5],正电子发射断层扫描(PET) [6],超声波[7),纳米颗粒(8,量子点9),荧光染料(10]。2004年,一样和座谈会首先提出8理想成像技术对干细胞的特征跟踪下在活的有机体内条件(11]。多年来,直到现在,没有适当的成像技术已经被开发出来,它可以呈现适合转化应用。2010年,Boddington等人清楚地描述了有效的跟踪(吲哚菁绿)协调小组通过非侵入性标记细胞在光学成像技术在体外条件(12]。1955年柯达研究实验室首先对近红外摄影发展协调小组。1959年,FDA批准国际协调小组对人类诊断应用程序(13]。协调小组已在临床应用,如心输出量测定、肝功能诊断,眼科血管造影术,前哨淋巴结检测肿瘤,神经外科,冠状动脉外科、血管外科、淋巴管造影,肝脏手术、腹腔镜检查,重建显微外科、光疗,染色14- - - - - -17]。协调小组是一个tricarbocyanine染料,表现出峰吸光度和排放在780 nm和830 nm),分别为(18]。国际危机组织的吸收和荧光光谱在近红外区。很大程度上取决于所使用的溶剂和浓度。协调小组吸收主要在600 nm和900 nm和750 nm和950 nm之间发出荧光13]。大的吸收和荧光光谱的重叠导致荧光由协调小组本身的重吸收。荧光光谱非常宽。其最大值约810海里的水和血液中大约830海里(14]。基于吸收的医学应用,最大吸收约800海里(在低浓度的血浆)是重要的(13]。结合荧光检测、激光波长约为780纳米。在这个波长,仍然可以检测到的荧光协调小组的过滤散射光激发光束(14]。协调小组已有些奇异的光吸收行为作为浓度的函数,因为它往往总在高浓度的水。这意味着有效的吸收不会增加线性增加浓度。此外,协调小组倾向于降低光照。光降解是减轻当协调小组必将白蛋白,但它仍然收益缓慢(天)。光降解也是浓度依赖性。协调小组在肝微粒体代谢,只有通过肝脏和胆管排泄;因为它是不被肠黏膜吸收,可以归类为低毒性(15]。怀孕期间政府并非没有风险。已知的文献中,协调小组分解成有毒废物材料在紫外线的影响下,创建一个仍然未知物质的数量15]。然而,过去的研究表明,协调小组(物质没有紫外线的效果)基本上是这样,只有轻微的毒性(15]。静脉注射的LD₅₀值以动物60毫克/公斤在老鼠老鼠和87毫克/公斤。偶尔,在42000年的情况下,轻微的副作用发生在人类如喉咙痛和潮热。效果如过敏性休克、低血压、心动过速、呼吸困难、和荨麻疹只发生在个案;严重副作用的风险提高慢性肾功能障碍患者(17]。的频率轻微、中等和严重的副作用只有0.15%,0.2%,0.05%。竞争对手萤光素的物质,有副作用的比例是4.8%。本研究旨在探讨协调小组标记细胞的潜力在活的有机体内跟踪应用程序。在本研究中我们使用人类胎盘间充质基质细胞(hPDMSCs),人类沃顿的果冻msc (WJMSCs),和人类诱导多能干细胞(万能)派生neurospheres (iNSCs)与协调小组和跟踪标记移植细胞使用皮肤损伤和脊髓损伤SCID小鼠模型。跟踪标记移植的细胞进行了使用新临床前在活的有机体内成像系统。新系统预设近红外(NIR)励磁(710 - 760 nm)和发射(810 - 875 nm)通带滤波器来评估国际协调小组标签。持续再生细胞疗法的分子成像的应用将其成功应用的关键。

2。材料和方法

2.1。协调小组的准备股票的解决方案

国际协调小组解决方案用于本研究由溶解协调小组粉(激光级我25;Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州)α修改最低基本培养基(αMEM Lonza)导致股票的解决方案在浓度为0.5,1,2,2.5毫克/毫升。

2.1.1。光学成像

在活的有机体内和在体外荧光成像技术进行的新光谱CT成像系统(创建Xenogen,珀金埃尔默,妈,美国)。光学成像仪是一个集成的荧光系统(400 - 900 nm),由一个不透光的样品室(黑盒)和电荷耦合器件(CCD)相机。尽量减少电子背景和灵敏度最大化,CCD相机热电的冷却到−90°C。所有在体外实验样本成像1毫升的细胞培养基24-well板。所有图片都是获得使用过滤器设置预设与背景协调小组波长665 - 695纳米,激发波长在710 - 760海里,一组发射波长在810 - 875海里。一致的照明参数用于所有近红外荧光收购。对于所有实验,视野(FOV)专注于整个区域,调整曝光时间调整,以避免饱和信号,f /站是由软件自动调整,灯电压设置为“高”,装箱是继续中。收购后,所有图片都是归一化单位的平均效率,显示在相同规模的荧光强度,并分析了使用生活图像4软件(创建Xenogen,珀金埃尔默,妈,美国)。

