阿特拉斯的细胞动力学在斑马鱼成人肾脏再生

文摘

斑马鱼是一种有用的动物模型研究协调肾脏再生的信号通路,为肾肾元很简单,然而他们维持高等脊椎动物生物的生物内在复杂性,包括哺乳动物。最近的研究表明,政府的氨基糖苷类抗生素庆大霉素在斑马鱼模仿人类急性肾损伤(AKI)通过诱导肾元损伤,但关键的时间和细节表型事件相关的再生过程,尤其是在现有的肾单位,没有的特点。这里,我们绘制了时间的细胞和分子的变化发生在肾近端小管的上皮再生成年斑马鱼使用平台的组织和表达分析技术。这项工作建立了庆大霉素损伤后肾细胞死亡的时间,确定增生性隔间内肾、和文档基因表达变化与增殖细胞的再生反应有关。这些数据提供了一个重要的描述性的阿特拉斯,文档后接踵而来的一系列事件斑马鱼肾脏损害,因此主张科学界的一个宝贵的资源,可以方便的实现斑马鱼研究描述机制,控制肾再生。

1。介绍

脊椎动物肾脏功能单元组成的被称为肾元,这些上皮小管净化代谢废物通过血管的血液过滤尿液和随后的生产(1]。脊椎动物形式三个肾脏结构是由肾元在开发期间,称为前肾、中肾、后肾(1,2]。其中肾单位肾的守恒的特征形式跨不同陆生、水生脊椎动物是他们显示一个基本相似的区域组织以及他们的长度,包含一个肾小体,用来过滤血液,近端和远端小管部分专业执行离散任务在溶质重吸收和分泌,和收集管传输尿液的器官和修改盐和水的水平3,4]。

急性肾损伤)是一个毁灭性的而且通常致命的条件,肾元上皮细胞从缺血或毒素暴露被损坏,通常影响近端小管部分(5]。虽然有令人信服的证据从工作在各种鱼类和哺乳动物模型,脊椎动物肾单位肾小管上皮细胞可以强劲某些形式的阿基损伤后再生(6,7),还有一个贫穷的理解机制,调解这种再生反应,还有持续的争论关于起源的细胞(s),使肾脏再生在不同的物种2,8,9]。

斑马鱼,鲐鱼类,已经成为基因驯良的脊椎动物模型来研究肾相关的生物学和医疗条件如阿基,在胚胎和成年设置(10]。的斑马鱼胚胎肾脏功能前肾,由一对的分段肾元共享一个血液过滤器,每个包含两个近端和两个远端小管部分(11,12]。这种结构形式邮寄1天受精(dpf)和血液过滤开始约2 dpf (13,14),因此献出一快速和解剖学上简单的系统研究肾元模式(15- - - - - -18),识别关键基因(11- - - - - -13,19],tubulogenesis [20.,21),和生理学和疾病建模(22- - - - - -26]。相比之下,成年斑马鱼肾脏,或中肾,是一个相对平坦的器官在身体背墙,由双边对称的特征区域称为头(或前),躯干(或内侧),尾(或后(图)1(一))27]。中肾开始形成约12至14 dpf,与现有的进步增加肾元前肾双(28]。在斑马鱼的寿命,中肾继续积累nephrons-a现象与持续的成人增长(以尖到尾长度的动物)和相关的增加排泄的要求(28]。在典型的斑马鱼成人在大约6个月的年龄,据估计,这中肾肾拥有大约450个肾元,肾元的最密集的网站的头部和躯干28]。成人肾元前肾中有相似的部分,但还算分组在支安排(图1(一))29日],它像其他鱼类没有显示肾元的普通取向在哺乳动物的皮质和髓质后肾的肾(6]。斑马鱼中肾肾元通常共享远端小管段(图1(一))和流入的主要收集管道跨器官的长度(10,29日]。组成的基质细胞中肾肾元之间的点缀,是成人造血作用,还包含一个耐人寻味的民众间充质肾祖细胞(10,28,29日]。这些肾源祖细胞提供一个持续的过程中产生的新肾元称为肾元再生或neonephrogenesis,这发生在上述过程中肾中肾时开发和自然生长在应对老龄化的增加生物量鱼(10,28,29日]。

总的来说,斑马鱼的复杂性中肾肾肾生物学研究提供了一个有用的成人设置和显示了识别承诺肾再生反应的基因成分,可以补充传统的AKI哺乳动物模型研究老鼠和老鼠等(10]。迄今为止,肾脏再生范式在成年斑马鱼包括肾毒素管理、专门的氨基糖苷类抗生素庆大霉素引起广泛的肾元小管损伤(10,28,29日),以及创建工程的几种转基因菌株诱导烧蚀的上皮细胞在肾元血液过滤器(30.,31日]。在前者,先前的研究已经表明,两大事件发生在成年斑马鱼gentamicin-induced安琪后肾脏器官:(1)neonephrogenesis,或生产新肾元由于上述基质肾祖细胞的激活,这是被组织学外观的基础上嗜碱性的肾元单位(10,28,29日),(2)部分功能恢复现有的肾元4天左右后损伤(dpi),暗示,受损的肾元小管上皮快速复苏,而从化学侮辱29日]。尽管这些观察,准确时间序列的分子事件,发生在阿基在斑马鱼肾元,包括细胞死亡和扩散,已收到审查相对较少。一些基因表达的改变已经注释在之前的工作中,如瞬态废除记录编码slc20a1a(29日],sodium-dependent磷酸盐转运蛋白通常是局部的近端小管上皮细胞,但进一步观测量是相当有限的。

