文摘
磷酸钙(帽)基于复合支架已广泛用于骨组织工程的骨再生。以前,我们开发了一种仿生复合nanofibrous膜凝胶/β磷酸三钙(TCP),证实了他们的生物活性在体外和骨再生在活的有机体内。然而,如何将这些复合纳米纤维促进成骨分化的骨髓间充质干细胞(bmsc)是未知的。在这里,明胶/βtcp复合纳米纤维制造中加入20 wt %βtcp纳米粒子实际上电纺明胶纳米纤维。电子显微镜显示复合βtcp纳米纤维非织造多孔网络结构,表面很粗糙。光谱分析证实的存在和化学稳定性βtcp和明胶组件。与纯明胶纳米纤维相比,明胶/βtcp复合纳米纤维的增加导致了细胞附着、增殖,碱性磷酸酶活性,在鼠bmsc成骨的基因表达。有趣的是,calcium-sensing受体的表达水平(CaSR)明显高于复合nanofibrous比纯明胶支架。对大鼠颅盖的关键尺寸的缺陷,更广泛的骨和新血管形成发生在复合支架组与凝胶组。因此,明胶/βtcp复合支架促进成骨的bmsc的分化在体外和骨再生在活的有机体内通过激活钙2 +敏感技术受体信号。
1。介绍
磷酸钙(CaP)陶瓷材料已经使用传统的骨再生和临床修复骨缺损的研究因其良好的生物相容性和osteoconductivity [1- - - - - -3]。然而,帽的使用陶瓷材料本身是有限的,因为他们的脆性和低塑性(4]。为了克服这些缺点,介绍了高分子材料形成复合支架来改善骨缺损修复的效率和临床适用性帽材料(5- - - - - -7]。各种复合支架结合帽材料和天然或合成聚合物是由不同的制备技术。其中,电纺的再生医学技术受到越来越多的关注,因为它有吸引力的特性,生产超细纤维等模拟身体自然骨细胞外基质(ECM)在纳米尺度上(8- - - - - -10)和表面形态、结构和性能的纤维可以调制通过修改组件的结构或内容(11- - - - - -13]。因此,在骨组织工程领域,它是一个理性的战略发展与nanofibrous复合支架结构调整骨的细胞外基质。
近年来,实际上电纺帽/聚合物nanofibrous复合材料被认为是有益的依恋,增殖和成骨分化成骨细胞(14- - - - - -16),以及提高骨缺损修复的效率(10,17,18]。然而,这些支架的支持功能背后的机制知之甚少。最近,刘等人报道,nanofibrous羟基磷灰石/壳聚糖(nHAp / CTS)支架可以诱导骨生成的骨髓间充质干细胞(bmsc)通过激活骨形成蛋白(BMP) / Smad通路(19]。然而,对于可降解复合材料包含帽陶瓷、了解钙离子释放这些纳米纤维msc成骨分化的微环境的影响原位至关重要的骨再生支架材料优化设计的应用程序。细胞外钙离子是重要的提高成骨细胞的增殖和表型表达细胞(20.,21]。先前的报道表明,钙离子的影响MC3T3-E1 osteoblast-like成骨分化的细胞(22)或人类脂肪干细胞(23浓度。
以前,我们成功地准备明胶/βtcp复合纳米纤维具有不同的内容βtcp纳米粒子使用电纺的技术。结果表明,依恋,蔓延,增殖,分化的人类骨肉瘤mg - 63细胞含量的增加而增加βtcp纳米颗粒和持续释放的Ca2 +在介质(24]。此外,复合纳米纤维的含量高βtcp导致显著的骨形成与纯实际上电纺明胶支架(25]。然而,如何将这些复合纳米纤维促进bmsc的成骨分化在很大程度上是未知的。
本工作的目的是分析的影响实际上电纺明胶/βtcp复合纳米纤维大鼠成骨分化的bmsc并检查底层机制在体外和在活的有机体内。起初,我们评估了细胞依附,扩散,扩散和碱性磷酸酶(ALP)活性老鼠bmsc明胶/βtcp与纯粹的明胶纳米纤维。然后我们发现mRNA水平的成骨的特定基因和calcium-sensing受体(CaSR)作为钙分子。随后,我们研究了明胶/的功效βtcp诱导新骨再生和相关CaSR表达式通过外科手术创造一个批评-大小的模型大鼠颅盖的缺陷。
2。材料和方法
2.1。静电纺丝的制备