2.2。协调小组人类干细胞的标记

为了估计的最优浓度标记细胞,5×10⁴hPDMSCs被播种/ 6-well板。当达到70 - 80% confluency种子细胞,细胞受到胰蛋白酶化和孵化协调小组不同浓度(0.1毫克/ mL-2毫克/毫升)αMEM培养基。协调小组标签,这些细胞被孵化30分钟37°C。标签后,多余的染料被洗两次DPBS和细胞的细胞进一步培养完成αMEM(α最低基本媒体)媒体。没有标记的细胞协调小组被用作控制。为了测量光子发射的标记细胞,新谱CT成像系统(美国创建Xenogen,珀金埃尔默,MA)受雇。

2.2.1。优化细胞的标记协议

人类干细胞被贴上不同的协调小组浓度范围为0.1毫克/ mL-2毫克/毫升和孵化30分钟37°C。细胞生存能力通过台盼蓝染料排斥试验和细胞凋亡分析了建立标记细胞的可行性。

2.2.2。在活的有机体内纵向随访研究

人类干细胞与光学标记标签协议。标记效率决定基于实验从上面的协议。1×10⁵细胞被注入在表面或脊髓损伤部位受伤,每天每个鼠标成像21天,直到nonlabeled控制细胞的荧光信号匹配。每组群6老鼠在体外光学成像实验进行了一式三份。

2.2.3。光学成像数据分析

光学成像数据的定量分析,感兴趣区域(ROI)被放置在每个协调小组测试样本(控制端与协调小组标记细胞注入网站)。定量措施的标记细胞的荧光强度测试老鼠站点规范化单位的平均效率,显示在相同规模的荧光强度,并分析了使用生活图像4软件(创建Xenogen,珀金埃尔默,妈,美国)。“效率”的单位代表每个事件发出光子的分数比激发光子(创建Xenogen,珀金埃尔默,妈,美国)。

2.3。人类胎盘样本的集合

人类胎盘组织(生物废弃物交付后)收集在获得书面同意接受足月妊娠的患者选择性剖腹产。进行了研究机构审查委员会(IRB)批准后从基督教医学院Vellore,印度。

2.4。动物

黑色SCID小鼠(B6.CB17-prkdcScid / SzJ)被用于这项研究。老鼠从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)。机构实验动物伦理委员会批准。这项研究是按照制度进行基督教医学院动物保健指南Vellore,印度。

2.5。WJMSCs

之前人类WJMSCs派生如前所述Sabapathy et al。19,20.]。

2.6。胎盘msc

孤立的人类胎盘msc是如前所述[21]。

2.7。iNSCs (Neurospheres来自hiPSCs)

integration-free无毒化安全则生成使用nucleofection协议(Lonza)。我们已经优化人类万能的协议有效的代自体食动物胎盘msc。神经诱导,则派生与神经治疗拟胚体感应媒体(干细胞技术,公元前,加拿大)补充了岩石抑制剂(y - 27632)。此外,这些被镀到巴解组织/层粘连蛋白涂层板进一步分化。

2.8。细胞毒性分析

国际协调小组的初步的细胞毒性分析治疗细胞进行了利用台盼蓝染料排除测试(22]。细胞生存能力测试通过台盼蓝测试之前和之后进行所有的细胞标记过程来验证可行性。细胞被计入血细胞计数器,用于后续的光学成像研究。

2.9。细胞凋亡分析

细胞凋亡分析进行了如前所述之前Sabapathy et al。19,21]。

2.10。皮肤损伤模型

对于皮肤损伤模型,面积1厘米×1厘米背侧皮肤被为了创建一个伤口。约1×10⁶协调小组(0.2毫克/毫升)标记WJMSCs播种到脱细胞羊膜支架缝合在受伤的网站(19]。

2.11。脊髓损伤模型

脊髓损伤小鼠模型是由创建挫伤椎板切除术后脊柱损伤T9和病人之间的关系。下胸椎受伤的老鼠移植1×10⁶协调小组(hPDMSCs / iNSCs)标记细胞。标记的细胞后胰蛋白酶化服用0.2毫克/毫升协调小组和孵化为30分钟37°C。这些细胞被洗两次与DPBS和resuspended 25μ移植前L (PBS。

