人类胚胎干细胞心室心肌细胞的形态学分析:确定成熟国家人口通过量化参数的单个细胞

文摘

建立了定量方法来确定人类胚胎干细胞的成熟程度心室心肌细胞(hESC-vCMs)处理不同代谢兴奋剂(即。、异丙肾上腺素和油酸)在早期分化。细胞被double-immunolabeled与α辅肌动蛋白和考克斯IV抗体,标记肌原纤维和线粒体,分别之后,通过共焦显微镜图像被收购了。为了确定分化的程度,图像分析协议被用来量化细胞形状和面积,肌纤维组织的程度以及夹层的线粒体在细胞内的肌原纤维之间。我们表明,油酸或异丙肾上腺素,或两者的结合,诱导更细长hESC-vCM表型比未经处理的控制。此外,细胞用异丙肾上腺素治疗仅表现出类似级别的肌纤维组织控制,但这些治疗与油酸/异丙肾上腺素没有表现出一个更有组织的(并行)肌原纤维的取向。合并后的异丙肾上腺素/油酸治疗也导致增强线粒体肌原纤维之间的夹层。我们建议这些定量的形态学方法可能作为简单而有效的工具,可以利用的决心hESC-vCMs结构成熟的水平。

1。介绍

在最近的一项研究中,收集的数据来自190个国家的美国心脏协会,证实心脏病仍然是过早死亡的主要原因之一,在世界许多地区中风和癌症后今天1]。晚期心力衰竭是由于缺血性心脏病、高血压、心房颤动和特点是大量心肌细胞的不可逆损失2]。此外,当心肌细胞故障由于疾病(或老化),有限的再生成人心脏终末分化细胞的性质意味着心肌的修复受到严格限制,这对病人来说是致命的。当前的许多治疗心脏病的本质上是缓和(3]虽然心脏移植被认为是最后的希望在许多情况下,这是严重缺乏合适的捐献器官的限制(4]。我们目前所了解的机制,调节心脏的发展在人类已经从数据推断从动物模型获得的系统,例如鼠标和斑马鱼(5- - - - - -9]。尽管这些动物的研究已经取得了很多有用的信息关于心脏的发展,各种特有的差异已确定(10];因此,仍有许多被发现关于人类心脏的形成和再生。

它已经不到两年胚胎干细胞(ESCs)首次成功地从胚泡期人类胚胎的内细胞团分离(11]。汤姆森et al。11]表明,这些细胞具有正常核型和接受未分化增殖,但仍维持多能自然,因此能够分化为内胚层、中胚层和外胚层细胞,这取决于外部线索。在这个时候,有现成的人类胚胎干细胞的意义(为)移植医学、药物发现研究,基本发育生物学研究迅速升值。最近,已分化细胞重新编程的方法(即。,embryonic and adult fibroblasts) from mouse into pluripotent stem cells was described [12),之后不久,两组产生诱导多能干细胞(万能)从人类成纤维细胞13,14]。从那时起,准备为其可用性和万能以及有效的这两种类型的细胞分化成心肌细胞(15- - - - - -17)为科学家和临床医生提供了额外的工具来研究心脏早期发育,以及一个在体外心脏疾病的模型。此外,在过去的几年里,使用心肌细胞替代疗法已经开始被认为是治疗心脏病(18,19]。然而,大量的基础研究仍然需要在此之前成为一个可行的临床选择(20.),主要是因为人类的ESCs和万能似乎结构和功能不成熟15,21- - - - - -23]。例如,Kehat et al。15]hESC-derived心肌细胞的结构和功能特性描述(hESC-CMs),让人想起早期心肌细胞,这样,虽然有几个心脏基因和转录因子表达这些细胞,还有各种心脏蛋白,肌原纤维组织的缺乏是一个未成熟的细胞的表型特征。Rao et al。22]也描述不成熟表型ESC -和iPSC-derived心肌细胞并试图诱导后者更为成熟的表型,通过增加细胞在聚二甲基硅氧烷(PDMS)包含microgrooves涂上纤连蛋白支架。他们发现,尽管iPSC-derived心肌细胞培养时采用一种更为成熟的表型在这种情况下,基因表达的模式保持不变(22]。最近,亚强等。23]也hESC-derived心室心肌细胞的功能和结构性能特点(hESC-vCMs)。他们报告说,而成人心肌细胞杆状和100年的订单μ米长,hESC-vCMs相对较小的规模和经常圆形(即。,10 - 20μ米直径)。此外,圆形的形状保持即使在很长一段时间在文化、虽然有细胞大小的增加。亚强等。23)也报道,组织收缩在hESC-vCMs差,肌原纤维蛋白在低密度和以随机的方式组织这些细胞的细胞质内。可见从各种报道,尤为重要的是,要描述细胞的形态学和超微结构的属性,因为他们成熟,特别是尽可能量化参数,因为这将帮助研究人员决定细胞的分化状态,因此他们的执行能力在细胞替代和移植过程。

尽管代谢机制,推动心脏发展在很大程度上仍是未知的(24),一些团体已经开始调查所涉及的不同的生物信号可能驾驶成熟,这将允许策略来加快这一过程在体外开发。在这项研究中,hESC-vCMs与异丙肾上腺素治疗,油酸,或两者的结合,这些药物对细胞的影响成熟比未经处理的细胞(控制)。异丙肾上腺素是一种β肾上腺素能受体激动剂,导致细胞内钙的大量涌入^{2 +}为心肌细胞,通过这种方式,刺激细胞收缩(15,25- - - - - -27),而油酸是一个数组长链脂肪酸,据报道,发挥心血管作用通过调节脂质膜的特性和影响细胞信号通过它的作用对离子通道功能(28]。长链脂肪酸如油酸也被证明是一个重要的能量来源,需要心脏功能(29日),以及信号转导途径中起作用在心脏组织30.),通过激活促进心肌细胞能量代谢的成熟的过氧物酶体proliferator-activated受体-α(PPAR -α)[31日]。