电纺的明胶/详细过程βtcp解决方案如图1并描述了在我们以前的工作(24]。首先,定义的βtcp纳米颗粒(平均粒径= 200海里,Rebone生物材料有限公司,上海,中国)分散在去离子水中包含2% w / v柠檬酸钠。20% (w / v)的凝胶(pH值4.5 - -5.5,开花数量240 - 270,Amresco,美国)添加到βtcp悬挂的解决方案。的内容βtcp被设置为20 wt %的明胶。电纺的当时执行使用以下变量:应用电压20 kV,解决喂养率0.3毫升/小时,收集距离12厘米,和40°C的环境条件。准备支架对细胞培养,实际上电纺膜nanofibrous化学交联是根据我们之前的研究(24]。实际上电纺样品都干了3 - 4天在真空炉消除任何潜在的残留溶剂。
2.2。对静电纺丝
复合纳米纤维的表面形态和内部结构观察使用扫描电子显微镜(SEM);日立s - 4700,日本东京)。的分布βtcp的纳米颗粒明胶纳米纤维矩阵是由透射电子显微镜(TEM)研究了使用日立h - 800机器。水晶和复合纳米纤维的化学结构是通过x射线衍射(XRD);Rigaku D / max 2500 VB2 + / PC、日本)和傅里叶变换红外光谱(红外光谱;分别Nicolet 8700,美国)谱。
2.3。附件和rBMSCs扩散
老鼠bmsc (5×104细胞/)被播种到实验支架12-well盘子和孵化在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。经过1天的文化,样本固定在2.5%戊二醛和连续与越来越乙醇梯度脱水,脱水罩,气急败坏的说,黄金在扫描电镜下观察(s - 3000 n、日立、日本)。共焦激光扫描显微镜下观察细胞骨架组织(样品形貌;fluoview - 300,奥林巴斯,日本东京)。核沾染了4′,6-diamidino-2′-phenylindole (DAPI;美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和肌动蛋白丝沾罗丹明phalloidin(分子探针,尤金,或者美国)在培养24小时。测量细胞传播领域使用图像J软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)使用一个随机抽样方法。细胞增殖是化验使用CCK-8工具包(Dojindo、日本)在1天,3天,7天的文化,与吸光度被阅读的波长450 nm,读者使用酶联免疫吸附测定(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。
2.4。碱性磷酸酶(ALP)活性测定
老鼠bmsc /支架()是不断培养与成骨的水井补充中含有50毫克/毫升抗坏血acid-2-phosphate 100海里地塞米松,10毫米β-glycerolphosphate。4、7、14天,贴壁细胞的高山活动评估使用碱性磷酸酶测定工具包(Abcam、剑桥、马),根据制造商的指示。的吸光度测定波长405 nm,和高山活动被读出的值标准曲线根据标准样品提供的工具包。
2.5。定量实时聚合酶链反应分析
成骨诱导培养后7、14和21天,总RNA提取每个示例使用试剂盒试剂(美国Gibco-BRL,马里兰州),遵循制造商的指示。RNA被反向转录产生cDNA使用逆转录系统(WI Promega,麦迪逊,美国)。使用SYBR绿色检测系统实时rt - PCR进行ABI棱镜7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。所有反应都是一式三份。成骨基因的引物序列,包括runt-related转录因子2 (RUNX-2),胶原蛋白I型(COL1A1),骨形成protein-2 (BMP-2)、骨钙素(OCN)和calcium-sensing受体(CaSR),表中列出1。
2.6。动物和外科手术
十二8-week-old男性Sprague-Dawley老鼠被用于这项研究。实验动物保健和使用委员会批准的协议是北京大学。建立颅顶的缺陷模型,大鼠麻醉腹腔phenobarbitol钠(100毫克/公斤)和背头盖骨被曝光。两批评-大小的全厚度骨缺陷(5毫米直径)准备在每一个老鼠在每个顶骨的中心,使用saline-cooled环钻钻(图2)。每个缺陷与生理盐水冲洗去除骨头碎片。植入凝胶/左边的缺陷βtcp复合nanofibrous支架和正确的缺陷被植入纯凝胶nanofibrous支架作为控制。整个头顶收获了评价4和12周后植入。
