文摘

可注射水凝胶有牙髓再生的临床翻译潜力巨大。最近发达PEG-fibrinogen (PF)水凝胶,这包括生物活性纤维蛋白原骨干共轭聚乙二醇(PEG)的侧链,可以通过光聚合交联后注射。本研究的目的是调查使用这种水凝胶,它允许调优的力学性能,为牙髓组织工程支架。PF水凝胶的交联程度可以由不同数量的控制PEG-diacrylate (PEG-DA)交联。PF水凝胶通常与封装cytocompatible牙髓干细胞(DPSCs),收益率> 85%细胞生存能力在所有的水凝胶。发现封装DPSCs的细胞形态,牙原性的基因表达,矿化强烈调制的水凝胶交联度和刚度矩阵。值得注意的是,DPSCs培养在最高的交联水凝胶仍主要是圆形骨料,并演示了最伟大的增强牙原性的基因表达。一致,最高程度的矿化在最高的交联水凝胶。总的来说,我们的研究结果表明,PF水凝胶可以作为支架DPSCs和提供的可能性影响DPSCs的方式可能有利于应用于再生牙髓学。

1。介绍

近年来,人们越来越关注保守策略在牙髓学治疗病变的牙齿纸浆。新兴再生牙髓学的范式,干细胞和组织工程技术为完成组织的修复和再生提供潜在的治疗牙齿坏死的病人(1,2]。

牙髓干细胞(DPSCs)已被证明是一个合适的细胞来源牙科组织再生,由于高的可访问性,增殖能力,和multilineage分化潜力(3,4]。归纳生化因素odontoblastic分化DPSCs近年来已经被充分研究过(5- - - - - -7]。然而,仍有局限的理解理想的支架设计和关键干细胞生物材料相互作用所需的支持DPSCs再生牙齿组织。值得注意的是,人工细胞外微环境的力学性能以及它们如何可能会影响行为的DPSCs仍知之甚少。

在牙髓组织工程的背景下,可注射水凝胶为支架的使用是特别有吸引力,因为他们预计符合变量髓室的形状,可以制定与细胞和/或生长因子通过简单的混合(8- - - - - -12]。我们之前已经开发出了一种可注射的半合成水凝胶支架材料包括纤维蛋白原骨干共价结合的聚乙二醇(PEG)的侧链光聚合和交联。水凝胶的机械性能也可能调整的交联程度通过一个简单的额外的浓度调整PEG-diacrylate (PEG-DA),光和紫外线(UV)光强度(13]。此外,水凝胶的独特photo-cross-linking属性允许牙医将前体溶液注入到牙髓室之前快速凝胶化光聚合。

在这项研究中,我们调查了cytocompatibility PEG-fibrinogen (PF)水凝胶和不同水凝胶交联度的影响封装牙髓干细胞的分化(DPSCs)。我们假设水凝胶不同交联度的可能诱发细胞形态学变化和影响分化的程度。我们还假设PF水凝胶交联程度更高,相应提高储能模量将促进odontoblastic DPSCs分化。这项研究可能有助于设计可注射水凝胶支架应用于牙髓组织工程和再生牙髓学。

2。材料和方法

2.1。PEG-Fibrinogen前体的合成

盯住纤维蛋白原(PF)是合成根据出版协议(13]。简要7毫克/毫升牛纤维蛋白原(Bovogen生物制品企业有限公司,澳大利亚)磷酸缓冲盐溶解在10毫米(PBS)和8 M尿素。三羟甲基氨基甲烷(2-carboxyethyl)液磷化氢盐酸盐(TCEP-HCL)被添加到解决方案在摩尔比为1.5:1的半胱氨酸的纤维蛋白原。纤维蛋白原的解决方案之后,使用氢氧化钠调整pH值8(氢氧化钠)。PEG-DA解决方案是由溶解280毫克/毫升PEG-DA(线性、10 kDa)粉在10毫米PBS 8 M尿素。离心后,上清液含有溶解PEG-DA解决方案添加到纤维蛋白原在3.7:1克分子比盯住纤维蛋白原半胱氨酸。混合物的反应在一个反应容器恒温外套(楞次Laborglas、德国)为22.5°C 3 h在黑暗中。反应后,解决方案是首先稀释的PBS包含8 M尿素,然后通过添加成丙酮沉淀的体积比4:1(丙酮溶液)。沉淀剂是通过添加1.8卷PBS-8 M尿素再溶解。修改后的纤维蛋白原被纯化和浓缩8 - 12毫克/毫升用Centramate磁带(美国纽约kDa 50 MW截止)。 The PEG-fibrinogen (PF) solution was subsequently passed through a high shear fluid processor (Microfluidics M110-P, USA) to achieve uniform particle size and finally filtered with VacuCap 90 filter (Pall Corporation, USA).

