文摘

先前的研究已经证明了免疫抑制效应的all-trans视黄酸(ATRA)和间充质干细胞(msc)。本研究旨在评估ATRA的免疫调节作用在msc治疗强直性脊柱炎(AS)。来源于msc的骨骼健康的捐赠者的使用ATRA和cocultured CD3/28-activated外周血单核细胞(PBMCs)来自病人。频率Th17和调节性T (Treg)细胞用流式细胞仪进行了分析。关键细胞因子的分泌和mRNA水平测量仪珠阵列和定量实时PCR,分别。ATRA预处理增加msc的白细胞介素- 6 (il - 6)的分泌。Th17和Treg子集的人口增加,减少ATRA-pretreated msc、分别。ATRA-pretreated msc不仅显著降低了重要致病细胞因子,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),但也会刺激因素interleukin-17 (IL-17A)和干扰素-γ(IFN -γ)。这些结果表明,il - 6可能是一个潜在的保护因素,强调了承诺ATRA的角色在改善MSC-based治疗的疗效。

1。介绍

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性,渐进影响主要是中轴骨炎性疾病。被认为是一种自身免疫性疾病和interleukin-17A (IL-17A)生产Th17细胞参与发病机理(1,2]。

第一次,我们已经报道,同种异体的静脉注入骨骨髓来源间充质干细胞是一种有效和安全的方法治疗,尤其是病例服用依那西普和非甾体抗炎药是无效的3]。然而,潜在的机制在很大程度上仍未知。间充质干细胞(msc)是多能祖细胞,这表现出免疫调节能力(4)和低免疫原性(5]。msc被成功地用于治疗许多自身免疫/炎症性疾病如克罗恩氏病(6和系统性红斑狼疮7他们的免疫抑制能力的基础上。免疫调节机制十分复杂,仍不完全清楚。一些研究表明,信息联系参与免疫抑制作用,如抑制Th17细胞分化和IL-17分泌8,9]。msc还可以吸引效应T细胞通过分泌趋化因子促进直接免疫调节(10]或触发FAS / FASL-induced凋亡[11]。检查参与组成分泌腺平行,MSC也导致细胞接触独立的影响。研究最多的可溶性分子来源于msc包括吲哚胺2、3-dioxygenase (IDO)、前列腺素E2 (PGE2)、转化生长因子(TGF -β)、一氧化氮(NO)和肝细胞生长因子(HGF) [10,12]。

All-trans视黄酸(ATRA),代表视黄醇的代谢物,参与一些视黄醇的生物活性。ATRA扮演了一个关键的角色在细胞增殖,分化和成熟(13]。此外,ATRA可以调节先天免疫通过诱导调节性T细胞亚群)和抑制Th17细胞分化14]。几项研究已经记录了ATRA治疗自身免疫性疾病的疗效[15- - - - - -17]。维生素a水平的患者明显低于健康对照组(18]。它也被观察到,ATRA政府减少Th17的频率和抑制肿瘤坏死因子的分泌α在为患者的外周血19]。

综上所述,我们假设ATRA是有效的治疗是通过调节msc的免疫调节能力。在目前的研究中,我们cocultured msc及外周血单核细胞(PBMCs)和检查的频率Treg Th17子集和关键细胞因子的分泌。我们定义了致病性Th17细胞CD4细胞的表面标记的组合,CCR4和CCR6 [20.]。我们所知,这是第一个研究表明ATRA改善msc治疗的免疫调节能力。

2。材料和方法

2.1。隔离的msc和PBMCs

本研究经中山大学的伦理委员会批准,广州,中国。健康志愿者( 15个男性5女性、年龄、18-28年)被招募为捐赠者的骨髓。骨髓提取后的优越棘在无菌条件下和msc孤立按照标准化程序(21]。msc第四通道被用于实验。PBMCs作为患者的外周血中分离的( 18岁男性6女性、年龄、使用Ficoll-Hypaque梯度离心法16-40年)。患者选择根据修改后的纽约标准(22]。从所有捐助者和患者知情同意了。

2.2。Trilineage msc分化潜力分析

成骨分化。msc被播种到six-well板块(1×105细胞/)总量的3毫升DMEM培养基补充10%胎牛血清的边后卫,50 mg / L抗坏血酸(σ),10毫米β甘油磷酸酯(σ),和100 nM地塞米松(σ)。媒介是每三天更换一次。总文化持续时间是21天。茜素红染色使用。