描述的一个重要障碍向追求肾脏在斑马鱼再生方面的缺乏组织学和其他分子标记方法为使用在这个模型中有机体。最近,我们已经调整了很多技术来照亮肾脏结构,现在可以利用32]。例如,我们证明了各种近端小管部分可以通过凝集素染色的独特组合,右旋糖酐吸收,碱性磷酸酶(美联社)反应(图1(一))32]。进一步,远端小管的标签有不同的凝集素(图1(一))32]。

这里,获得更详细的了解再生事件与斑马鱼肾损伤和细胞识别属性使小管部分的划分,我们进行了广泛的组织学和免疫荧光研究序列注释后的组织变化,结果庆大霉素肾毒性。对于这个工作,我们使用和/或修改几个传统组织学协议使用斑马鱼肾组织和也实施了一些我们最近开发的肾元标记方法(32]。用这些工具,我们现在第一次证明gentamicin-induced安琪后,肾元近端小管上皮再生收益在大约一个星期。我们已经记录了详细的细胞死亡和扩散在近端小管在这个区间内。通过额外的结构和功能分析,我们表明,整个post-AKI斑马鱼肾近端小管重获14和21 dpi之间的吸收能力。此外,我们表明,neonephrogenesis发生在肾元上皮再生的部分重叠的时间框架,开始5 dpi和进步在随后的两个星期,和表明再生人口在现有的和新的肾单位肾转录因子处于Pax2表达。综上所述,这些描述性的和功能的研究提供一个基本的基础为未来的工作旨在阐明机制,调节肾脏再生后阿基在成年斑马鱼。

2。结果

氨基糖苷类抗生素庆大霉素是一个已经被用于模型的建立肾毒素阿基诱导肾小管损伤的成年斑马鱼(10,28,29日),以及其他鱼类,如金鱼和青鳉6,33]。在后者的研究中,后肾元表型的组织学庆大霉素政府记录,包括评估的细胞增殖等措施检测增殖细胞核抗原(PCNA)标签和5-bromo的公司,2′脱氧尿苷(BrdU) [6,33]。先前的研究在斑马鱼记录的外观gentamicin-damaged肾元1 dpi和整合BrdU在不成熟的肾元(29日),但细胞的顺序改变gentamicin-damaged肾元随时间尚未确定。检查和记录这种细胞的变化,我们首先采用组织学方法,使肾脏结构的特征(图1),然后利用这些和其他方法来探索空间和时间序列的近端小管细胞死亡和扩散(数字2- - - - - -8)。

2.1。组织学上区分肾结构

成年斑马鱼肾脏的肾元由pinwheel-like安排几个肾元连接到单个支远端小管流入集尿管(图1(一))10,29日,32]。苏木精和伊红染色())是一个基本方法,区分的近端小管远端小管部分基于刷状缘的存在:近端小管具有刷状缘,而远端小管不(34]。刷状缘,发现腔的一侧的近端小管上皮细胞,排列密集的微绒毛,形成表面细胞的表面积大大增加,促进他们的重吸收功能。当石蜡切片的肾脏健康的成年斑马鱼是沾染了他走时,厚厚的粉底刷状缘是著名的彩色带在深粉红色的顶端彩色近端小管细胞,显示细长的形状特点,并形成了一个扩张腔(图1(b))。相比之下,远端小管细胞有一个狭窄的腔和沾了浅粉红色的色调,让段身份的明确的区分(图1(b))。在健康的成年小鼠肾脏)染色显示一个类似的染色结果(图1(b))。

周期性acid-Schiff (PAS)染色法用于检测组织中的多糖,和试剂染色有亲和力的刷状缘哺乳动物近端小管(35]。成年斑马鱼肾脏切片沾,显示,与小鼠肾脏的肾元拥有众多特色守恒(图1(c))。即斑马鱼近端小管明显是他们刷边界染色很深沉的红色,细胞胞浆深粉红色(图1(c))。肾小球毛细血管基底膜的循环和管状上皮也沾染了一个类似的深沉的红色,而远端小管上皮细胞的染色淡粉色的颜色(图1(c))。

乌洛托品银染色可以检测蛋白质和被记录作为基底膜在哺乳动物的标志36,37]。应用这一污点斑马鱼肾脏组织石蜡切片,小管和肾小球基底膜的可视化的深棕色的色调,和近端小管的刷边界也染色深棕色(图1(d))。此外,银染色显示透明水滴在近端小管的存在,这也被记录在哺乳动物(38]。

2.2。小管和管隔间可以进一步区分与标识方法利用凝集素、肌球蛋白VI表达式,与精灵- 97碱性磷酸酶活性

凝集素的多发地起源sugar-binding蛋白质表达在自然(39]。特别是在肾脏器官,Lotus tetragonolobus植物血凝素(LTL)标志着近端小管,和的目标白biflorus凝集素(DBA)包括远端小管和收集管道(39]。先前的研究要求的能力区分近端和远端小管和量化这种结构在老鼠身上有利用LTL DBA染色和巨大的成功39- - - - - -42]。同样,青鳉鱼的管状部分的识别模型,多囊肾疾病,LTL用作近端小管标记,DBA作为远端小管标记(43]。组织cryosections斑马鱼成人肾脏受到染色LTL和DBA(数字1(e) -1(我)),以及整个山染色(数据没有显示)。绑定在斑马鱼凝集素的特异性是守恒的,需要和DBA标签不同的小管(数字1(e)和1(f)、职责),这些标签既相互排斥在cryosection(图1(h)),在整个准备工作(数据未显示)32]。有趣的是,斑马鱼肾脏的主要收集管道,这是一双大排水管道,延长整个器官的长度(28),通过colabeling LTL和杰出的抗体来检测肌凝蛋白VI(图1(g))。这是唯一标识为每个斑马鱼肾只包含两个结构,一个在每个对称的器官(数据未显示)。