2.2。制造PF的水凝胶

PF与不同的交联度是由交联水凝胶使用变量数量的额外PEG-DA PF凝胶。四组包含0、0.5、1.5和2.5% w / v额外PEG-DA准备。让这些凝胶,包含四个组件的前体溶液制备:(1)PF水凝胶(最终浓度8毫克/毫升);(2)PEG-DA(从15%稀释股票在PBS溶液);(3)1% (v / v)的光解决方案(准备从2959 w / v Irgacure原液含有10%(瑞士汽巴)在70%的乙醇);(4)PBS(音量可调)。前体的解决方案是首先由涡流混合3 s,然后转移到塑料缸模具(150μL,费舍尔科学)或15-wellμ幻灯片(Ibidi)凝胶。进行交联,前体解决方案受到长波紫外线(365 nm, 4 - 5 mW /厘米²)在15-well 3分钟μ幻灯片或者在塑料缸模具5分钟。

2.3。PF水凝胶的流变特性

流变测量PF水凝胶进行了使用AR-G2流变仪(美国TA仪器、纽卡斯尔、德)根据出版协议14]。简单地说,在200年1分钟平衡时间μL PF前体溶液放置在仪器被暴露在长波紫外线交联(365海里)发出OmniCure系列2000紫外光源的强度5 mW /厘米²。时间扫描振动测试在室温下进行正弦2%应变率和6-rad年代⁻¹角频率,先前确定的线性粘弹性区域内(15]。颞储能模量的变化记录3分钟后开始交联。

2.4。肿胀PF水凝胶的分析

测量溶胀比、PF水凝胶也被扔在缸模具,转移到PBS,允许平衡24 h在4°C。湿重的样品确定之前进行冷冻干燥过夜。水凝胶的体重的变化之间的肿胀()和干()是用来确定体积膨胀率如下:

2.5。DPSC封装和分化

人类DPSCs用于本研究获得商业从AllCells LLC。DPSCs杜尔贝科的修改鹰的培养基培养(DMEM)(低葡萄糖、擤鼻涕、法国)补充10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫,擤鼻涕)和1% (PS、生命技术、新加坡)。启动细胞封装,DPSCs P4-P5被胰蛋白酶化分离之前在PF resuspended凝胶前体溶液的密度1×10⁶细胞/毫升。引发交联,cell-gel混合物暴露在长波紫外线15-well 3分钟μ幻灯片或者在塑料缸模具5分钟。DPSCs封装在PF水凝胶被培养在牙原性的/ odontoblast-like细胞分化成骨分化培养基(16)组成的DMEM高葡萄糖,10%的边后卫,1% PS, 10⁻⁷地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),50μg / mL抗坏血酸2-phosphate(σ),和10毫米β甘油磷酸酯(σ)。DPSCs封装在PF水凝胶(铸缸模具和15-wellμ幻灯片)分化为3周中改变每3天。

2.6。细胞生存能力

封装在PF DPSCs水凝胶被生活/彩色死可行性分析工具(技术)根据制造商的协议。简而言之,在水凝胶中摘除和细胞冲洗一次PBS孵化与染料紧随其后。活细胞钙黄绿素染绿了我和死细胞标记红色ethidium homodimer-1使用共焦显微镜(EthD-1)可视化。两到三个随机部分为每个样本进行了分析(样品/凝胶类型)。细胞计数进行使用ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)。比例计算细胞的生存能力是可行的细胞的数量除以总数量的细胞测量/凝胶,乘以100。

2.7。细胞形态

经过21天的文化,DPSC-laden水凝胶结构缓冲福尔马林固定在10%隔夜在4°C。PF水凝胶结构进一步cryoprotected 25%蔗糖溶液,瞬间冷冻在异丁烷(−30°C),嵌入Tissue-Tek超频T化合物(樱花Finetek Inc .)、托兰斯、钙、美国),和cryosectioned 30μ米(17]。部分被苏木精和伊红染色(圆))标准组织学技术后,如前所述[18]。细胞形态学评估分析)彩色横截面上的PF水凝胶结构。数字显微图被10倍物镜放大率和比例的细胞聚合分析使用ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达),表示为细胞总数的百分比,如前所述[19]。两到三个随机部分为每个样本进行了分析(样品/凝胶类型)。