Chondrogenic分化。msc (2.5×105细胞)在600 g离心5分钟15毫升锥形管。细胞培养与high-glucose DMEM补充1% ITS-Premix(康宁),50 mg / L抗坏血酸(σ),1毫米丙酮酸钠(σ),100 nM地塞米松(σ),和10 ng / mL转化生长因子-β3 (R&D)。媒介是每三天更换一次。总文化持续时间是21天。

脂肪形成的分化。msc被播种到six-well板块(1×105细胞/)。DMEM培养基与10%的边后卫,补充1μM地塞米松(σ),10μg / mL胰岛素(σ),0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine(σ),吲哚美辛和0.2毫米(σ)。经过3天的感应,包含10中被DMEM取代μg / mL胰岛素,1天以后,媒介是上面提到的诱导培养基所取代。经过三个周期的文化,细胞被涂以DMEM包含10μg / mL胰岛素直到第14天。油红O染色多聚甲醛固定后使用。

2.3。ATRA准备和msc预处理

ATRA粉(σ)溶解在二甲亚砜(DMSO)和储备根据制造商的指示。ATRA的解决方案是准备与DMEM培养基补充10%的边后卫。msc被播种到six-well板块(1×105细胞/)总量的3毫升DMEM培养基,经过1μM ATRA 1天,3天,5天内根据不同的实验。的msc cocultured PBMCs只有经过1天。预处理后,介质含有ATRA完全移除和msc与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)的三倍。细胞被培养在ATRA-free媒介。msc对照组使用相同体积的DMSO ATRA。

2.4。细胞培养

MSC的比率与PBMCs cocultured 1: 20 MSC: PBMC。T细胞被纯化anti-CD3(0.2刺激μg / mL, BD Pharmingen)和anti-CD28 (1μg / mL, BD Pharmingen)抗体。细胞被cocultured rpmi - 1640中3毫升的最终体积的5天。细胞比例和coculture时间测定根据初步实验。对CD4 + T细胞增殖分析,PBMCs孵化了5μM carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl酯(CFSE,生活技术)为15分钟,用PBS含有10%的边后卫coculture之前的三倍。评估的影响促炎细胞因子il - 6分泌的msc、外源性干扰素-γ(IFN -γPeproTech) (10 ng / mL)和肿瘤坏死因子-α(研发10 ng / mL)被添加到培养基培养的msc预处理后5天。细胞因子的测量,无触点coculture也使用six-well和0.4进行μ米孔隙Transwell板系统(康宁)PBMCs被播种在参议院。

2.5。流式细胞术

msc使胰蛋白酶化了很多表面标记的识别。表面标记的抗体anti-CD29-PE、anti-CD34-APC anti-CD44-FITC, anti-CD45-FITC, anti-CD90-PE, anti-CD105-FITC, anti-HLA-DR-PE从BD Pharmingen(所有)。PBMCs通过离心收获coculture年底。CD4 + T细胞的增殖分析CFSE-incubated PBMCs都标有anti-CD4-PE (BD Pharmingen),细胞left-shifting成广场门口被公认为增殖细胞和细胞计数比例在这个门代表了增殖率。对Th17分析、anti-CD4-FITC anti-CCR4-PerCP-Cy5.5, anti-CCR6-APC BD Pharmingen(所有)。人类的调节性T细胞染色工具包(eBioscience)包含anti-CD4-FITC / CD25-APC鸡尾酒和anti-Foxp3-PE用于Treg分析根据制造商的指示。细胞在流式细胞仪测量系统(BD FACSVerse)。

2.6。仪珠阵列(CBA)

文化上层清液收集细胞因子测量使用CBA工具包(人类Th1 / Th2 / Th17工具包,BD Pharmingen)根据制造商的指示。细胞因子浓度作为PE荧光强度相对于标准曲线。

2.7。实时定量PCR (qPCR)