2.12。在活的有机体内非侵入性成像

协调小组的总通量排放标记细胞移植后使用新频谱监测CT成像系统(创建Xenogen,珀金埃尔默,妈,美国)。

2.13。统计分析

σ情节V11.0软件是用于统计分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。统计分析之间的多个组估计使用方差分析(方差分析)测试图基的方法。的值被解释为是巨大的。

3所示。结果

3.1。协调小组标记的细胞

最初,我们专注于标准化的协调小组集中有效的细胞标记(图1)以最小的细胞毒性检测细胞存活率和细胞凋亡检测。人类胎盘msc被播种24-well板块;confluency达到约70 - 80%的时候细胞使胰蛋白酶化和标记通过与不同浓度的处理协调小组(0.1毫克/ mL-2毫克/毫升)。我们的数据表明,标记细胞发出的总通量与协调小组的浓度直接成比例。没有明显减少的总通量标记细胞在此期间3天。自在体外培养胎儿msc是快速分裂细胞,观察不能超过3天进行结果overconfluency的细胞。进一步,我们注意到,在胰蛋白酶化1:2的比例协调小组荧光水平得到稀释,显著降低荧光被记录。

3.2。细胞毒性,台盼蓝染料排除实验

为了访问细胞的细胞毒性,进行了简单的台盼蓝染料排除测试(图2)。

人类胎盘msc受到不同浓度的协调小组(0.1 - 2毫克/毫升)和细胞的生存能力在24小时监控。我们的生存数据表明,细胞的生存能力是国际协调小组浓度成反比(图2)。从我们获得的结果数据是按照先前的研究代表,协调小组超过0.25毫克/毫升浓度显著降低细胞的生存能力(23]。我们选择0.2毫克/毫升的浓度ICG在不影响安全标记的细胞在活的有机体内信号质量为目的的移植。

3.3。流式细胞仪分析细胞凋亡

量化的凋亡细胞,来源于细胞毒性的影响0.2毫克/毫升和0.5毫克/毫升ICG浓度孵化hPDMSCs,细胞被染色和7 aad PE贴上膜联蛋白V工具包(BD Pharmingen、钙、美国)获取和分析凋亡细胞的比例通过BD流式细胞仪石中剑流式细胞术。

此外,细胞凋亡分析进行了严格的细胞毒性效应评估。数据表明,胎盘msc协调小组处理浓度为0.5毫克/毫升(图3 (c))表现出明显更多的细胞发生细胞凋亡与细胞治疗浓度为0.2毫克/毫升协调小组(图3 (b))。这意味着更高的ICG浓度可以离开不利影响细胞的生存能力和/或一般健康。

3.3.1。纵向光学成像的ICG贴上hPDMSCs WJMSCs, iNSCs来自hiPSCs

远红外的荧光标签的hPDMSCs协调小组在浓度为0.2毫克/毫升30分钟后孵化时间37°C显示荧光信号随时间慢慢减少化验在体外在1、2、3等兼容缓慢释放造影剂的细胞。发射光子的信号减少量化在感兴趣的区域(ROI)标签和相当于控制在120 h后标签(图0.2毫克/毫升浓度协调小组1)。荧光信号在1 h, 24小时、48小时、72 h相比明显高于precontrast数据()。当化验在体外标签后,120 h的信号没有明显不同于基线(浓度在0.2毫克/毫升)协调小组。

纵向研究人类PDMSCs和WJMSCs标签为0.2毫克/毫升的协调小组为30分钟37°C显示动力学相比,贴上hiPSCs相似的荧光信号。细胞荧光信号明显升高,24和48小时()与控制。

3.4。在活的有机体内协调小组的成像标记细胞

3.4.1。皮肤损伤

对于皮肤损伤模型,这些细胞被标记在37°C胰蛋白酶化和孵化后30分钟。国际协调小组标记细胞(1×10⁶)被播种到脱细胞羊膜。24小时后,羊膜包含标记WJMSCs嫁接在皮肤受伤的老鼠模型。标记细胞的总通量是每天监测。表面组织损伤的排放通量模型逐渐恶化,持续了大约2周(图4)。我们也测试了协调小组的直接注入标记细胞(1×10⁶)在现场的受伤和光子发射的时间保持不变。