2.8。实时rt - pcr

实时逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)、PF水凝胶与1×10缸模具制作⁶/毫升DPSCs。RNA提取总RNA的提取DPSCs NucleoSpin工具包(Macherey-Nagel,德国)。纯化RNA被iScript cDNA合成然后转录cDNA工具包(Biorad、大力神、钙、美国)。PCR反应,2 x iScript一步法rt - PCR试剂(Biorad)混合互补脱氧核糖核酸模板和引物。它连接的rt - PCR反应进行实时PCR仪在95°C (Biorad) 3分钟紧随其后40周期10变性在95°C和30年代退火55°C。对所有实验,glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被用来作为内部参考基因和3样本(每组样品/凝胶类型)被分配量化。胶原蛋白我的引物序列(上校,我),象牙质sialophosphoprotein (DSPP)、牙本质基质蛋白1 (DMP-1)、骨钙素(OC),GAPDH详细表1。

2.9。钙的测定和DNA量化

钙的测定和DNA量化要求PF水凝胶溶解和封装DPSCs。分化为3周后,样品被转移到1.5毫升超小型电子管包含PBS渐变20(σ)溶菌作用为0.2%。孵化后37°C 2 h,细胞溶解样品储存在−20°C为后续分析。钙和DNA含量的测量,测定钙(美国开曼,安阿伯市,MI)和PicoGreen dsDNA量化分析(技术)进行,分别根据制造商的指示。数据被使用无限2000板读者(Tecan、奥地利)。钙的数量在每个样本归一化到相应的DNA数量。

2.10。统计分析

数据报告为平均值±标准偏差(SD)。方差分析(方差分析)和费舍尔的受保护的最小二乘(PLSD)的区别事后测试进行了使用StatView软件(SAS研究所Inc .卡里,数控,美国)。统计学意义是设置为。

3所示。结果

3.1。水凝胶特性

额外的数量PEG-DA交联(从0到2.5 wt %)不一,形成PEG-fibrinogen (PF)四种不同交联度的水凝胶(PF-0、PF - 0.5 PF - 1.5,和PF - 2.5),分别,跨越一系列机械和肿胀属性。

PF水凝胶的形成是评估使用振荡电流测定剪切储能模量的措施和损耗模量剪切应变。凝胶点,定义为的交叉和是用来评估水凝胶的凝胶率。总结如表2的高峰值,代表完全交联水凝胶的刚度可调的PEG-DA添加到前体的解决方案。0、0.5、1.5和2.5 wt % PEG-DA导致平均峰值的值,,,分别Pa。这种变化在随着PEG-DA百分比是统计学意义(功率= 1)。同时,水凝胶的凝胶点范围从11.4到23.4年代PEG-DA越来越多。此外,所需要的时间达到峰值,然后高原还与PEG-DA百分比的增加显著增加(功率= 1)。这些结果表明,添加PEG-DA交联允许更高程度的PF水凝胶交联,导致更高的模量,但还需要更长的时间完成交联过程。

添加PEG-DA交联显著减少肿胀率(功率= 0.71),如图1。值得注意的是,肿胀率下降在PF-0在pf - 2.5水凝胶。这些结果表明,一个额外的数量之间存在负相关PEG-DA溶胀比,即PEG-DA浓度较高的水凝胶诱导减少肿胀由于更高的网络交联程度较小的网格大小。

3.2。DPSC可行性和PF水凝胶的细胞形状变化

DPSCs被封装在PF水凝胶(PF-0 PF - 0.5, PF - 1.5,和PF - 2.5)在光聚合创建3 d梗塞部位结构。使用活细胞生存能力评估/染色后1天、7天死亡文化(图2(一个))。可行性,评估生活封装/死染色1天之后,表示高(> 90%)的可行性DPSCs PF-0封装,减少细胞生存能力的可观察到的趋势与增加的百分比PEG-DA交联。大约15%的细胞死亡是pf - 2.5水凝胶(图中观察到2 (b))。第七天的文化中,超过85%的生存能力是观察到的水凝胶,尽管似乎有轻微的细胞数量减少,可能是由于细胞聚合。