近端小管具有刷状缘,荧光技术方法被称为精灵——97年(酶标记荧光)被用来确定这个活动可以在成年斑马鱼本地化肾脏。刷边界已知的肠上皮细胞表达高水平的内生碱性磷酸酶活性(44]。此前的一项研究报道精灵- 97成年斑马鱼肾脏反应,表明精灵- 97染色可能是一个可行的方法标签近端小管细胞(45]。肾脏组织cryosections成年斑马鱼沾精灵- 97磷酸酶与远端小管复染色标记DBA。精灵- 97信号局部近端小管,具有非常突出的微绒毛刷边界项目进入小管腔(图1(我),(数据未显示)32]。相比之下,发现小管DBA完全缺乏任何精灵- 97沉淀(图1(我),数据未显示),这些观察结果也证实在整个肾制剂(数据未显示)32]。这些观察结果一致与脊椎动物肾单位的知识远端部分不具备刷状缘,因此不会沾染了精灵- 97 (4,46]。

2.3。庆大霉素损伤的组织学特征时间

接下来,我们利用这些不同组织学工具来分析斑马鱼的表现型肾元阿基。的腹腔内注射庆大霉素管理导致成年斑马鱼阿基,基于先前建立剂量(28,29日,47]。注入的鱼被牺牲在几个时间点,他们的肾脏固定,切片,然后沾)(图2(一个))。1 dpi,足够的肾元损伤引起,导致剥蚀基底膜和大量的管腔内的细胞碎片。近端肾小管上皮细胞已经成为有液泡的和大规模的混乱是显而易见的。在3 dpi细胞破坏仍然是明显的,但在管状空间,细胞间质结构聚集。5 dpi,细胞内小管更有组织,出现的视觉上完整的单层细胞的腔的开口。此外,少数嗜碱性的,深紫色细胞集群的出现,这是一个特征的neonephrogenesis鱼(6]。7 dpi,大量的嗜碱细胞聚集形成,一些包含腔,多数细胞碎片清除。管腔继续形成聚集在7点10 dpi和流明明显dpi已经扩大。此外,粉色小管细胞显示类似于近端和远端小管。14 dpi,许多聚合物具有明显刷边界,表明近端部分,肾组织整体是没有受伤的类似于成年鱼。肾组织染色在21 dpi透露类似的野生型的外表不存在细胞聚集。

完成第二个组织学分析斑马鱼肾脏PAS染色(图2 (b))。不使用,因为染色强调刷边界的近端小管更有效地比),因此我们假设这个染色法可以提供额外的洞察建立再生近端小管上皮的性格。1 dpi,外观PAS-positive管腔内的细胞碎片容易观察到远端小管,观察到在他走时彩色样本。有趣的是,透明投以前被记录下来作为PAS-positive其他脊椎动物的肾脏受伤48]。因此,这表明,腔内细胞碎片是细胞死亡的结果和随后的脱落的肾小管区域内位于上游的远端部分,大概是近端地区本地化。肾组织在3、5、7 dpi大致接近先前描述的组织)的时间。有趣的是,黑红色衬里被发现在许多小管,只有细微的流明,暗示他们公认的新再生近端小管。10 dpi,大量聚集,形成了具有PAS-positive刷状缘,14 dpi,肾脏组织区别野生型组织。再次,21 dpi组织染色显示没有细胞聚集体,表明neonephrogenesis的再生过程已经完成。有趣的是,嗜碱细胞聚集的位置出现在组织学时间课程密切并列肾元小管(图2)。在之后的时间点,(例如,7 - 10 dpi),每个聚合与管道相关事件变成一个先前存在的近端小管基于PAS反应,虽然这些事件被检测到早在5 dpi时间点(图2数据未显示)。此外,骨料本身显示PAS反应性的特点,与黑红色的顶端染色(图2数据未显示)。这嗜碱骨料的染色特征表明,很大程度上是有趣的概念,新的肾元拥有近端自然。