总RNA提取使用试剂盒试剂(技术)。互补脱氧核糖核酸的合成进行使用PrimeScript RT试剂盒(豆类)根据制造商的指示。执行qPCR LightCycler 480实时PCR系统(罗氏)使用SYBR预混料交货Taq(豆类)。PCR程序是30年代在95°C, 40周期的5 s在95°C,和20年代60°C。相对表达基因的mRNA水平变化进行评估 管家基因方法和规范化GAPDH。中使用的引物序列qPCR分析如下:il - 6:5′-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3′(向前),5′-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3′(反向);IL-17A:5′-TCCCACGAAATCCAGGATGC-3′(向前),5′-GGATGTTCAGGTTGACCATCAC-3′(反向);肿瘤坏死因子-α:5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′(向前),5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′(反向);干扰素-γ:5′-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3′(向前),5′-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3′(反向);GAPDH:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′(向前),5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′(反向)。

2.8。统计分析

数据被当作平均数±标准差。单向方差分析或 根据数据的类型以及使用。使用SPSS软件进行统计分析(SPSS Inc .)。一个 值小于0.05被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。表型鉴定和msc Trilineage分化

流仪分析用来确定表型msc的表面标记。MSC从不同的捐赠者都积极CD29、CD44, CD90、和CD105但消极CD34、CD45、HLA-DR,确认典型的MSC表型(图1(一))。成骨的、chondrogenic和脂肪形成的变异被成功诱导(图1 (b))。

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图1
msc的识别。(一)表型特征基于表面标记的数量。msc是积极CD29、CD44、CD90、CD105,但不利于HLA-DR, CD34、CD45。红线:背景荧光的同形像控制。蓝线:从选定的标记荧光强度。 设在:荧光强度。 设在:细胞计数。(b) Trilineage分化。
3.2。msc的增殖抑制CD4 + T细胞和ATRA这种抑制能力降低

CD4 + T细胞的增殖是根据测量荧光强度。0天PBMCs (noncocultured,而不是由CD3/28激活)组被定义为防扩散控制。当刺激CD3/28, CD4 + T细胞的增殖率非常高( %),这表明一个有效扩散。当cocultured msc、CD3/28-stimulated CD4 + T细胞的增殖抑制( ),但略高增殖率在ATRA-pretreated集团( 比DMSO-pretreated集团(%) %)( )。因此,抑制CD4 + T细胞的增殖能力ATRA-pretreated msc低于控制(图2)。

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图2
CD4 + T淋巴细胞的增殖率与CFSE孵化。(一)未激活的T细胞被用作控制。(b)在CD3/28刺激时,CD4 + T细胞的增殖率非常高( %)。当cocultured msc、CD3/28-stimulated CD4 + T细胞的增殖抑制,但略高增殖率在ATRA-pretreated msc ( 比DMSO-pretreated msc (%) %)。使用单向方差分析。 和 。
3.3。ATRA-Pretreated msc减少Treg,但增加Th17族群

的百分比CD3/28-stimulated Th17子集(Th17 /淋巴细胞)增加 %, % ( 由ATRA-pretreated msc)。ATRA预处理导致扩大Th17(数据子集3(一个)和3 (c)),但是控制DMSO溶液预处理没有造成Th17扩张而noncocultured组。的百分比CD3/28-stimulated Treg子集(Treg /淋巴细胞)降低 %, % ( ), % ( 分别由ATRA-pretreated msc) DMSO-pretreated msc。因此,msc Treg族群造成明显降低,ATRA预处理进一步减少了Treg子集( )(数据3 (b)和3 (d))。

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图3
ATRA-pretreated msc对Th17和Treg亚种群的影响。(c)的百分比CD3/28-stimulated Th17子集(Th17 /淋巴细胞)。(b和d)的百分比CD3/28-stimulated Treg子集(Treg /淋巴细胞)。使用单向方差分析。 和 。
3.4。白细胞介素- 6 (il - 6)的分泌和mRNA水平增加了ATRA预处理

我们只发现msc持续分泌的il - 6但CBA工具包的频谱内的其他细胞因子,il - 6的分泌增加了ATRA预处理以约时间的方式,并没有出现在DMSO-pretreated组(图4(一))。msc和PBMCs coculture的上层清液中il - 6水平明显增加了150倍,平均msc与il - 6水平或PBMCs ATRA-pretreated文化中单独培养,甚至高于相对DMSO-pretreated对照组( )(图4 (b))。这些发现在接触和非接触cocultures被发现。mRNA水平的il - 6在PBMCs没有明显改变,但它在msc急剧增加,表明il - 6诱导msc的coculture PBMCs主要是由msc分泌而不是PBMCs(图4 (c))。