在我们的研究中,用异丙肾上腺素治疗和/或油酸后,细胞immunolabeled有抗体α辅肌动蛋白和考克斯IV识别线粒体和肌原纤维,分别为(32,33),然后用DAPI标记复染色细胞核,并通过激光扫描共焦显微镜图像被收购了。方法被开发来确定hESC-derived心室心肌细胞的成熟程度通过量化的四个明显的形态特征:细胞形状,细胞面积、肌原纤维的取向,和水平的线粒体和肌原纤维的夹层。

2。材料和方法

2.1。文化和心室规范人类胚胎干细胞

心室的心肌细胞生成hES2人类胚胎干细胞(hESC)行如前所述34]。简而言之,未分化hES2细胞单独培养(即。,without feeder cells) in 6-well plates (Corning, Tewksbury, MA, USA), coated with Matrigel (Discovery Labware, Corning, New York, USA) and maintained in mTeSR1 medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada). When the cells reached approximately 80% confluence, differentiation was initiated when hESC colonies were dissociated into single cells using Accutase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and then these were cultured in mTeSR1 medium with Matrigel (40 μg / mL), BMP-4 (1 ng / mL,英杰公司生命技术),和ρ激酶抑制剂(10(岩石)μM;研发系统,明尼阿波利斯,美国)在缺氧条件下24 h形成心原性的拟胚体(cardiospheres)。文化被洗和孵化StemPro34 SFM(生命表达载体技术)含有抗坏血酸(50μg / mL;Sigma-Aldrich有限公司LLC,圣路易斯,密苏里州,美国),GlutaMAX-1(2毫米;英杰公司生命技术),BMP4 (10 ng / mL),和人类重组activin-A (10 ng / mL;英杰公司3天的生活技术)。4天,IWR-1 (4 - (1、3、3、4、7、7 a-hexahydro-1 3-dioxo-4, 7-methano-2H-isoindol-2-yl) -N-8-quinolinyl-benzamide),小分子Wnt抑制剂(5μ米/毫升;恩佐生命科学公司,法明岱尔,纽约,美国),添加到抑制规范化Wnt信号通路。8天,文化被转移到一个常氧环境和维护在StemPro34 SFM包含50μg / mL独自抗坏血酸。

在20天开始后的心脏分化过程,cardiospheres与Ca分离^{2 +}和毫克^{2 +}无PBS含有胶原酶IV(1毫克/毫升)DNase (10μg / mL), 0.05%胰蛋白酶,之后他们转移到杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM,表达载体的生命技术)含5%胎牛血清(FCS), 2毫米谷氨酰胺,青霉素和链霉素1%,和100年μ不必要的氨基酸(生命表达载体技术)。文化是维持24小时在37°C在湿润环境中有5%的公司₂空气/ 95%。慢病毒的细胞被转导构造LV-MLC2v-tdTomato-T2A-Zeo如前所述[35)和心室心肌细胞(hESC-vCMs)是专门选择通过孵化zeocin (300μg / mL)。细胞被允许恢复zeocin选拔程序包含正常的DMEM 5% FCS至少96 h开始之前代谢治疗实验。

2.2。治疗与代谢hESC-vCMs兴奋剂

hESC-vCMs被镀到玻璃盖滑(13毫米直径,1.5 h,保罗•Marienfeld GmbH & Co . KG Lauda-Konigshofen,德国)涂上了poly-D-lysine (5μ克/厘米³)和人工基底膜的密度4×10⁴细胞每盖玻片。24小时后,细胞治疗0.3μM异丙肾上腺素(Sigma-Aldrich有限公司LLC)和/或100μ或200μM油酸(Sigma-Aldrich有限公司)96 h之前他们用4%多聚甲醛固定在磷酸盐溶液(PBS;137毫米氯化钠,氯化钾2.68毫米,16毫米Na₂HPO₄5.2毫米,不₂阿宝₄为15分钟,pH值7.3)。固定细胞然后用PBS彻底清洗,然后存储在PBS immunolabeling之前在4°C。

2.3。Immunolabeling

孵化所有步骤中使用这个协议进行在黑暗中在室温(即。~ 22°C)。异丙肾上腺素和/或油的酸洗和paraformaldehyde-fixed hESC-vCMs孵化在PBS含有0.1% Triton x - 100 (PBS-T) 10分钟,之后他们孵化阻断缓冲区(PBS-T山羊血清含10%,1%牛血清白蛋白;BSA) 30分钟。这些细胞被然后用鼠标单克隆anti-sarcomeric顺序孵化α辅肌动蛋白抗体(的稀释1:100;Abcam、英国剑桥)和兔多克隆抗体anti-COX IV(的稀释1:800;Abcam)。这两个抗体稀释前使用阻塞缓冲区。那时Alpha-actinin可视化使用Alexa萤石488 F (ab′)₂片段的山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)抗体的稀释1:200;英杰公司生命技术)。考克斯IV可视化使用阿647 n(发生/德牧)山羊anti-rabbit IgG抗体(的稀释1:200;活动主题,卡尔斯巴德、钙、美国)。每个抗体孵育步骤持续了1 h;每个孵化hESC-vCMs之间广泛冲洗和清洗缓冲(PBS-T山羊血清含1%,0.1% BSA)。最后用清洗缓冲洗净后,细胞用Milli-Q水冲洗一次,然后被安装在延长黄金不变色试剂包含DAPI(英杰公司生命技术)。挂载的细胞被蒙在鼓里一夜之间在室温和随后转移到4°C之前,通过激光共聚焦显微镜扫描和多光子激发可视化。

2.4。激光共聚焦显微镜扫描和多光子激发

的荧光标记心肌细胞图像,徕卡TCS SP5 II激光扫描共焦系统安装在徕卡DMI 6000倒置显微镜(徕卡微系统公司位于德国)配备多光子激发能力。获得的图像使用徕卡HCX PL APO 40 x / 1.25 - -0.75 NA油浸物镜。Alexa萤石488通过共焦显微镜观察荧光使用488 nm励磁和500 - 550 nm)发射,tdTomato荧光观察通过共焦显微镜使用561 nm励磁和575 - 610 nm)发射波长,和阿647 n荧光观察通过共焦显微镜使用633 nm励磁和650 - 750 nm)排放。DAPI可视化是通过多光子激发显微镜使用780 nm励磁和432 - 482 nm)排放。

