文摘

与年龄相关的骨骼疾病,如骨关节炎和骨质疏松症,sarcopenia和肌纤维萎缩紧密相关。在这项研究中,我们分析了肌肉活检为了证明,在骨关节炎患者,骨赘形成和肌肉干细胞的再生性质相同的相关因素。特别是,由于免疫组织化学,标签然后透射电子显微镜和电镜下观察我们调查BMP-2肌肉干细胞活动的作用。骨关节炎患者免疫组织化学和透射电子显微镜让我们注意更多的肌肉细胞CD44阳性的卫星形成合胞体。此外,BMP-2评估的细胞质和细胞核周围的表达式原位分子特征的卫星细胞合胞体显示一个非常严格的相关性BMP-2表情和肌肉再生能力。总结,BMP-2越高表达在骨关节炎患者可以解释增加骨密度以及减少osteoarthrosic患者的肌肉萎缩。总之,我们的研究结果表明,控制生理BMP-2骨骼和肌肉组织之间的平衡可能会被视为一个潜在的目标在骨筋相关病理药理。

1。介绍

骨关节炎和骨质疏松症与年龄相关的骨骼疾病,同sarcopenia紧密相关,具体的肌纤维萎缩(1,2]。

骨关节炎是最常见的关节炎发病率增加,由于老年人的特点是whole-joint参与导致软骨损失,最终,联合失败(3]。受损的软骨被不成熟和屋里胶原纤维的混合物。软骨下骨失去涂料和直接受到不正常的压力,从而导致裂隙和修缮的僵化的骨形成广泛的混乱小梁模式(4]。

骨骼肌是能够干扰骨活动,虽然细胞和分子muscle-bone相声还不是很清楚(5]。Sarcopenia是由于一个重要的不平衡肌肉蛋白质和细胞合成和恶化,导致肌肉质量差。这个损耗强烈影响骨取向和影响流动和骨骼特性在骨质疏松和骨关节炎。我们知道,igf - 1,肌肉生长抑制素,TGF-b,每个因素释放在骨代谢和肌肉的作用反之亦然。潜在机制减少骨骼肌质量在sarcopenia收敛失败的卫星细胞替代和修复受损的肌肉纤维(6,7]。不管是否卫星细胞数量减少,它们的功能通常是减少老化。然而,降低卫星细胞功能的一个重要原因可能是改变系统性因素造成的影响和/或调节卫星细胞活性和分化8]。

CD44是一种跨膜蛋白,在信息交互过程中发挥作用和能动性等许多细胞类型的成肌细胞分化和融合。事实上,CD44在肌细胞生成年初起功能作用。Mylona等人表现出短暂的延迟后的修复局部损伤小鼠胫骨前肌CD44(−−)老鼠。在differentiation-inducing体外环境中,延迟肌管形成的主要成肌细胞CD44(−−)小鼠显示CD44的内在作用[9]。

骨形成蛋白(bmp)的转化生长因子β细胞因子超家族,。这些分子分泌生长因子,通常分类根据其结构性质;他们都已经被广泛地研究过了专注于能够诱导骨前体细胞分化(10]。

在本回顾性研究,我们分析了肌肉活检为了证明,在骨关节炎患者,骨赘形成和肌肉干细胞的再生性能BMP-2的表达相关。特别是,我们进行形态学和免疫组织化学研究探讨肌肉再生通过卫星细胞活动。标记允许我们然后此外,电镜下观察调查BMP-2表达之间的相关性和干细胞的形成合胞体和干细胞利基特征。

2。材料和方法

在这项研究中,我们收集了40肌肉活检:20活检的骨关节炎的女性(平均年龄 )接受全髋关节置换术(THA)并从骨质疏松性女性(平均年龄20活检 )和颈股脆弱性骨折(表1 和1 )。在开放手术治疗人工髋关节置换术的上部肌肉活检被股外侧肌下病人的知情同意(批准参考号码85/12,独立的伦理委员会“亲自Tor Vergata”)。

表1
(一)骨质疏松性患者的临床资料。(b)骨关节炎的患者的临床资料。

排除标准的患者肿瘤疾病的历史,肌肉疾病,或其他神经肌肉疾病,假设antiosteoporotic药物,皮质类固醇或慢性管理自身免疫性疾病(超过1个月)、糖尿病、酗酒、吸烟,香烟和病毒慢性感染(乙肝病毒、丙肝病毒和艾滋病毒)。

患者分为骨质疏松(OP)和osteoarthrosic (OA)根据用 由Kellgren-Lawrence量表评分和影像学评估。(表1 和1 )。

特别是在OP组脆弱的女性髋部骨折,a 分数≤2.5−SD,髋关节OA -射线框架都包括在内,而在OA组女性积极收音机髋关节OA Kellgren-Lawrence得分3或4 分数≥2.5−SD都包括在内。