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图4
il - 6水平在不同条件下的变化。(一)由msc分泌il - 6的浓度对不同预处理时间(1天,3天,5天)。的分泌时间(1天,3天,5天)预处理后不同,。配对 以及使用。(b)中的il - 6浓度coculture和noncoculture组。配对 以及使用。(c)相对信使rna数量显示il - 6的主细胞来源。干扰素- (d)的影响γ和肿瘤坏死因子-α生产的il - 6在msc。使用单向方差分析。 , , 。
3.5。肿瘤坏死因子-α和干扰素-γil - 6生产增加了msc

外源性肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ添加到培养基的msc预处理作用显著提高了il - 6的分泌msc。肿瘤坏死因子-α是更有效的比IFN -γ在移植与同等剂量il - 6生产( )。就像前面提供的结果,ATRA-pretreated msc产生的il - 6水平高于msc没有ATRA刺激(图4 (d))。

3.6。改变IL-17A细胞因子、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α由ATRA预处理

msc IL-17A增加产量,降低ATRA-pretreated组( pg / mL)与DMSO-pretreated集团( pg / mL) ( )(图5(一个))。干扰素-γ增加从 pg / mL pg / mL ( DMSO-pretreated msc),但降低了 pg / mL ( 由ATRA-pretreated msc(图)5 (b))。肿瘤坏死因子-α水平显著降低 pg / mL pg / mL ( ), pg / mL ( 分别)ATRA-pretreated msc和DMSO-pretreated msc(图5 (c))。这些发现在接触和非接触cocultures被发现。

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图5
分泌和基因转录IL-17A干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在coculture msc和PBMCs。(一)从CBA IL-17A分泌的结果。(b)干扰素——的结果γ从CBA分泌。(c) TNF -的结果α从CBA分泌。(d)的结果从qPCR IL-17A基因转录。(e)干扰素——的结果γ从qPCR基因转录。肿瘤坏死因子- (f)的结果α从qPCR基因转录。使用单向方差分析。 , , 。
3.7。基因转录IL-17A,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α

IL-17A的mRNA水平的变化,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α从PBMCs也测量。msc显著增加IL-17A基因转录,尤其是ATRA预处理组( )(图5 (d))。msc的mRNA水平增加干扰素-γ低,这是ATRA-pretreated组相比DMSO-pretreated组( )(图5 (e))。msc出人意料地增加肿瘤坏死因子的基因转录α即使在ATRA预处理组( )(图5 (f))。这些发现在接触和非接触cocultures被发现。

4所示。讨论

CD4 + T细胞也被称为辅助T细胞。我们的研究结果表明,msc抑制CD4 + T细胞增殖和抑制能力的ATRA-pretreated msc略弱于控制DMSO-pretreated msc。因此,ATRA可以影响免疫msc的本质通过调节辅助T效应细胞的比例。

我们最初的预期增加Treg子集和减少人口在msc cocultured PBMCs Th17子集。然而,我们观察到相反的结果。短暂,msc造成下降Treg子集和Th17子集的数量略有增加。类似的结果也出现了郭et al。23]。有趣的是,ATRA预处理进一步增强这些意想不到的变化。我们指出,ATRA预处理增加了由msc分泌il - 6和il - 6的水平与Th17程序。已经证实,il - 6抑制引起的亚群的生成TGF -β并造成T0倾斜Th17 [24]。因此,引发的Th17-skewing coculture可能是由增加il - 6的生产。

il - 6一直被公认为促炎细胞因子和治疗目标,因为il - 6和TNF -α和il - 1调节炎症在大多数情况下(25]。一些研究表明,阻断il - 6是一个有效的方法治疗(26,27]。然而,最近的随机、安慰剂对照试验表明,与il - 6受体-抗体阻断il - 6α没有有效的治疗(28,29日]。此外,没有观察到轴向改善患者在叫,对il - 6受体抗体,在多中心研究[30.]。目前,没有批准白介素-受体阻滞药治疗。msc产生的il - 6水平增加了150倍,当msc与激活cocultured PBMCs根据我们的结果,我们证明了il - 6的upregulation细胞接触独立。因此,我们旨在找出因素。我们选择肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ进行调查。首先,两个都TNF -α和干扰素-γ是古典促炎细胞因子和高架在各种炎症状态(31日]。其次,通过巨噬细胞条件培养液显著增加il - 6的分泌msc (32),TNF -α是巨噬细胞的初级生产。第三,干扰素,γ被确认为MSC刺激信号相关许可MSC的免疫调节33]。我们的数据表明,肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ显著作用增强il - 6的分泌msc、暗示的upregulation il - 6可能取决于环境介质和可能与msc的免疫调节。这些观察结果提出一个问题是否促炎和抗炎细胞因子il - 6的。il - 6的增加产量msc会加重损伤,如果il - 6是促炎的。但是根据我们之前的研究中,MSC输液是安全有效的治疗(3]。此外,ATRA预处理TNF -随后下降造成的α、IL-17A和干扰素-γ,公认的致病因子。综上所述,我们推测,il - 6分泌细胞因子通过msc是被动而不是主动应对炎症环境,和il - 6可能保护剂而非致病因素的发病机理。事实上,一些研究表明,il - 6显示抗炎性质(34- - - - - -36]。