(一)
(b)
2.7。Microcomputed断层扫描(ct机)扫描评估
在植入后4和12周,头顶样本收获完整和固定在4%多聚甲醛24 h在4°C。使用ct机扫描标本检查,如前所述[26]。文件重建使用修改后的Feldkamp算法,这是创建使用microtomographic分析软件(Tomo NT;Skyscan、比利时)。在三维(3 d)可视化,骨的形态学分析,包括计算骨密度(BMD)及骨体积分数(骨体积/总量,BV /电视),进行了对感兴趣的区域(ROI)。
2.8。组织学分析
组织处理和分节进行了如前所述[26]。简单地说,组织样本中性缓冲福尔马林固定在10% 7天,脱钙和脱水根据标准协议,嵌入在石蜡,分段5µ米厚度。苏木精和伊红染色())和马森的三色的染色分别进行组织部分,根据制造商的协议,在光学显微镜和图像捕获(CX21、奥林巴斯、日本)。
2.9。免疫组织化学分析
免疫组织化学和OCN CaSR如前所述[执行27,28]。简单,组织幻灯片deparaffinized和水化然后被淹没在过氧化氢淬火过氧化物酶活性。之前接触的主要抗体OCN (ab13420 CA 1: 100年,Abcam)和CaSR (ab19347 CA 1: 100年,Abcam),幻灯片孵化与1% BSA阻止非特异性结合。孵化后一夜之间主要的抗体在4°C,合共轭二次抗体应用于1小时在室温下的幻灯片。最后,diaminobenzidine(轻拍;Beyotime、江苏、中国)工具是用于开发颜色,其次是与苏木精复染色。幻灯片在光学显微镜下观察(CX21、奥林巴斯、日本)。OCN和CaSR表达缺陷区域内使用web应用程序ImunoRatio量化(29日]。
2.10。统计分析
定量数据都表示为意味着±标准差(SD)。使用SPSS 19.0软件进行统计分析(芝加哥,IL)。使用学生的统计差异决定t以及独立样本。组之间的差异被认为是显著和被认为是非常重要的。
3所示。结果与讨论
3.1。实际上电纺明胶/的特征βtcp复合纳米纤维
图1显示了形态实际上电纺明胶,明胶/βtcp复合纳米纤维。所有的静电纺丝显示非织造结构,具有多孔网络互联。纯明胶纳米纤维是连续、平滑和均匀(图3(一个))。复合纳米纤维的粗糙表面,因为公司βtcp纳米粒子(图3 (c))。据报道,一个粗略的纳米纤维表面由磷灰石颗粒可以促进细胞粘附、增殖和成骨分化成骨细胞(30.]。它可以推断出βtcp纳米粒子在纳米纤维嵌入,证实了TEM图像(图的插图3 (c))。明胶是水溶性,因此明胶/βtcp复合纳米纤维必须交联前进行细胞培养。为了说明纳米纤维的交联效果,我们观察到的表面和侧面nanofibrous支架。纳米纤维的卷曲和互相粘合支架(insets的数字3 (b)和3 (d)交联后)。纤维的直径明显增加,因为在交联处理纤维膨胀,而孔隙大小与noncross-linked样品相比明显减少。
(一)
(b)
(c)
(d)
图4(一)显示了复合纳米纤维的x射线衍射模式。的衍射峰β明胶/ tcp可以观察到βtcp复合纳米纤维。与此同时,明胶的结构并不是公司的影响βtcp和electospinning过程。他们的存在和化学稳定性进一步证实了傅立叶变换红外光谱图所示4 (b)。相对应的吸收波段明胶(酰胺基:1650年~ 1550年,1250厘米−1),βtcp (:950 - 1100和550 - 620厘米−1)检测清楚。在我们之前的研究中,实际上电纺明胶/βtcp复合纳米纤维与20 wt %βtcp具有显著影响的osteoblasts-like mg - 63细胞的生物活性在体外(24]和引导骨再生在活的有机体内(25]。因此,在这项研究中,明胶/βtcp复合纳米纤维与20 wt %βtcp是用来进一步研究如何bmsc的成骨分化过程和骨缺损修复原位被提拔的复合纳米纤维。