2.5。数据分析

immunolabeling和共焦显微镜后,心肌细胞生成的图像进行了分析使用图像J(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。心肌细胞的形状是量化使用“循环”功能。细胞的图像显示α辅肌动蛋白标签被用于分析。共焦microscope-generated规模栏包含在每个图像被用来校准的规模在图像j .周长细胞随后跟踪使用“徒手选择”工具和形状的细胞随后确定,这样一个更圆的细胞表现出循环值接近1而更细长的细胞有一个值接近0。定量数据分析进行了使用Microsoft Office Excel 2010(美国微软,微软,佤邦)。

量化的方向在心肌细胞肌原纤维,“多点”工具在图像J用于分析α辅肌动蛋白标记图像。在每一个细胞,总共32,两点坐标用于标记每个16肌原纤维的长度。这些坐标被导出到Excel,直线的斜率(m)连接两个点计算使用以下方程:。方差(即。,standard deviation²)这些计算斜率值被用来表明如果肌原纤维是并行运行通过一个细胞(在这种情况下,他们会有一个方差接近零)或如果他们分布在一个随机的方式(比如,他们会表现出一个相对较高的方差值)。

确定级别之间的夹层α-actinin-labeled肌原纤维和考克斯IV-labeled线粒体进行线扫描分析。个人的共焦荧光图像α辅肌动蛋白和第四考克斯在图像J然后堆放。microscope-generated规模酒吧被用来设置规模,和四个20之间的直线μm和30μm在长度和~ 1μ米宽被放置在区域的每个心肌细胞肌原纤维排列在平行的线垂直于肌原纤维的方向。此外,线被离核和细胞的外边缘。两组数值线扫描数据获得的:每一行一个α辅肌动蛋白图像,另一个用于第四考克斯的形象。这些数据被导出为Excel图表绘图和皮尔逊相关系数的计算。

Dunnett测试是用来确定数据集之间的显著差异。这是执行与SPSS统计软件(美国、IBM、纽约Armonk)。

3所示。结果

异丙肾上腺素的影响和油酸hESC-vCM成熟是由量化细胞形状,细胞面积、肌原纤维的取向,和水平的线粒体和肌原纤维的夹层。在这些实验中,共有309个细胞从4个不同的实验进行了分析。

3.1。量化的细胞形状

0.3 hESC-vCMs被未经处理或处理μM异丙肾上腺素;100年μ或200μM油酸;或0.3μ异丙肾上腺素,100μ或200μM油酸。一个细胞被immunolabeledα辅肌动蛋白抗体识别肌原纤维后,细胞的形状被确定循环量化值,值为- 1指示一个完美的圆而值0表示一条直线(图1(一)面板(A))。0.3代表细胞治疗的例子μ异丙肾上腺素和200μM油酸,导致所有的治疗,最伟大的形状的变化数据所示1(一)面板(B) -1(一)面板(C)。这些细胞循环(图的值1(一)面板(B)) ~ 0.31 Arb。单元(AU)和(图1(一)面板(C)) ~ 0.97 AU,分别与细胞在图1(一)面板(B)显示一个相对细长的形态,而在图1(一)面板(C)更圆。

一系列循环的观察值是否hESC-vCMs未经处理或处理异丙肾上腺素和/或油酸;这些信息会显示在直方图的系列数据1 (b)- - - - - -1 (g)。图1 (b)显示循环的范围值获得的未经处理的控制细胞(),这样~ 64.0%的细胞表现出循环的值在0.8和1.0之间Arb单元(AU);~ 30.5%的细胞表现出循环值在0.6和0.8之间非盟,和~ 5.5%的细胞表现出循环值在0.4和0.6之间。的平均循环计算是0.8个天文单位(见黑色箭头在图1 (b))。当细胞接受0.3μ异丙肾上腺素(;图1 (c)),然而,有一个整体转移细胞的形状更圆更细长的表型,相比与未经处理的控制。这反映在一个较低的平均循环价值0.73个天文单位(见黑色箭头在图1 (c))。当处理0.3μ异丙肾上腺素,~ 43.0%的细胞表现出循环的值在0.8和1.0之间非盟,~ 32.6%的细胞在0.6和0.8之间非盟,~ 18.4%的细胞被非盟在0.4和0.6之间,和~ 6.0%的细胞表现出循环值在0.3和0.4之间非盟(图1 (c))。的确,细胞治疗的循环值0.3μM异丙肾上腺素明显低于未经处理的控制使用Dunnett的测试。数据1 (d)和1 (e)节目的传播循环值在100细胞治疗μ米和200μ分别M油酸和黑色的箭头在这些数据显示0.72 AU和0.70 AU的平均值,分别。当细胞治疗100人μM油酸(;图1 (d)),表现出循环比例值在0.8和1.0之间非盟,0.6和0.8 AU, 0.4和0.6 AU,非盟0.2和0.4 ~ 41.0%,36.0% ~ ~ 16.4% ~ 6.6%的细胞,分别。此外,治疗后200年μM油酸(;图1 (e)),细胞表现出循环的比例值在0.8和1.0之间非盟,0.6和0.8 AU, 0.4和0.6 AU,非盟0.2和0.4 ~ 35.4%,35.4% ~ ~ 25.0% ~ 4.2%,分别。因此,100年μ米和200μM油酸治疗人群中生成更多细胞循环价值较低,比未经处理的控制人口使用Dunnett的测试。数据1 (f)和1 (g)节目的传播循环值0.3细胞治疗μ异丙肾上腺素和油酸在100μ米(;图1 (f))或200μ米(;图1 (g))。0.3μ异丙肾上腺素和100μM油酸(图1 (f)),细胞表现出循环的比例值在0.8和1.0之间非盟,0.6和0.8 AU, 0.4和0.6 AU,非盟0.2和0.4 ~ 22.6%,22.6% ~ ~ 25.8% ~ 29.0%,分别计算平均循环价值0.6 AU(见黑色箭头在图1 (f))。0.3μ异丙肾上腺素和200μM油酸(图1 (g)),细胞表现出循环的比例值在0.8和1.0之间非盟,0.6和0.8 AU, 0.4和0.6 AU,非盟0.2和0.4 ~ 23.0%,37.5% ~ ~ 18.7% ~ 20.8%,分别计算平均循环价值0.62 AU(见黑色箭头在图1 (g))。因此,两个0.3μ异丙肾上腺素/ 100μ油酸和0.3μ异丙肾上腺素/ 200μM油酸联合治疗产生更多细胞人口较低循环价值比未经处理的控制人口。