2.4。slc20a1a表达时间在受伤的肾脏

溶质转运体slc20a1a,这标志着近曲小管(PCT)段在成人肾元(图1(一))以及胚胎,被用作标记的近端小管部分肾毒素损伤后斑马鱼(29日]。关联这个基因的时空变化与组织学时间课程,gentamicin-injected斑马鱼肾脏检查使用原位杂交与slc20a1a(图3)。在1 dpi, gentamicin-induced肾元损失是灾难性的slc20a1a转录表达完全废除(图3(一个)),与之前的观察一致(29日]。一小部分的外观slc20a1a +细胞聚集在3 dpi (),其次是大幅增加在这个数字5 dpi ()和7 dpi ()(数据3(一个)和3 (b))。小螺旋结构第一次出现在5 dpi (),被众多的整个肾脏7 dpi ()(数据3(一个)和3 (b))。大量的总量也持续7至10 dpi;然而,拒绝更多的线圈数量出现(图3(一个)数据未显示)。此外,段结构的出现,并密切拟表型受伤PCT段,出现在7 dpi,发病率每个肾脏结构(数据3(一个)和3 (b))。在14 dpi,slc20a1a表达类似于野生型的成人肾脏,与大多数结构彩色像段(图3(一个))。进一步分析这些观察,我们进行了方差分析统计分析比较聚集的数量,线圈,和部分,显示,有一个显著增加聚合3至7 dpi,伴随着出现的线圈在5和7 dpi和部分,也是重要的(图3 (c))。这表明在整个时间段nephrotoxicant受伤后,新肾元首先表现为小细胞聚集,最终线圈和拉长到健康、正常功能肾单位,符合定性观察嗜碱骨料和线圈的肾元形成的组织学以及以前的观测数据(28,29日]。线圈的民众和部分可能还包括现有的肾单位的人口,使受损的近端小管上皮细胞再生,最有可能从5 dpi开始时间点。然而,还需要更多的研究来区分新肾元表达slc20a1a从现有的肾元,管状再生。

2.5。在肾脏再生细胞死亡和扩散

TUNEL方法为核DNA碎片是一个有用的和特定的标签(49),这是一个签名的细胞凋亡。之前阿基与庆大霉素在斑马鱼的研究还未检查的时机和位置肾元小管细胞死亡,尽管这个代理是众所周知的破坏肾近端小管细胞。直接确认并评估是否细胞死亡发生在其他小管部分,我们实现了一个结合TUNEL和LTL标签本地化何时何地细胞死亡发生在近端小管相对于其他片段庆大霉素后曝光。而受伤的肾脏表现出非常低水平的TUNEL-positive细胞(0.95%±0.43%),TUNEL反应在管状的细胞核急剧升级,特别是在LTL-positive近端小管1和3 dpi(数字4(一)和4 (b))。1 dpi, 28.78%±1.12%的细胞LTL-positive近端小管TUNEL-positive,爬到一个44.11%±6.03%的发病率近端小管细胞3 dpi(数据4(一)和4 (b))。通过5 dpi,只有7.82%±1.05%的近端小管细胞TUNEL-positive(数字4(一)和4 (b))。注射后7和10天,TUNEL-positive近端小管细胞水平进一步下降,回到大约基底的水平成立于肾脏,未经处理的数据4(一)和4 (b))。TUNEL反应的快速高度从1到3 dpi之后快速下降在3 - 10 dpi是统计学意义(图4 (b))。肾小管,LTL-negative没有发现TUNEL-positive(数据没有显示)。类似的趋势也发生在进行独立研究,TUNEL染色结合精灵- 97把近端小管(数据没有显示)。总的来说,这些数据表明,细胞死亡主要发生在近端小管的波状,这山峰大约在3 dpi。

接下来,我们评估后细胞增殖动力学的庆大霉素接触使用PCNA标记(图5)。PCNA在不同浓度在细胞在细胞周期和最大数量在S期(50]。与细胞死亡的分析,使用LTL标签结合使用抗体检测PCNA允许考试相比,肾元近端小管细胞增殖的肾小管和导管的其余部分。在基底的水平在治疗肾脏,0.97%±0.21%的细胞被积极LTL-positive近端小管(数字5(一个)和5 (b))。在1 dpi,没有发现细胞增殖细胞核抗原(表达数据5(一个)和5 (b))。然而,通过3 dpi, 28.6%±1.69%的LTL-positive管状细胞PCNA阳性(数字5(一个)和5 (b))。PCNA阳性细胞的百分比在近端小管损伤后5天达到高峰,达到60.9%±2.16%的近端小管细胞。这个发病率下降24.1%±0.51% 7 dpi然后进一步10 dpi 1.74%±0.39%。PCNA染色也完成了近端小管标记结合精灵- 97,显示肾元上皮再生,类似的动力学扩散的3、5、7 dpi(数据没有显示)。

有趣的是,高水平的PCNA在neonephrogenic观察肾脏结构在此期间课程(图5 (c))。开始在3 dpi聚合形成时,强烈的PCNA表达被发现在整个结构colocalizing DAPI-stained核(图5 (c))。5和7 dpi,当聚合形成了流明和转变成coil-like neonephrons,高水平的PCNA仍呈现(图5 (c))。在10 dpi, PCNA继续在这些neonephrogenic结构丰富,现在有一个刷状缘LTL(图呈阳性5 (c))。根据这些观察,这看起来就像是强烈彩色PCNA-positive neonephron结构已成为近端小管。然而,基因命运映射需要明确跟踪这些结构的恶化和标签有近端命运。

作为另一个衡量评估细胞增殖,我们执行BrdU脉冲追踪实验在斑马鱼gentamicin-induced阿基(图6)。这次考试的腹腔内注射BrdU被管理的斑马鱼和gentamicin-injected斑马鱼24小时前5天课程每个时间点进行分析,然后和肾脏被分析了免疫荧光检测BrdU-positive近端小管细胞标以LTL(图6)。在受伤的肾脏,我们发现1.25%±0.32%的近端小管细胞整合BrdU标记(数字6(一)和6 (b))。庆大霉素注射后,在1、2和3 dpi的发病率低BrdU合并(0.44%±0.19%;0.42%±0.18%;0.83%±0.37%,resp。)(数据6(一)和6 (b))。然而,在4和5 dpi BrdU-positive LTL-stained近端小管细胞的发生率增加到5.09%±1.16%和7.42%±1.73%,分别为(数字6(一)和6 (b))。而方差分析统计分析未能显示BrdU公司显著的增加,总体趋势再生BrdU公司随着时间升高的近端小管与增殖细胞核抗原结合的观察是一致的(图5)。综上所述,这些数据表明,在近端小管再生增殖发生在伤后第一个星期。