(一)
(b)
3.2。复合纳米纤维增强在体外生物活性的rBMSCs
数据5(一个)和5 (b)播种后的SEM和样品形貌图像rBMSCs交联明胶,明胶/βtcp nanofibrous支架24 h。一般来说,细胞连接到支架上显示平面和传播形态、组织和肌动蛋白丝在定义良好的应力纤维细胞。有趣的是,rBMSCs播种在复合nanofibrous表现出更明显的细胞过程(图5 (b)和插图),以及一个更大的细胞扩散区(图5 (c))与细胞生长在纯净的明胶纳米纤维。这在很大程度上是相关的合并造成的表面粗糙度增加βtcp纳米颗粒,随后增强蛋白质的吸收能力,证实了我们之前的研究(24]。复合nanofibrous支架上的细胞增殖率也高于纯明胶(图5 (d))。然而,细胞增殖率成为降低复合支架和显示相比无显著差异,纯凝胶组7天。这种轻微的增殖抑制效应可能是相关的分化趋势rBMSCs,因为有一个互惠的细胞增殖和分化之间的关系(31日]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
评估的影响纳米纤维rBMSCs早期成骨分化能力,高山活动是量化4天,细胞播种后7和14。如图5 (e),更高的高山活动观察复合nanofibrous支架与纯粹的明胶纳米纤维。这可能是解释可生物降解的持续释放的钙离子βtcp,据我们之前的研究24和其他的研究32,33]。这些结果表明,实际上电纺明胶/β鼓励tcp复合纳米纤维增强的依恋,组织良好的细胞骨架,改进的扩散和高高山rBMSCs的活动在体外。我们的结果与先前的研究证明实际上电纺聚(L-lactic酸)(PLA) / 20% TCP加速成骨分化的人类脂肪干细胞与整洁实际上电纺聚乳酸支架(33]。同样,陆等人报道,羟基磷灰石(HA)引入实际上电纺聚(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV)纳米纤维可以诱导msc分化为成骨细胞(18]。
3.3。复合纳米纤维调节Osteogenesis-Related基因表达和激活Calcium-Sensing受体信号
在我们之前的研究中,Ca2 +从复合纳米纤维不同的释放行为βtcp内容在细胞培养基被刷新中每2天估计。结果表明,Ca的浓度2 +增加的内容βtcp加载和最高的Ca2 +浓度达到20 wt %βtcp负载(24]。在这项工作中,我们进一步研究了如何bmsc的成骨分化是由Ca2 +释放这些复合纳米纤维。成骨的基因的表达水平的rBMSCs nanofibrous支架诱导成骨的文化进行评估,如图6。的转录水平RUNX-2,COL1A1,BMP-2,和OCN明胶/βtcp复合支架高于纯明胶纳米纤维。这可以归因于Ca促进作用2 +释放复合纳米纤维。
检查了Ca之间的关系2 +和成骨分化的bmsc,我们检查的表达CaSR在rBMSCs。有趣的是,的表达CaSR复合材料组明显高于纯凝胶组。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示类似的趋势的定量数据。这个结果暗示CaSR可能导致成骨分化的bmsc复合支架由包含βtcp。CaSR报告作为传感器,因此转导Ca2 +信号,细胞内的基因表达调节细胞功能(34),已被广泛的研究在体外和在活的有机体内(28,35- - - - - -37]。然而,Barradas等人建议CaSR没有参与调停BMP-2 msc在不同浓度的Ca的表情2 +介质(38]。这可能归因于Ca的刺激方法的差异2 +。在我们的工作中,激活rBMSCs CaSR促进成骨分化的可能是一个综合效应由纳米纤维的结构特性和持续的Ca2 +释放。
3.4。复合纳米纤维推广在活的有机体内骨形成