3.2。量化的细胞区

异丙肾上腺素的影响和/或油酸在细胞治疗领域也使用相同的人口调查的细胞用于细胞形状测量。类似于循环数据,获得了一系列细胞面积值对于每个治疗以及未经处理的控制。两个代表未经处理的hESC-vCMs如图2~ 2170年的土地呢μ米²(图2(一个)面板(A)) ~ 10025μ米²(图2(一个)面板(B))。

测量细胞区域的范围为每个治疗一系列直方图数据所示2 (b)- - - - - -2 (g)。图2 (b)显示区域的范围以未经处理的控制细胞,这样~ 5.5%的细胞表现出区域小于4000μ米²,在4000 ~ 50.0%表现出区域μ米²和8000年μ米²8000 ~ 32.0%,区域之间μ米²和12000年μ米²12000 ~ 11.1%,区域之间μ米²和16000年μ米²,20000 ~ 1.4%的细胞表现出区域之间μ米²和24000年μ米²。平均细胞面积8109μ米²计算(见黑色箭头在图吗2 (b))。数据2 (c)- - - - - -2 (g)显示不同治疗方法对细胞的影响区域。在所有情况下,一个类似的地区范围计算的未经处理的控制。例如,在所有情况下,在6%和11%之间的细胞有一个面积不到4000μ米²;大多数的细胞(即。,62% to 83%, depending on the treatment) had areas of 4,000 μ米²和12000年μ米²4000年,35%至48%的患者拥有了地区之间的μ米²和8000年μ米²8000年和26%至37.5%的患者拥有了地区之间μ米²和12000年μ米²_。剩余的细胞,6.25%至16%的患者拥有了地区之间的12000年μ米²和16000年μ米²16000年,3%至8%的患者拥有了地区之间的μ米²和20000年μ米²,在20000年1.5%到4%的细胞区域μ米²和28000年μ米²。此外,意味着9358细胞区域μ米²,9014年μ米²,7383年μ米²,9007年μ米²,8884μ米²0.3细胞处理的计算μ异丙肾上腺素,100μ油酸,200μ0.3 M油酸μ异丙肾上腺素+ 100μ0.3 M油酸,μ异丙肾上腺素+ 200μ分别为M油酸(见黑箭头人物2 (c)- - - - - -2 (g))。没有明显不同的治疗成果区域使用Dunnett从未经处理的控制的测试。

3.3。量化肌原纤维的方向

异丙肾上腺素的影响和/或油酸肌原纤维的组织也调查(图3)。使用α辅肌动蛋白图像用于细胞形状和面积测量,一系列的短线条画的顶部和肌原纤维的取向相同(即。垂直于sarcomeric在每个单元(数据行)3(一)- (a)面板3(一)面板(C))。每条线的斜率的价值计算,在山坡上的方差决定。细胞与随机的肌原纤维表现出相对较高的方差值而肌原纤维排列在平行的方差值接近零。数据3(一)- (a)面板3(一)面板(C)显示三个代表未经处理的控制hESC-vCMs的例子来说明不同的肌纤维组织模式;这些细胞有斜率方差~ 0.02 AU(图3(一)面板(a)), ~ 124 AU(图3面板(a) (B)), ~ 486 AU(图3(一)面板(C))。

斜率方差衡量的范围为每个治疗和治疗控制一系列直方图数据所示3(b) -3(g),而一个相对广泛的方差值是未经处理的控制和观察每个治疗组,我们想确定的任何治疗刺激更多的并行肌原纤维的形成,与未经处理的对照组相比。因此,我们最感兴趣的细胞比例与斜率方差值介于0盟和20个非盟。在未经处理的控制()~ 46%细胞方差0-20盟(图的价值3(b))。同样的,当细胞接受单独异丙肾上腺素()~ 47%有方差值从0到20盟(图3(c))。当细胞治疗100人μM油酸(;图3(d))或200μM油酸(;图3然而,(e)) ~ 67% ~ 70%的细胞,分别有方差值介于0盟和20个非盟。此外,当细胞接受异丙肾上腺素和100人μM油酸(;图3(f))或200μM油酸(;图3(g)) ~ 81% ~ 70%的细胞,分别有方差值介于0盟和20个非盟。因此,治疗油酸似乎刺激人口拥有大量的细胞肌原纤维的平行。

3.4。量化的水平夹层的线粒体和肌原纤维

图4(一个)显示了一个代表性的例子的hESC-vCM immunolabeled抗体α辅肌动蛋白和考克斯IV标签肌原纤维和线粒体。细胞与DAPI costained标签细胞核。1号线指示的位置之一,四线扫描分析,进行细胞水平来确定夹层的线粒体和肌原纤维。在每一个细胞进行治疗和未经处理的检测控制,四行被远离原子核和垂直于肌原纤维的方向。图4(b)显示了执行两个图形产生的线扫描分析1号线在图4(a),这样绿色和红色线显示的荧光强度α辅肌动蛋白和考克斯IV。夹层的程度是由计算皮尔逊相关系数(PCC),在这种情况下等于~−0.03。新闻申诉委员会范围从+ 1−1,+ 1表示正相关和−1表示负相关或完美的排斥,0表示没有相关性(即。随机分布)。自图像有一个黑色背景,PCC永远不会完全+ 1或−1;然而,更高层次的夹层的线粒体和肌原纤维由更多的负面PCC值表示。