更高频率的外围Th17和IL-17A已经检测到的患者与健康对照组(1,2]。在目前的研究中,我们发现IL-17A生产增加了msc。我们的研究结果还揭示了积极联系的mRNA水平IL-17A Th17族群。然而,我们观察到的减少IL-17A分泌ATRA-pretreated组与DMSO-pretreated相比对照组。这种不一致表明,ATRA造成的msc预处理Th17族群的扩张,但抑制Th17细胞的分泌活动。最近的一项多中心的临床试验表明,anti-IL-17A单克隆抗体secukinumab是有效的治疗(37]。因此,我们推测,Th17细胞的频率严重程度之间的相关关系并不显著,但Th17细胞的生理功能起着更重要的作用。我们的研究结果表明,ATRA预处理可以改善MSC灌注治疗的疗效是通过抑制IL-17A Th17细胞的分泌。

Kezic et al。38)表明,干扰素-γ恶化周边关节和轴向疾病小鼠模型。安倍et al。39)在小鼠模型中发现,调节干扰素-γ与强直性enthesitis有关。赵et al。40)表明,干扰素-γ显著激活HLA-B27基因的启动子。干扰素-γ也是一个活化剂或经典激活巨噬细胞的极化因子(M1),肿瘤坏死因子的主要来源-α(41]。因此干扰素-γ参与的发病机制和伴随的严重程度。在目前的研究中,而干扰素-γ由PBMCs分泌增加了DMSO-pretreated msc、干扰素-γ分泌抑制了ATRA-pretreated msc在mRNA和蛋白水平。因此,ATRA预处理可以提高MSC灌注治疗的疗效是通过下调干扰素-γ生产。

肿瘤坏死因子-α封锁是广泛用于治疗。在目前的研究中,我们观察到,TNF -α分泌显著地抑制了msc虽然没有发现这种变化在基因转录。有趣的是,ATRA预处理进一步增强抑制TNF -α分泌。这些结果表明msc、TNF -特别是ATRA-pretreated msc、高效α抑制剂。肿瘤坏死因子-α抑制剂作用的msc的主要机制可能是msc治疗的疗效。因此,ATRA可以用来进一步提高MSC输液治疗。

总之,我们的数据表明,(1)ATRA预处理影响msc通过影响免疫调节功能的CD4 + T细胞的增殖;(2)ATRA对msc预处理导致减少相关致病因子IL-17A干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α;(3)显著降低TNF -α可能是主要的机制MSC输液的患者的治疗效果和ATRA预处理可能进一步提高疗效;(4)il - 6由ATRA和环境促炎介质调节,它可以作为抗炎细胞因子,好像它会导致Th17族群的扩张。我们的发现可能会改善MSC灌注治疗的疗效。但进一步在活的有机体内研究需要确认这些语句。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

邓小平李和彭王同样贡献了这项工作。

确认

作者感谢经纬博士帮助流仪分析梁和Xinjun博士深刻的讨论。这项工作得到了国家自然科学基金(81271951和81271951)和工程技术研究中心综合诊断和治疗强直性脊柱炎的广东高等教育机构。

补充材料

补充材料包括:

补充图1:细胞因子分泌衡量在不同情况下CBA。msc分泌il - 6,几乎没有其他的细胞因子。共培养的msc和PBMCs, il - 6和IFN-γ明显高的生产,尤其是il - 6。这七个乐队站了七种不同的细胞因子检测频谱内的CBA工具包。细胞因子浓度的荧光强度呈正相关。

  1. 补充材料