PF-0和pf - 0.5水凝胶细胞最初的但很快就开线后24 h(图2(一个))。第七天的文化,大多数DPSCs变得高度开线。一小部分细胞集群spindle-like细胞质扩展也可以观察到。值得注意的是,DPSCs依然残存在PF-0和pf - 0.5水凝胶时间期间文化(图3)。相反,在pf - 1.5和2.5 pf -水凝胶,DPSCs表现出更少的细胞扩展和减少开线形态。显然,在组织学显示横截面上的凝胶结构,细胞不能形成致密的聚合物网络中扩展包含额外PEG-DA交联(pf - 1.5和pf - 2.5)期间,仍主要是圆形骨料(图21天的文化3(一个))。定量分析进一步表明交联的程度之间的关系,细胞聚集(图的程度3 (b))。年底前21天的文化中,最高的交联pf - 2.5水凝胶表现出细胞聚合的比例最高(%)。与凝胶交联,增加细胞总量的百分比有显著增加(图3 (b))。单因素方差分析显示显著影响凝胶的交联程度的细胞聚合(功率= 1)。

3.3。DPSC分化和矿化PF水凝胶

的力学性能可调的影响3 d PF分化的水凝胶DPSCs牙原性的条件下在课程评估(图21天的时间4)。相关基因的表达水平DPSCs牙原性的分化,包括上校,我,DSPP,DMP-1,和OC,测量使用实时定量rt - pcr在天7和21的区别(图4)。的表达水平上校,我基因是最高PF-0水凝胶在第七天的区别,增加了文化。白天21的分化,基因表达水平上校,我在PF-0水凝胶大约是13倍高于pf - 2.5水凝胶(图4(一);)。相比之下,的表达水平上校,我基因一直最低的pf - 2.5水凝胶在不同时间点(图4(一))。基因表达水平没有明显差异DSPP和DMP-1在PF水凝胶在第七天的区别(数据4 (b)和4 (c))。然而,白天21的分化,基因表达水平DSPP和DMP-1增加了PF % PEG-DA和较高的水凝胶是最高的PF - 2.5水凝胶(数字4 (b)和4 (c))。值得注意的是,基因表达水平DSPP和DMP-1在pf - 2.5水凝胶(约1800倍)和150倍(分别)高于PF-0水凝胶。的基因表达水平OC高与添加PEG-DA PF水凝胶(0.5,1.5,2.5%)第七天的区别(图4 (d))。然而,白天21的分化,基因表达水平OCpf - 0.5和1.5 pf -水凝胶减少到基底的水平相媲美,在PF-0水凝胶,而基因表达水平OC在pf - 2.5增加文化。值得注意的是,基因的表达OC2.5 PF -水凝胶至少5倍高于其他PF水凝胶(图4 (d);)。

水凝胶支架的矿化是研究用茜素红染色和钙定量分析(图5)。量化显示更高水平的钙沉积钙PF % PEG-DA较高的水凝胶(图5(一个))。单因素方差分析显示显著影响凝胶的交联程度的钙沉积(年底,权力= 1)。21天的分化、DNA含量(DPSCs)是最高最低的交联pf - 2.5水凝胶(图5 (b))。当规范化的DNA含量,最高水平的钙含量在每个细胞的基础上观察PF - 2.5水凝胶,至少3.5倍的价值高于其他PF水凝胶的值(图5 (c);)。这一结果进一步证实了茜素红染色(图5 (d)),观察到的矿化只有在pf - 1.5和pf - 2.5水凝胶,细胞仍主要是圆形的聚集的地方。相比之下,没有观察到的矿化在PF-0和pf - 0.5,在大多数细胞仍然残存。

4所示。讨论

使用注射和原位gel-forming系统临床牙髓再生的翻译尤其有吸引力,因为他们可以很容易地制定与生长因子和细胞通过简单的混合,可以符合变量髓室的形状,后注入。因此,有兴趣的可注射水凝胶的发展近年来组织工程(20.),尤其是牙髓组织工程(8- - - - - -12]。

设计的牙髓组织工程的支架,几个参数包括矩阵组成和架构已报告影响附着力,牙齿干细胞和祖细胞的增殖和分化。虽然大多数研究[11,12,16]关注修改支架加强牙原性的分化和生物矿化的影响矩阵刚度DPSCs的分化是在很大程度上仍然不清楚。另外,几项研究已经报道的影响矩阵刚度调节细胞命运的各种细胞类型包括干细胞(21- - - - - -26]。特别是,在具有里程碑意义的研究中,断等人证明了矩阵的弹性影响MSC分化成神经细胞,成肌细胞,刚度和成骨细胞在升序,笔直的矩阵支持MSC分化成骨细胞(21]。因此,本研究的目的是探讨不同水凝胶交联度的影响和相应的矩阵使用可调刚度DPSCs分化的水凝胶体系。