数据4(c) -4(h)是一系列的散点图显示了PCC 80线扫描的数据(4线扫描进行每个细胞在20个细胞)在未经处理的控制和每个5个不同的治疗组。在未经处理的(控制)组,37线扫描表现出一个积极的PCC,而43行扫描- PCC(图4(c))。同样,在0.3μM异丙肾上腺素组,有一个确切的1:1分为积极的和消极的PCC这样值40行表现出积极的PCC价值观和40负(图4(d))。在100年的μ米和200μM油酸治疗组,几乎是相同的,这样获得的PCC值33和32线表现出积极的PCC值,分别分别和47和48线表现出负(数字4(e)和4(f))。此外,在0.3μ异丙肾上腺素和100μ0.3 M油酸,μ异丙肾上腺素和200μM油酸组,线扫描的数量与积极的和消极的PCC的价值观是相同的,这样,在这两种情况下,26日线有积极的PCC负值(数据值而54行4(g)和4(h))。

4所示。讨论

之前几组报道,胚胎干细胞诱导分化成心脏谱系细胞接受一个形状和大小的改变,因为他们成熟的(5,23,36- - - - - -38]。分化也伴随着超微结构的变化,细胞周期,细胞的代谢特性。在发展中鼠标的心,例如,据报道,早期胚胎心肌细胞在面向形状和肌原纤维的多边形在细胞质中随机;然而,在胎儿发育过程中,这些细胞变得更加细长,肌原纤维变得越来越一致,最终开发一个很好组织细胞结构(5]。最近,Lundy et al。38)表明,晚期人类ESC-CMs iPSC-CMs(即。,在80年和100年之间的日子在体外分化和培养)更大的规模和表现出更大程度的各向异性,以及更高的肌原纤维密度和更有条理的观察模式,与早期相比细胞20 - 40天。此外,从成熟的心肌细胞分离组织和放置在培养条件进行具体的形态变化与去分化相关。例如,当人类成人心房和心室细胞被独立于接受心脏手术的患者,最初细胞杆状的(39]。然而,在去分化,细胞接受失去sarcomeric结构和伴随的形状的变化。随后在低血清培养这些细胞时,他们可以redifferentiate,这样所有的细胞扁平和传播,他们要么成为规模大,与新生的肌原纤维,或更小的肌纤维组织的一个更成熟的模式(39]。

细胞可以用于临床之前,需要详细描述他们的表型属性。的确,它通常被认为细胞的形态学和超微结构的属性必须研究这些关键特征确定细胞的分化状态,因此他们的执行能力在细胞替代和移植过程(36]。使精确观察的重要性,从而获取详细信息的变化发生在分化在单个细胞水平之前一直强调[40]。事实上,近年来,共焦激光扫描显微镜已成为一个流行的工具为探索心肌细胞分化的不同方面。这些包括迁移的研究发展中心脏神经嵴干细胞领域及其后续分化成心肌细胞(41,骨骨髓来源的成功移植心肌细胞肌球蛋白轻chain-2v-derived GFP表达成老鼠的心脏(42]。这样的观察有助于阐明,在细胞水平上,所涉及的机制和途径在心脏功能在开发过程中形成的5]。也至关重要,然而,证实单个细胞的观察,在本质上可能更定性,定量信息的确切性质的成熟细胞。事实上,这里我们immunolabeled hESC-vCMs,用共焦显微镜获得的细胞图像,然后开发定量方法来确定他们的成熟度水平。在这些实验中,所有的细胞都是类似的年龄(即。,大约20到30天;什么Lundy et al。38)列为“早期”分化阶段),我们测试了两个代谢药物的影响(即。,我soproterenol and oleic acid) on the maturity of cardiomyocytes, when compared with untreated (control) cells. As it would be impractical to acquire high-magnification confocal images from the large numbers of cells that are required for other types of experiments, such as some biochemical assays, our n-numbers are not large. In addition, it is clear that for all the parameters we measured, a range of effects was observed within the population and it is for this reason that we presented the results in either histogram or scatter diagram form. It was therefore important to show the data in this way to emphasize the fact that the individual cells within a population do show morphological variation and thus simply presenting mean values does not necessarily give an accurate measure of cellular phenotype.

细胞形状是第一个参数,我们测量分析的成熟心肌细胞(图1)。所谓的“形状系数”(我们称之为循环价值)曾被使用当比较H7的形状,RuES-2-derived hESC-CMs在早期(即。20 - 40天)和后期(即。,80–120 days) differentiation [38]。形状系数也被用来确定为分化水平,但在这种情况下是原子核的形状是量化43]。我们的数据表明,在未经处理的对照组,大多数的细胞具有更全面的形态,大约70%的人口表现出循环0.8任意单元(AU)及以上。在所有治疗组(即。,the isoproterenol or oleic acid alone groups, or the isoproterenol plus oleic acid groups), a subset of cells also had a circular phenotype. However, in each treatment group a higher proportion of cells had a more elongated morphology, indicating a more mature phenotype. Typically, adult ventricular cardiomyocytes from human biopsies are rod-shaped [39),因此,使用图像之前发表的这些细胞(44,45),我们确定了循环价值~ 0.5天文单位。然而,在我们的测试中,我们测量循环值最低的是0.2 - -0.3的范围内非盟和细胞表现出更多的纺锤状形态(图1(一)面板(B))。提出了心肌细胞的形状直接影响他们的收缩性,通过观察的方式注册横向(37),我们建议循环的差异值获得成人心肌细胞和成熟的心肌细胞用于我们的研究可能反映了这些细胞的成熟度的差异。当比较不同治疗组,油酸单独有一个更深刻的影响比异丙肾上腺素细胞形状,但两者的结合一起刺激更大比例的细胞表现出比要么单独使用时更细长的形态。我们的数据表明,为细胞提供能量的来源,促进能量代谢(通过油酸的成熟29日,31日)可能更重要的是在这些成熟的早期阶段比刺激Ca的涌入^{2 +}(通过异丙肾上腺素(25,26])但是,当两个一起使用,他们不同的行为是互补促进细胞伸长和成熟。