探讨引导骨再生的能力实际上电纺明胶/βtcp nanofibrous支架并确认CaSR信号的激活在活的有机体内颅顶的缺陷的老鼠被选为实验动物模型,因为它是一种常见的模型,已被许多研究人员广泛采用10,19,39,40]。在这个工作,两个圆形(5毫米直径),全厚度关键缺陷在每个老鼠的头盖骨。我们的主要目标是探讨复合支架是否有更好的引导骨组织再生能力比纯粹的明胶。因此,我们对待左缺陷与明胶/βtcp复合支架植入和使用正确的缺陷与纯明胶支架控制。图7显示大鼠颅盖的缺陷修复的ct机分析结果在4和12周后植入。基于3 d图像,新生骨形成发生从外缘到中部地区在植入过程中两组。更多的骨骼增长可以观察复合支架组与纯凝胶组。整个缺陷几乎被骨突修复组织在12周复合支架组(图7 (b))。量化的骨体积缺陷显示,明胶/βtcp复合支架组与纯凝胶组相比显著升高()4和12周(数字7 (c)和7 (d))。两个时间点的骨质密度较高的明胶/βtcp组相比,在纯凝胶组,但并不严重。
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(c)
(d)
颅盖内的新成立的组织缺陷由组织学染色进行进一步分析,如图8。植入4周后,纤维组织形成相邻原骨结节在纯凝胶组(图8(一个))。马森染色显示纤维组织主要由新成立的胶原纤维(图8 (c))。复合支架组)染色显示明显的骨骼结构和丰富的血管化骨缺损的中间区域(图8 (b)),而更有规律地马森染色显示对齐胶原纤维填充骨缺损区域(图8 (d))。植入12周后,凝胶组)染色显示的形成成熟的骨结构融入骨缺损区域(图8 (e))。在复合支架,他走时染色显示显著增加骨量形成填补缺陷区域(图8 (f))。免疫组织化学分析表明,该地区植入凝胶/βtcp复合支架对更高层次的OCN比纯凝胶组4和12周后植入(图9)。因此,定量数据支持组织学观察(图9 (e))。总的来说,这些结果表明,实际上电纺明胶/βtcp复合纳米纤维在引导骨再生有积极的影响。目前的结果是一致的另一个研究[10和我们最近的报告25]。然而,它也被报道,明胶/βtcp海绵没有显著改善骨形成与纯凝胶(41]。这种差异可能反映了不同支架材料的结构特性及其在不同的骨缺损临床适用性网站。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
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(b)
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(d)
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3.5。复合纳米纤维增强CaSR表达式在活的有机体内
与明胶/评估植入的效果βtcp复合nanofibrous支架CaSR表达式,我们检查的表达在骨再生地区CaSR 12周后植入。如图10更强烈的明胶/染色观察βtcp组(图10 ())与纯凝胶组(图10 (b))和定量分析结果支持这种趋势(图10 (c))。这些结果表明,明胶/βtcp复合支架促进骨再生原位通过激活钙2 +敏感技术受体信号。
(一)
(b)
(c)
4所示。结论
在目前的研究中,nanofibrous明胶/βtcp复合支架,接近自然骨ECM成分和结构特性,支持rBMSCs粘连,传播、扩散和高山的活动。此外,明胶/βtcp复合支架诱导BMSC的成骨分化在体外通过激活钙2 +敏感技术受体信号。最后,明胶/βtcp复合表现出更广泛的骨和更高的CaSR表达式在活的有机体内相比之下,纯粹的明胶纳米纤维。这项研究强调了明胶/的巨大潜力βtcp复合纳米纤维在骨科和牙科的实际应用,如在牙周膜引导骨再生的口袋。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Xuehui张和孟歌同样导致了本文。
确认
作者承认资金从中国的国家基础研究计划(2012 cb933900),重点国际科技合作项目(2011 dfa32190),中国国家自然科学基金(81171000),博士中国教育部科研基金项目(20130001120112)、中国国家高技术研究发展计划(2015 aa032004和2012 aa022501)和北京新星计划(Z14111000180000)。