2.6。恢复额外的近端小管结构特性和吸收功能Gentamicin-Induced AKI

进一步形象化gentamicin-induced损伤后近端小管结构的再生和评估近端小管的恢复生理功能,我们利用碱性磷酸酶染色和右旋糖酐吸收化验,分别为(32]。在整个肾脏山准备,这些分析使三维评估肾元在整个器官(图7)[32]。标签的碱性磷酸酶活性与精灵- 97特别使整个近端小管的可视化,PCT和PST段,连接和区分直径,独特的宽与窄的PCT在PST(图的直径7(一))[32]。在1和3 dpi,碱性磷酸酶活性降低和分散在整个肾脏,很少有PCT(图结构明显7(一))。5点dpi和7 dpi,小管明显与碱性磷酸酶标记,但宽PCT-like小管很少观察(图7(一))。14 dpi,有一个清晰的恢复PCT-PST结构与碱性磷酸酶活性(图标记7(一))。

在平行,我们研究了肾的荧光标记右旋糖酐,半个一个试验,确定PCT上皮细胞能够内吞作用[32]。的肾小管表现PCT-specific吸收fluoro-ruby右旋糖酐或荧光素葡聚糖,而这个属性是废除庆大霉素损伤后1和3 dpi(图7 (b);数据未显示)。5 dpi和19 dpi, PCT fluoro-ruby吸收或荧光素葡聚糖是零星的,只有少数肾元小管标记检测,直到21 dpi的时间点是PCT吸收在整个器官的肾元(图一致7 (b)数据未显示)。这表明,PCT的再生功能需要三个星期,尽管在两周肾元小管出现由碱性磷酸酶标记(图结构完好无损7(一)(图)和其他组织方法2)。

2.7。处于Pax2表达标志着再生管状上皮细胞和Neonephrogenic结构

nephrogenesis由特定基因控制的过程中,可以增强或抑制细胞生存和直接后续增殖和分化事件(51,52]。一个这样的基因我们转录因子。在开发过程中,当肾细胞经历上皮间充质转变成浓缩细胞聚集和分化成肾元小管,他们表达我们的水平增加;后来在nephrogenesis,转录因子表达下调(53- - - - - -55]。为了恢复器官或组织功能在成年动物接受物理伤害或伤害,有人建议,再生过程可以概括特定的发育过程(56,57]。符合这个概念,先前的研究已经表明,我们reexpressed肾元管状细胞在成年小鼠(阿基58)以及在斑马鱼胚胎肾元后续gentamicin-induced阿基(59]。

为了测试的假设发育基因在再生期间reexpressed事件和探索斑马鱼成人肾元是否同样显示管处于Pax2表达阿基后,抗体在成年斑马鱼我们用于immunolabeling损伤和修理时间(图8)。分析处于Pax2表达受伤的肾脏透露,这种发育转录因子表达在上皮小管在低水平的肾元小管和管状细胞更强烈的表达在多个时间点超过两周时间跨度受伤后(图8(一个))。值得注意的是,我们的表达水平更高在场dpi(图5 - 78(一个))。低水平仍可检测修复小管的14 dpi,与未经治疗的肾脏(图8)。

此外,类似于neonephrogenic PCNA表达模式结构,处于Pax2表达高水平的细胞盘绕的身体和其他5和10 dpi neonephrogenesis结构,分别为(图8 (b))。包含Pax2-positive的小管细胞区别neonephrogenic结构基于腔直径。小管,进行修复具有较大的腔,代表一个小管,以前建立和肾脏功能。相比之下,流明的neonephrons非常小,似乎在时间扩张,这是记录在这一次的课程。综上所述,这些数据表明,表达我们伴随近端小管上皮的再生以及neonephrogenesis斑马鱼的肾脏。

3所示。讨论

到目前为止,三种模式的肾脏再生的特点暴露肾毒素或机械损伤:(1)管状上皮再生,在现有的肾元添满细胞被摧毁后,(2)补充肾脏肥大,剩下的肾脏结构扩大,通常观察单侧肾切除术后,和(3)肾元从肾间质祖/干细胞再生60]。脊椎动物不同的关于他们是否能执行一些或所有这三个壮举6,60]。例如,人类和其他哺乳动物不能开发新的肾元妊娠或新生儿期后,一个特性已知的与肾有关干细胞疲惫后肾中个体发生(52,61年- - - - - -67年]。相比之下,鱼类和两栖动物有多才多艺的再生特性在青少年以及成年阶段,包括全新的肾元的形成(10]。而各种鱼类,包括金鱼,青鳉,滑冰,鲑鱼,罗非鱼,蟾鱼,可以接受肾脏再生(33,68年- - - - - -71年),斑马鱼提供了一个优势发现途径和信号事件参与肾脏再生由于其遗传温顺。之前进行传统使用斑马鱼基因或化学屏幕识别组件的演员肾再生,但是,它是至关重要的有一个透彻的了解组织的发展变化,毒物暴露后显露出来。