虽然异丙肾上腺素和油酸明显影响细胞的形状,他们两人(无论是单独或一起使用时)似乎对细胞有显著影响区域(图2)。类似于细胞形状数据,观察各种不同的细胞区域的控制和在每个治疗组的最小和最大的细胞区域~ 2000μ米²和~ 24000 - 28000μ米²,分别。然而,区域传播的值在所有组非常相似,表明没有一个治疗影响细胞面积比其他人或多或少。此前,Lundy et al。38)报道,H7的大小和RuES-2-derived hESC-CMs从~ 480μ米²~ 1700μ米²从早期(20 - 40天)(20 - 40天)到后期阶段,分别使用类似的方法我们使用。hESC-vCMs来自hES2细胞的大小,我们使用似乎至少10-20-fold超出前面描述的(38(即。,the majority of the untreated control hES2-derived ventricular cardiomyocytes were ~4,000–8,000 μ米²相比只有~ 480μ米²H7和RuES-2-derived心肌细胞具有分化阶段)。再次使用图片发布之前(44,45),我们认为成人心室心肌细胞有一个典型的细胞面积~ 4300μ米²,这有点类似我们获得的区域值。我们建议细胞区域之间的差异观察我们的数据和之前报道的可能是由于不同来源的干细胞和/或细胞的浓度这一事实镀在实验开始的变化(38]。

之前报道,在未成熟心肌细胞肌原纤维的排列是随机的和相对混乱,而成熟的心肌细胞表现出良好结合肌纤维细胞结构(24,36,38,46- - - - - -49]。这些以前的研究,然而,没有量化的肌原纤维组织细胞的水平。在我们的数据分析,另一方面,我们量化斜率方差未经处理的控制细胞的肌原纤维组织以及仅在那些用异丙肾上腺素治疗或油酸,或两者的结合(图3)。细胞与随机的肌原纤维将表现出相对较高的方差值,而那些肌原纤维排列在平行预计有方差值接近零。我们因此最感兴趣决定细胞的百分比(即最低的方差值。,0至20盟;看到灰色的条形图3(b))。类似的方法曾用于确定人类iPSC-CMs对齐的唱片和non-microgrooved支架,即方差值核的长轴的角度相对于图像的水平轴磁场测量值越小则更很好地结合细胞的数量被确定(22]。在我们的实验中,我们发现isoproterenol-treated细胞的百分比(即表现出更多的平行的肌原纤维非常相似。~ 46%)的未经处理的控制(即。,~47%), suggesting that this metabolic stimulant does not have any significant effect on the development of myofibrillar organization in these cells. On the other hand, when cells were treated with oleic acid, either alone (at 100 μ或200μ米)或结合异丙肾上腺素,一个更高比例的细胞表现出更多的并行肌原纤维(即。从~ 68% ~ 80%,根据治疗;数据3(d) -3(g))。所以这些结果表明油酸刺激心肌细胞成熟的关键方面。

Cardiogenesis,无论是发生在胚胎发生或心脏修复期间,众所周知,涉及noncontractile干细胞的分化与一些能源需求,为积极熟练收缩心肌细胞(24]。因此这种转变需要一个称职的线粒体的形成和成熟网络。以往的经验显示,线粒体网络的组织变化随着心肌细胞的成熟,这样在不成熟细胞线粒体表现出各种各样的随机,细胞核周围的,和transcellular安排,然而,在更为成熟的心肌细胞,肌原纤维之间的线粒体成为闰,形成功能活力单位,促进能源生产和EC-coupling收缩(24]。因此,有人建议,本地化和结构(后来影响函数)心肌细胞线粒体的好细胞的分化和成熟阶段的指标(50]。而代谢机制,推动心脏发展在很大程度上仍是未知,以前显示的结合β肾上腺素能刺激和脂肪酸补充模仿产后开发过程会导致增加线粒体能量(23]。钟等。24)很好地证明了线粒体和肌原纤维的夹层使用线扫描分析。我们现在这一步,使用皮尔逊相关系数量化夹层的水平,这是经常用于生物识别技术提供了一个衡量colocalization两种荧光信号(51),但在本例中是用来表示数量的两个信号的分离(或排除)。散点图如图4说明夹层沿着线的水平扫描从4个不同的地区每20个细胞的治疗控制和各种异丙肾上腺素和油酸治疗。我们的数据清楚地表明,即使在一个细胞中,线粒体和肌原纤维的本地化水平在不同地区可能相差很大。尤其在未经处理的细胞,仅在那些用异丙肾上腺素治疗(数字4(c)和4(d))。当细胞治疗与油酸(在100μ或200μ米),然而,更高层次的夹层是观察,如图所示,表现出消极的皮尔森相关的行数越高价值比一个积极的价值(数字4(e)和4(f))。细胞治疗异丙肾上腺素和油酸(再一次100μ或200μ米)显示一个更大的线粒体水平夹层两倍多线扫描的数量有负面的比正面的(皮尔森相关数据4(g)和4(h))。

5。结论

在结论中,我们使用了四种不同的形态学方法来量化的成熟程度的hESC-vCMs未经治疗或其他治疗代谢兴奋剂,异丙肾上腺素和油酸,单独或组合。使用这些量化方法,我们表明,这些代谢兴奋剂会影响细胞的形态的某些方面而不是别人。例如,异丙肾上腺素对细胞形状产生影响但似乎并不影响细胞面积、肌原纤维组织,(因此可能有点意料之中)线粒体和肌原纤维的夹层。另一方面,油酸(在使用浓度)对细胞形状有明确的影响,肌原纤维的取向,线粒体和肌原纤维的夹层。异丙肾上腺素和油酸一起使用时,他们有明显的协同效应细胞形状和线粒体夹层少但也许对肌原纤维的取向产生影响。这些治疗方法,但是,似乎影响细胞区域。