3.5。在SCID小鼠脊髓损伤

3.5.1。荧光

的荧光信号协调小组贴上hiPSCs相比明显高于hPDMSCs荧光信号的第一天(),第三天(),6天(),9 ()(图5 (b))。

3.5.2。生存能力测试

台盼蓝排斥试验显示,生存能力无显著差异iNSCs来自hiPSCs标签或标记hPDMSCs之间相比无标号的控制。所有组表现出异常大于95%,实验组之间没有显著差异()(数据2和5)。

深层组织的创伤模型,创建挫伤损伤胸脊髓较低地区的老鼠。在移植之前,这些细胞被贴上协调小组(0.2毫克/毫升)和resuspended大约25μPBS的L。移植细胞的光子发射(iNSCs / hPDMSCs)测量每一个交替的一天。我们的数据表明,从深层组织信号模型是绝对的和持续了大约三个星期(图5)。

4所示。讨论

任何细胞疗法的有效性取决于很多不同的因素如疾病病因之间的相互作用、细胞类型、传递路线,细胞保留/移植,细胞,激活居民或功能集成。为了优化细胞疗法,我们需要提高我们的理解这些因素是如何交互的在活的有机体内。最近干细胞成像研究凸显了一些障碍临床翻译使用成人或多能干细胞:(1)有限细胞移植,细胞生存,和细胞增殖;(2)可怜的细胞分化和细胞成熟;(3)与同种异体细胞移植免疫原性;(4)潜在的致瘤性和多能干细胞衍生品。

本研究是创新对于优化条件的安全协调小组将以最小的细胞毒性细胞增殖,细胞凋亡在活的有机体内跟踪SCID小鼠移植人类干细胞的至少两个方面。(1)我们所知,这是第一在活的有机体内干细胞的fda批准的荧光染料协调小组跟踪研究,利用标签胰蛋白酶化后的人类干细胞的细胞(大多数以前的研究使用的标签2 d细胞培养皿中,然后使胰蛋白酶化细胞;这实际上减少了协调小组信号极大地在我们的实验中)如hPDMSCs WJMSCs, iNSCs来自hiPSCs。(2)这些在体外标记细胞移植在表面或深部组织损伤在SCID小鼠和跟踪网站在活的有机体内非侵入式光学成像。代传染后,integration-free万能,我们想要一个更安全的技术监控细胞在活的有机体内。之前的数据从Boddington等人是第一个全面的报告表明潜在的协调小组标记细胞非侵入性细胞使用光学成像跟踪应用程序。在这项研究中我们进一步优化细胞标记协议和清楚地表明,协调小组标记细胞可以有效地用于追踪细胞甚至从深层组织区域。协调小组标记的细胞和跟踪的细胞使用光学接口成功地满足所有规定的标准一样,是否理想干细胞临床试验期间跟踪技术(11]。此外,协调小组的既存FDA批准用于人类临床应用进一步呈现协调小组更有吸引力的转化研究用更少的安全问题比其他荧光染料可在市场。标签技术使用协调小组很容易和经济,虽然光学成像界面的初始成本高。运行维护成本和额外的开销是非常小的。此外的收购和图像分析在活的有机体内数据是非常快速和成本效率。这个应用程序的进一步的、非侵入性的高效细胞跟踪特性使这个应用程序更具吸引力比现有的方法非常繁琐和昂贵的,需要反复的侵入性检查。因此重要的是要关注未来角色定义分子成像的安全性和有效性临床干细胞疗法的实施。

在这项研究中,我们只看了3种不同的细胞类型hPDMSCs, iNSCs, WJMSCs。水平的研究需进一步评估效果和标签条件所需的特定的细胞类型。根据我们的数据(数据4和5),我们可以跟踪标记细胞只有3周。因此我们需要开发标记有效性和监管协调小组的降解动力学使用伴随代理/技术。

很难理解,尽管协调小组是几十年前开发的,并经常使用在一些临床应用,染料的使用对于细胞跟踪应用程序最近被发现。通过我们的研究,我们试图强调协调小组在转化应用程序的重要性。

5。结论

我们的原则在当前的研究中证明有效证明,协调小组标签可以用来追踪细胞不仅从表面的组织移植后也从深层组织的网站。基于之前的研究,我们建议协调小组根据标签技术蕴含着巨大的潜力在活的有机体内细胞在临床应用跟踪。然而,需要进一步的研究来优化和验证研究结果在不同的动物以及人类的模型。

免责声明

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者要感谢部门生物技术(印度生物技术部),印度政府,Ramalingaswami奖学金和研究支持格兰特(印度生物技术部格兰特BT / PR8527 /地中海/ 31/234/2013,BT / PR8742 AGR / 36/773/2013和BT / PR15420 /地中海/ 31/122/2011)桑杰库马尔。