在这里,我们进一步细胞和基因表达的时空序列变化特征与斑马鱼肾单位肾小管上皮细胞的再生和neonephrogenesis还带注释的一些特性。总之,我们的工作显示,受伤的肾元小管上皮再生一周内的损伤,包括部分重叠的细胞死亡和扩散波伴随着处于Pax2表达(图9)。再生的功能肾单位随后恢复2到3周后损伤。与之前的研究结果相一致,我们发现neonephrogenesis开始了大约5 dpi,与肾元集群形成新的肾元在随后一周,并显示新肾元首次拥有PAS反应(图的近端小管功能9)。而这表明新肾元近端字符,遗传的命运需要映射的研究来确定功能段(s)新肾元来拥有。鉴于高度支化的性质在斑马鱼中肾肾单位安排,一般是一个有吸引力的假设新的肾元垂直进入先前存在的近端部分,从而增加了过滤和大部分肾脏的重吸收功能,充分利用现有的远端和收集管系统微调盐分平衡的尿流。

3.1。工具包斑马鱼细胞和分子肾研究

这些研究提供一个新的、重要的描述性的阿特拉斯时发生的移动变化,斑马鱼成人肾脏再生。此外,在这些研究我们的追求精致的组织学方法应用在成年斑马鱼肾脏。在一起,这组信息和方法为进一步的研究提供一个资源在这个有前途的再生模型。三个组织学染色已经证明是有价值的包括他走时污点,PAS染色和银染色。)的染色不同的近端小管远端小管本质上基于刷状缘的存在(近端小管的一个明显特征)。PAS染色亲和力高的试剂刷边界的近端小管和允许更有效的肾组织内不同结构的表征。银染色也污渍刷边界明显的暗棕色,允许从远端小管的区别。值得注意的是,银染色也标签透明水滴形成的蛋白质重吸收,特别是位于近端小管。利用凝集素染色区分小管隔间基于sugar-binding蛋白质在这部小说工具包也起着至关重要的作用。LTL是一个健壮的近端小管标记,标记刷边界的小管; DBA is a marker for the distal tubules. Finally, the ELF-97 staining method, which detects high levels of endogenous alkaline phosphatase activity in brush borders, is a consistent technique to differentiate the proximal tubules from the distal tubules. A major limitation of working with these and other markers noted above involves incompatibilities with kidney tissue fixation requirements. We have found the most success in zebrafish renal histology procedures by fixing the organ in two different ways: fixation in paraformaldehyde (with or without antigen retrieval prior to immunolabeling) or ethanolic formaldehyde. These methodologies should prove to be useful to further study renal regeneration in the adult kidney, as well as established and emerging models of embryonic nephron injury and regeneration [22,59,72年- - - - - -75年]。然而,并非所有的标记工作与固定液结合immunofluorescent抗体,在斑马鱼和电流限制系统是商用抗体的不足。未来的工作将最有可能通过考试基因表达的额外好处原位杂交研究在整个或部分(32]。这些方法使基因转录的时空定位,这对任何感兴趣的基因(s)是可行的因为斑马鱼基因组测序和基因表达研究适当的试剂是商用。

3.2。干细胞和他们的角色在斑马鱼成人肾脏再生

在各种哺乳动物的研究已经证明intratubular扩散发生在健康肾单位小管(76年- - - - - -78年]。同样在目前的工作中,我们已经记录了一个扩散的低水平的斑马鱼近端小管增殖细胞核抗原反应性和基于BrdU合并在LTL +肾元细胞。鼠标命运映射研究已清楚地表明,intratubular肾单位数量补充受伤的肾元(79年,80年]。然而,这些再生细胞的性质在哺乳动物肾小管受损仍然是一个激烈争论的话题。目前,存在着两种假设,描述这个intratubular细胞来源的细胞属性。一个场景涉及到去分化的上皮细胞迁移和增殖修复受伤的小管。第二个场景假定干细胞/祖细胞位于小管进行分裂和放大,以应对组织损伤。哺乳动物模型当中有实验证据支持鼠标支持去分化models-fate映射研究[8),同时也有反对的证据从人类肾脏研究独特的亚种群的肾细胞特征暗示干细胞字符位于肾元中上皮细胞,而这些细胞燃料管再生(9]。是否有差异在哺乳动物或额外的研究是否会最终调和这些矛盾的数据仍然是一个迷人的当前肾脏学的研究领域。

这样,未来的肾再生研究的一个重要方面对斑马鱼模型将澄清的起源修复上皮细胞在现有肾元通过转基因遗传命运映射。这样的血统分析至关重要评估修理小管细胞的起源。进一步,因为肾细胞可以通过流式细胞仪分离,然后通过移植过程操作测试(81年),在活的有机体内实验测试的复制和分化潜力的intratubular干/祖细胞在斑马鱼,如果他们确定,可能会变得可行。

3.3。复杂性和福利比较斑马鱼和哺乳动物

最终,斑马鱼肾脏的程度是“独特”高等脊椎动物,包括哺乳动物,是一个重要的生物学问题的理解。例如,斑马鱼的网站是成人肾间质hematopoiesis-thus斑马鱼肾脏中的微环境可以说是截然不同的哺乳动物血液生产其他随之而来的同行。研究揭示这些或其他差异以及它们如何影响肾再生能力可能提供重要的见解的方法可以用来刺激相似的修复反应治疗肾损伤和疾病或协助设计重组策略(82年- - - - - -84年]。本文提供的数据为研究者提供有价值的基础,旨在从事这种基因和细胞研究确定的身份分子和信号通路激活和调节肾在斑马鱼再生。