我们建议这些定量方法可能会提供简单而有效的工具形态成熟的数据可以比较在不同细胞类型之间的一种类型的细胞。因为获得的数据差异很大的单个细胞内的人口,这是特别重要的显示数据的分布以进行准确的数据分析。这样,变化的总体趋势数据可以发现更清楚比均值和标准差(或标准错误)。我们建议这些简单的形态学技术可能通过该领域的其他研究人员更准确地描述ESC-CMs形态成熟的状态和iPSC-CMs除了定性数据已经提交。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由香港教案研究计划奖T13-706/11-1和香港研究资助局研究基金奖HKUST662211将军,662113,16101714。HYSC被香港大学拨款委员会支持研究生奖学金(T13-706/11-11PG)。作者感谢教授Kenneth Boheler (SCRMC,香港大学,香港)为他的宝贵的建议在这个项目的课程和教授Stanley Lau(生命科学分工、香港科技大学、香港)援助与统计分析。作者还要感谢何鸿燊气梁(生命科学分工、香港科技大学、香港)帮助细胞形状测量和唐娜女士背后姚(部门管理、香港科技大学、香港)在SPSS对她的帮助。

引用

1. d·莫札法里恩·e·j·本杰明,a . s . et al .,“心脏病和中风统计- 2015更新:美国心脏协会的一份报告,“循环,卷131,不。4,pp. e29-e322, 2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . Kostin”类型的心肌细胞死亡和心力衰竭患者的临床结果,“美国心脏病学会杂志》上卷,57号14日,第1533 - 1532页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. w . l .胡子,r . c .长,s . a . Geraci“姑息治疗晚期心力衰竭病人,”密西西比州立医学协会杂志》上,55卷,不。1、4到10,2014页。视图:谷歌学术搜索
4. d·o·泰勒·l·b·爱德华兹,p .极光et al .,“注册国际社会的心脏和肺移植:25日正式成人心脏移植报告- 2008”心脏和肺移植杂志》上,27卷,不。9日,第956 - 943页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Hirschy f . Schatzmann大肠艾莉,J.-C。Perriard”,建立心肌细胞结构发展中老鼠的心脏,”发育生物学,卷289,不。2、430 - 441年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. b . a . de Boer g . van den Berg p·a·j·德波尔a·f·m·摩尔人,j . m . Ruijter”增长发展中老鼠的心脏:交互式定性和定量三维阿特拉斯,”发育生物学,卷368,不。2、203 - 213年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c·乔普林此举,e .睡眠,m·莱雅·m·马蒂a·莱雅和j . c . Izpisua Belmonte,“斑马鱼心脏再生发生心肌细胞去分化和增殖,”自然,卷464,不。7288年,第609 - 606页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j .赞美“斑马鱼作为模型来研究心脏发展和人类心脏疾病,”心血管研究,卷91,不。2、279 - 288年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·刘,d . y . r . Stainier斑马鱼心脏早期发育的研究,”循环研究,卷110,不。6,870 - 874年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a·莫雷蒂K.-L。Laugwitz, t·多恩·d·Sinnecker, c .哑剧演员的“人类心脏病的多能干细胞模型”,冷泉港医学视角,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. j·a·汤姆森j . Itskovitz-Eldor s s·夏皮罗et al .,”来自人类囊胚的胚胎干细胞系。”科学,卷282,不。5391年,第1147 - 1145页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. k .高桥和美国Yamanaka”诱导多能干细胞从小鼠胚胎和成年纤维母细胞的文化因素,定义”细胞,卷126,不。4、663 - 676年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. k .高桥k .田边m . Ohnuki et al .,“诱导多能干细胞从成人人类成纤维细胞因素,定义”细胞,卷131,不。5,861 - 872年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m·a·j . Yu Vodyanik, k Smuga-Otto et al .,“诱导多功能干细胞来源于人类体细胞,”科学,卷318,不。5858年,第1920 - 1917页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. Kehat, d . Kenyagin-Karsenti m . Snir et al .,“人类胚胎干细胞可以分化成细胞与心肌细胞的结构和功能特性,”《临床研究杂志》上,卷108,不。3、407 - 414年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. p·w·布里奇·g·凯勒,j . d .黄金生产和j·c·吴。新创心肌细胞:人类多能干细胞分化和直接重新编程,”细胞干细胞,10卷,不。1,16-28,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. k·r·Boheler j . Czyz d . Tweedie H.-T。杨,和a . m . Wobus的美国诉阿尼西莫夫”多能胚胎干细胞的分化成心肌细胞,”循环研究,卷91,不。3、189 - 201年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. m·奎恩,o . Wernet, s m .吴”的承诺和陷阱在细胞替代治疗心脏衰竭,”今天药物发现:疾病机制,7卷,不。2,pp. e109-e115, 2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 大肠Poon C.-W。香港,r·a·李,“人类多能干细胞心肌修复方法:从电生理角度看,“分子制药学,8卷,不。5,1495 - 1504年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. c .虚礼,d·沃德,c, e . van den边缘et al .,”老鼠和人类胚胎干细胞心肌细胞分化,“解剖学杂志,卷200,不。3、233 - 242年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. C.-W。香港、f . g . Akar和r·a·李”转化潜在的人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞心肌修复:从实验模型,”血栓和止血法,卷104,不。1,此前,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. c . Rao t . Prodromakis l . Kolker et al .,“唱片文化基质钙循环的影响心脏细胞来源于人类诱导多能干细胞”生物材料,34卷,不。10日,2399 - 2411年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. w·亚强、k . r . Boheler和r·a·李”发展线索代谢的成熟,电生理学和钙处理人类多能干细胞心肌细胞的特性,“干细胞研究和治疗5卷,第17条,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 钟,p . p . Dzeja r . s . Faustino c . Perez-Terzic a·贝尔法和a . Terzic“线粒体氧化代谢需要心脏干细胞的分化,“自然心血管医学临床实践补充1卷。4日,S60-S67, 2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. j . r .•威金斯”异丙肾上腺素在猫心室肌的收缩能行动。细胞外钾的影响。”循环研究卷,49号3、718 - 725年,1981页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. f·施罗德和美国赫齐格,”的影响β₂肾上腺素能刺激大鼠l型Ca的单通道控制^{2 +}渠道,”美国Physiology-Heart和循环生理学杂志》上,卷276,不。3,H834-H843, 1999页。视图:谷歌学术搜索