先前的研究利用天然生物聚合物凝胶(胶原蛋白、基底膜基质、PuraMatrix和透明质酸)不提供一种手段优化机械性能独立于矩阵组成,授予摘要属性的附着力和蛋白水解敏感性8,9,12]。半合成PEG-fibrinogen (PF)水凝胶是特别有用的在这项研究中,因为机械性能可调的交联(PEG-DA)控制水凝胶的交联度,同时保持一个恒定的纤维蛋白原骨干。这个独特的特性使我们能够研究水凝胶的机械性能的影响DPSC微分系统和独立。

一般来说,PF水凝胶与DPSCs cytocompatible,尽管有轻微下降,细胞生存能力提高交联度和刚度矩阵。不同的细胞形态学差异DPSCs可以观察到在PF水凝胶具有不同交联度。显然,细胞形成集群spindle-like细胞质内扩展低交联PF水凝胶(PF-0和PF - 0.5),这是经常观察这些细胞的共同特征等软矩阵PuraMatrix [8,9]。传播和伸长也可能与细胞分泌的能力纤溶酶来分解低交联水凝胶网络更容易比在高交联水凝胶(27]。相反,细胞往往是圆形,浓密的聚合物网络中形成总量限制的高交联水凝胶(pf - 1.5和pf - 2.5)。众所周知,细胞形态和功能紧密耦合(28]。值得注意的是,低交联矩阵,感应spindle-like伸长DPSCs导致基因表达的更明显上校,我。虽然上校,我是一种细胞外基质(ECM)成分软化牙本质,这也是一个重要的胶原基质蛋白存在于许多其他组织。与随之而来的upregulation上校,我其他牙原性的差别,但对这些标记包括DSPP,DMP-1,OC有可能性,DPSCs指导下软矩阵区分成其他血统和成骨细胞。

另一方面,较高的交联硬水凝胶(pf - 1.5和pf - 2.5)在这项研究中,测试了从1500年到3600年巴勒斯坦权力机构,通常青睐odontoblastic DPSCs分化。2.5 pf -水凝胶结构的刚度~ 3600 Pa诱导基因表达最高的DSPP,DMP-1,OC年底前21天的分化。很可能加剧牙原性的/成骨分化的结果DPSCs形成细胞聚集和mechanosensing硬矩阵,在以前的研究中显示,促进干细胞骨(29日,30.]。与基因表达的结果一致,矿化只是观察到更高的水凝胶交联pf - 1.5和pf - 2.5,后者显示最健壮的矿化。感兴趣的,细胞之间有很强的相关性聚合用圆形细胞的比例和程度的钙沉积(线性回归分析;)。

年底相对最低的手机号21天的分化,细胞很可能聚合中观察到的最高交联pf - 2.5水凝胶促进牙原性的分化但较小程度上扩散。然而,一个更全面和定量评估将为一个更完整的描述是必要的细胞增殖分化过程中。

集体,注射PF水凝胶与DPSCs cytocompatible,和水凝胶力学性能(即。,cross-linking degree and matrix stiffness) and biofunctional properties conferred by fibrinogen could be tuned to provide a supportive biomimetic cellular microenvironment for odontogenic differentiation. These results suggest a possible use of these hydrogels as scaffolds for dentin-pulp tissue engineering and regeneration. To the best of our knowledge, this work represents the first demonstration of the influence of matrix stiffness on DPSC odontogenic differentiation in 3D tunable hydrogels. Further studies through tooth slice organ culture [31日),在活的有机体内移植研究[9,32)需要评估如果这些水凝胶是支持新管状牙本质的形成和果肉组织复杂的牙髓再生。

5。结论

注射,原位形成水凝胶为牙髓组织工程尤其具有吸引力,因为他们可以很容易地制定与生长因子和细胞通过简单的混合,并能符合髓室后注入。在这项研究中,我们调查了使用注射PF水凝胶作为DPSCs脚手架运营商对牙髓组织工程提供了强有力的证据,可调的三维微环境PF-hydrogels调节人类DPSCs牙原性的分化和矿化。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由国家研究基金会支持——(NRF) Technion-NUS格兰特和赠款(R221000067133、R221000068720 R221000070733)从新加坡国立大学(NUS),国立大学卫生保健系统,和新加坡教育部。