4所示。实验程序

4.1。斑马鱼应变和维护

成年斑马鱼的图宾根野生型菌株生长和维持在28.5°C 14小时光:10小时黑暗周期平均亮度200勒克斯(85年]在斑马鱼研究中心巴黎圣母院Freimann生命科学中心。批准的协议都是IACUC圣母大学的,动物协议13 - 021和16 - 025。

4.2。注射庆大霉素和肾脏解剖

注射庆大霉素,斑马鱼三卡因麻醉稀释工作解决方案的0.02%,由0.2%三卡因pH值7.0股大约2 - 3分钟,转移到一个注塑模具。鱼收到2.5毫克/毫升的腹腔内注射庆大霉素,回到一个干净的系统。在不同的时间点,成年人与过量的安乐死三卡因和固定用4%多聚甲醛/ 1 x PBS / 0.1%二甲亚砜(DMSO)或9:1 ethanolic甲醛(100%乙醇:37%甲醛)。肾脏的成年鱼切割如前所述[27,32]。短暂的,鱼是安乐死0.2%三卡因pH值7.0约5分钟。解剖针是用来销打开身体墙安装在解剖盘含有4%多聚甲醛/ 1 x PBS / 0.1% DMSO溶液。一夜之间,样品被固定在4°C。第二天,托盘和细的固定剂被钳是用来分离的肾脏背墙。

4.3。整个山原位杂交

整个山原位杂交(希望)成人肾脏进行如前所述[27,32]。短暂,肾脏被固定在4%多聚甲醛/ 1 x PBS / 0.1% DMSO和色素在过氧化氢处理的摘除了子宫。肾脏接受透化作用和杂交步骤在70°C调湿室过夜。样本然后孵化阻断缓冲区在室温下(10%牛血清白蛋白和5%胎牛血清)和广泛的洗后,digoxigenin-labeled探针与碱性磷酸酶检测共轭antidigoxigenin抗体。电视台/ BCIP (Sigma-Aldrich)担任紫色的酶底物的反应。颜色反应和4%多聚甲醛/ 1 x PBS停止。

4.4。组织Cryosections

如前所述(32),成年鱼是固定在4%多聚甲醛/ 1 x PBS / 0.1% DMSO溶液或9:1 ethanolic:甲醛一夜之间在4°C,第二天和肾脏被切割。样本用5%蔗糖/ 1 x PBS, cryoprotected在30%蔗糖/ 1 x PBS一夜之间在4°C,并且随后洗1:1组织冷冻剂(TFM、三角生物医学科学):30%蔗糖/ 1 x PBS一夜之间在4°C。第二天,TFM样本嵌入到100%。串行的部分大约12 - 14μ米厚度横向穿过整个肾脏。冷冻cryosections被安装到显微镜玻片(380年TruBond显微镜载玻片,Tru科学)和允许风干1小时50°C。幻灯片是储存在−80°C到使用。

4.5。组织学分析

组织学染色,成年鱼安乐死在不同时间点的过量三卡因和固定在4%多聚甲醛/ 1 x PBS / 0.1% DMSO溶液。肾脏解剖了,洗在4°C 70%乙醇,然后是石蜡包埋,连续切片机切片。幻灯片是deparaffinized和水化后,部分被苏木精和伊红染色,周期性acid-Schiff或乌洛托品银(巴黎圣母院集成成像Facility-Histology核心)。老鼠肾脏部分(一个慷慨的礼物从巴黎圣母院组织学核心)治疗相同的组织学协议。

4.6。BrdU合并

细胞增殖是通过BrdU公司化验的。成年斑马鱼在0.02%三卡因麻醉pH值7.0和腹腔注射5毫米BrdU(分子探针)牺牲前24小时。细胞结合BrdU受到免疫荧光分析的可视化。

4.7。免疫荧光

幻灯片是解冻30分钟在1 x 50°C,然后制成冻干Tween-20 PBS / 0.05%。Cryosections在阻止溶液在室温下孵化Tween-20/10% 1 x PBS / 0.05%胎牛血清/ 1% DMSO 2小时,然后放置在4°C的过夜主要抗体孵化。主要抗体稀释在块,包括鼠标反对环保荧光蛋白单克隆抗体(1:500;Sigma-Aldrich),兔子anti-Pax2多克隆抗体(1:50;Covance)、兔anti-myosin VI抗体(1:50;Sigma-Aldrich),鼠标anti-BrdU (1: 50;分子探针),和鼠标anti-proliferating细胞核抗原(PCNA)多克隆抗体(1:1000;Sigma-Aldrich)。主要抗体孵育后,cryosections Tween-20洗1 x PBS / 0.05%和孵化在二级抗体溶液在室温下2小时。二次抗体稀释1:500年1 x Tween-20 PBS / 0.05%,包括488年和568年Alexa萤石山羊anti-mouse免疫球蛋白和594只山羊anti-rabbit免疫球蛋白(分子探针)。 Nuclei were labeled with DAPI (Molecular Probes) for 5 minutes. Cryosections were washed with 1X PBS and mounted with Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories). Antigen retrieval was performed by incubating slides between 95°C and 100°C for 40 minutes in preheated 10 mM sodium citrate buffer for Pax2 and PCNA labeling or by incubating cryosections with 2 M HCl at 37°C for 30 minutes for BrdU labeling. Sections were then washed and immunolabeled as described above.