27. y曼德尔,a . Weissman r .锡克et al .,“人类胚胎和诱导多功能干细胞心肌细胞表现出击败率变化和幂律的行为,”循环,卷125,不。7,883 - 893年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. Kolar g . h . Borchert m . Giggey f:, t . m . Wong p h . Backx和p v Escriba 2-hydroxyoleic酸影响心肌细胞(Ca^{2 +}]_我瞬变和收缩性全区道的方式。”美国Physiology-Heart和循环生理学杂志》上,卷294,不。4,H1948-H1955, 2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. g . j . Van der Vusse j . f . c . Glatz h·c·g·斯塔姆和r . s . Reneman”脂肪酸在常氧和缺血性心脏内稳态,”生理上的评论,卷72,不。4、881 - 940年,1992页。视图:谷歌学术搜索
30. m . Van Bilsen和g . j . Van der Vusse”Phospholipase-A₂心,端依赖信号”心血管研究,30卷,不。4、518 - 529年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. k·a·j·m·范德·李·m·m·Vork j . e . de Vries et al .,“长链脂肪酸段新生儿心脏细胞中基因表达的变化,“脂质研究期刊》的研究第41卷。。1,41-47,2000页。视图:谷歌学术搜索
32. m .毡帽,m . Komiyama和y岛田肌原纤维组装与vinculin,α辅肌动蛋白,细胞基质接触在胚胎心脏细胞在体外”,细胞活性和细胞骨架,12卷,不。4、185 - 194年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. l .雪、g·c·弗莱彻和a . m . Tolkovsky“线粒体是真核细胞中选择性地消除后还存在的封锁在细胞凋亡过程中,“当代生物学,11卷,不。5,361 - 365年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. z翁,C.-W。任香港、l . et al .,“简单、有效而且高效系统推导心室心肌细胞从人类多能干细胞,”干细胞与发展,23卷,不。14日,第1716 - 1704页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. j。傅,冲、d . k .代替et al .,“microRNA-1和-499室规范中截然不同的角色和功能成熟的人类胚胎干细胞心肌细胞,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。11日文章ID e27417, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. m . Snir Kehat, a Gepstein et al .,“评估人类胚胎干细胞心肌细胞的超微结构和增殖特性,”美国Physiology-Heart和循环生理学杂志》上,卷285,不。6,H2355-H2363, 2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. p.l.。郭,M.-A h·李。布雷et al .,“肌细胞形状调节横向注册中心的观察和收缩性,”美国病理学杂志》上,卷181,不。6,2030 - 2037年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. s . d . Lundy W.-Z。朱、m·雷尼埃和m . a . Laflamme”结构和功能成熟的心肌细胞来源于人类的多能干细胞,”干细胞与发展,22卷,不。14日,第2002 - 1991页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. s d鸟,p . a . Doevendans m·a·范Rooijen et al .,“成人心肌细胞表型,”心血管研究,卷。58岁的没有。2、423 - 434年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. j . Fujita n . Hemmi Tohyama, t·塞其y (k .福田,“实际应用共焦激光扫描显微镜的心脏再生医学”共焦激光Microscopy-Principles和应用在医学、生物学、食品科学第一章,n . Lagali Ed, InTech,里耶卡,克罗地亚,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. y (k . Matsumura m .佐et al .,”神经嵴干细胞迁移和分化成心肌梗死后心肌细胞,”动脉硬化、血栓和血管生物学没有,卷。31日。3、582 - 589年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. n . Hattan h .川口,k安藤et al .,“纯化心肌细胞从骨髓间充质干细胞产生稳定的小鼠心脏移植,”心血管研究,卷65,不。2、334 - 344年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. s . b . Khatau s魏仁芳d Hanjaya-Putra et al .,“LINC-mediated的微分形成细胞核周围的肌动蛋白帽在多能和体细胞,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。5篇文章ID e36689 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. n . j .塞维s . r . Coppen大肠杜邦,我。叶,Y.-S。Ko, t .松下“缝隙连接改变人类心脏疾病,”心血管研究,卷62,不。2、368 - 377年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. 答:奥,j . Weisser-Thomas诉Piacentino三世,s·r·豪斯,g . f . Tomaselli和b . O’rourke”transverse-axial小管系统的双光子激光扫描显微镜在人类心脏心室心肌细胞从失败和非故障,”心脏病学研究和实践ID 802373条,卷。2009年,9页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. d·j·谢里丹m·j·卡伦,m . j . Tynan”定性和定量观察超微结构的变化在猫心肌产后发展期间,“分子和细胞心脏病学杂志》上,11卷,不。IN21-IN28 11日,页。1173 - 1176年,1177 - 1181年,1979年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. r . Nassar m . c .芦苇丛生的,p·a·w·安德森”发育的超微结构的变化和肌节缩短分离兔心室肌细胞,”循环研究,卷61,不。3、465 - 483年,1987页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. j . j . Smolich a . m·沃克·g·r·坎贝尔和t·m·亚当森,“左、右心室心肌形态测量学在胎儿、新生儿,和成年绵羊,”美国Physiology-Heart和循环生理学杂志》上,卷257,不。1,H1-H9, 1989页。视图:谷歌学术搜索
49. 钟,d . k . Arrell r . s . Faustino a . Terzic和p . p . Dzeja“糖酵解网络重组的能量积分胚胎干细胞心脏分化,“分子和细胞心脏病学杂志》上,48卷,不。4、725 - 734年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. c·d·l·Folmes p p . Dzeja t·j·尼尔森和a . Terzic“线粒体在细胞命运的控制权,”循环研究,卷110,不。4、526 - 529年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. p . Mamczur d du, a . Dzugaj”Colocalization醛缩酶和FBPase心肌细胞的细胞质和细胞核,”细胞生物学国际没有,卷。31日。10日,1122 - 1130年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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