4.8。脾小管部分的识别

管状部分肾脏被确定使用以下标记:荧光素Lotus tetragonolobus植物血凝素(LTL、向量实验室)稀释1:100年1 x PBS 2小时标签近端小管;酶标记荧光-(精灵)97(分子探针)稀释1:20检测缓冲区(包含在工具包)1小时标签近端小管;若丹明白biflorus向量实验室凝集素(DBA)稀释1:100年1 x PBS 2小时把远端小管(32]。如果colabeling抗体,需要和/或DBA污渍二级抗体孵育后直接应用。DAPI immunolabeling LTL和/或DBA如上所述。精灵- 97 colabeling [32),底物的解决方案是二级抗体后直接应用的解决方案。反应停止了EDTA清洗缓冲1 x PBS / 25毫米/ 5毫米levamisol pH值8.0,孵化cryosections新鲜缓冲3 * 15分钟,然后在精灵可视化- 97安装介质。

4.9。整个山肾脏形态学分析

4.9.1。右旋糖酐标签

整个标签肾近端小管曲部段的山又如前所述[32]。简而言之,成年斑马鱼是麻醉和腹腔内注射50毫克/毫升fluoro-ruby右旋糖酐(表达载体),回到一个干净的系统。第二天,鱼被牺牲和肾脏解剖荧光小管可视化。

4.9.2。精灵- 97标签

整个山标签pan-proximal段进行如前所述[32]。短暂,肾脏受到固定、解剖透化作用,色素沉淀去除。肾脏被封锁,然后精灵- 97年孵化基质溶液30分钟。反应停止后,多个进行耐洗和荧光近端部分可视化。

4.9.3。需要和DBA标签

整个山标签pan-distal段的肾脏进行如前所述[32]。总之,肾脏是固定的,被解剖,permeabilized和色素。阻塞后,肾脏被孵化的各自的染色方案。一旦染色的解决方案是与几个洗,可以可视化荧光信号(s)。

4.10。TUNEL分析

凋亡细胞与TUNEL检测识别,使用ApoAlert DNA碎片分析工具包(Clontech实验室)和tac 2 dt显影剂工具包(Trevigen)。成年斑马鱼是固定在9:1乙醇甲醛及其他们的肾脏解剖,嵌入式,cryosectioned如前所述。Cryosections解冻在50°C 1小时,permeabilized 1 x PBS 20分钟,0.1%柠檬酸钠缓冲/ 0.1% Triton x - 100 2分钟,再用1 x PBS在室温下5分钟。平衡缓冲直接用于cryosections 10分钟,其次是添加生物素化的核苷酸和dt酶(在一个浓度1:50平衡缓冲)2小时37°C。标签的反应被终止孵化cryosections 2 x SSC停止缓冲15分钟。积极核可视化运用Alexa萤石568链霉亲和素稀释1 x PBS(1: 200年,分子探针)1小时。

4.11。统计分析

统计学意义分析了实验人群使用单向方差分析之后,使用R版本3.0.3图基HSD多个对比测试。数据显示意味着±SEM。意义是接受或更高版本。

重要发现

(我)一套组织学染色特点是提供工具来识别斑马鱼成人肾脏解剖结构特点,包括肾元近端小管特征。(2)细胞死亡和受伤的近端小管的扩散动态和连续波活动发生损伤后的第一周,而功能性修复发生在随后几周。(3)时空的免疫荧光研究显示,我们表达在上皮再生肾元人口和neonephrogenic集群与生产相关联的新创阿基后肾元。

缩写

阿基:	急性肾损伤
记者:	碱性磷酸酶
BrdU:	5-Bromo 2′脱氧尿苷
CD:	收集管
dpi:	几天后受伤
DAPI:	4′,6-Diamidino-2-phenylindole
DBA:	白biflorus凝集素
德:	远端早期
DL:	远端末
DT:	远端小管
精灵- 97:	酶标记荧光- 97
旅客:	肾小球
):	苏木精和伊红
需要:	Lotus tetragonolobus植物血凝素
护士:	脖子
不是:	周期性acid-Schiff
我们:	成对基因盒2
PCNA:	增殖细胞核抗原
PCT:	近曲小管
太平洋标准时间:	近端小管直
PT:	近端小管
师:	小管
TUNEL:	末端转移酶的dUTP尼克结束标签
愿望:	整个山原位杂化。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢粘土康纳博士请提供他的斑马鱼组织学和免疫荧光技术在优化研究中采用的方法。他们也感谢莎娜牛顿,艾文莫拉莱斯和查尔斯·雷纳执行相关的探索性研究这个项目。他们感谢全体职员的生物科学系的持续支持和斑马鱼研究中心在巴黎圣母院的奉献和关爱我们的斑马鱼水族馆。他们特别感谢圣母集成成像设备和组织学核心试剂和其他研究支持。最后,他们感谢我们实验室的成员的评论、讨论,对这个工作和见解。这项研究是由美国国立卫生研究院(NIH)授予DP2OD008470号,罗勒K01DK083512, R01DK100237和畸形儿奥康纳起动学者没有授予奖项。5 -关于75。支持也提供启动资金从圣母大学的生,学院科学和生物科学,以及一份礼物从伊丽莎白和圣母大学的迈克尔·加拉格尔支持干细胞研究。克里斯汀施普林格是由夏季从格林家族荣誉奖学金资助项目和科学学院在圣母大学的。

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