2.1。骨矿物质密度评估测定仪)

与月球测定仪进行DXA对装置(美国通用电气医疗集团,麦迪逊,WI)。腰椎(L1-L4)和股骨(颈部和总)进行了扫描,并分析了弹道导弹防御(如前所述)(11]。利用双能x线骨密度仪测量BMD(克/平方厘米)的变异系数为0.7%。OA组,所有的测量进行以非惯用的一边,而参与者与四肢仰卧地躺在检查台上绑架远离主干。OP组,对面肢体骨折端的BMD测量。结果表示为绝对值。Harris髋关节评分(美国卫生和公众服务部)12受影响的一方是计算所有OA患者。

2.2。组织学

肌肉活检在4%多聚甲醛固定24小时,石蜡包埋。Three-micrometer厚部分被苏木精和伊红染色())和病理评价盲目是由两位病理学家(13]。

2.3。的形态学分析

为了评估纤维萎缩,至少200的肌肉纤维活检评估,比较最小直径和横截面积的I型和II型纤维相对普遍。一个阈值直径低于30μ米(最小值的正常范围为女性)萎缩性纤维特征(14,15]。

计算肌肉地区)幻灯片在20 x放大扫描Iscan Coreo(美国亚利桑那州图森市Ventana)。骨骼肌肉和结缔组织和脂肪组织通过为每个肌肉活检病理学家,并分析了图像浏览软件(美国亚利桑那州图森市Ventana)。

2.4。免疫组织化学

免疫组织化学特征进行驴肌纤维类型,也就是说,快和慢,肌肉生长抑制素的表达,表面抗原CD44和骨筋相声BMP-2等分子。

简单地说,3 -μ7.8米厚的部分是用EDTA柠檬酸预处理pH值30分钟在95°C,然后孵化,分别与小鼠单克隆anti-fast骨胳肌凝蛋白60分钟(1:100年,克隆我,AbCam),小鼠单克隆anti-slow骨胳肌凝蛋白60分钟(1:100年,克隆NOQ7.5.4D AbCam),兔单克隆anti-myostatin 45分钟(1:100年,克隆ab134682 AbCam),兔单克隆anti-CD44 60分钟(predilute、克隆SP37 Ventana公司,罗氏)。BMP-2 3 -μ6.0米厚的部分是用柠檬酸预处理pH值30分钟在95°C,然后孵化兔单克隆anti-BMP-2 60分钟(1:250克隆nbp1 - 19751,罗福斯生物制剂)(16]。清洗进行了PBS /渐变20 pH值7.6 (UCS诊断、罗马、意大利);反应是揭示了HRP-DAB检测工具(UCS诊断)。

2.5。西方墨点法

从股外侧肌活检(集中在每组10活检样本)在冰冷的均质裂解缓冲。匀浆离心机在12.000 g×15分钟在4°C总浮在表面的蛋白质的分离。蛋白质浓度测定皮尔斯BCA蛋白质化验设备(热科学皮尔斯蛋白质生物学产品,罗克福德,,美国)根据制造商的指示。四十μg /巷10% sds - page分离和转移到聚偏二氟乙烯膜(0.45μ美国m, Immobilon-P转移膜,微孔)。阻塞后,一夜之间,膜被孵化的主要抗体BMP-2(1: 500年,克隆nbp1 - 19751,罗福斯生物制剂),在TBST洗,然后用合孵化共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(UCS诊断)1 h。免疫反应性的信号是使用一个增强化学发光试剂盒(美国微孔)和暴露于柯达胶卷。相对与归一化蛋白表达计算GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶)。西方线强度被ImageJ评估软件。

2.6。透射电子显微镜(TEM)

小肌肉组织样品的每个病人在4%多聚甲醛固定,后缀四氧化锇在2%,和脱水系列孵化项目的30%,50%,70%乙醇。样品被嵌入在环氧树脂树脂(琼脂科学、斯坦斯特德埃塞克斯CM24 8英国女朋友)(17),形态超微结构的分析,在LR-White树脂(琼脂科学、斯坦斯特德埃塞克斯CM24 8英国女朋友),对超微结构的免疫组织化学。组织被削减(18)和沾染了重金属的解决方案如雷诺所述19]。

2.7。Immunogold标签

超薄LR-White嵌入部分,收集formvar碳涂层镍网格,在孵化滴1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐(PBS)包含0.02米甘氨酸和正常山羊血清在室温下30分钟(20.]。一夜之间,部分被孵化与兔单克隆抗体anti-BMP-2(1:克隆nbp1 50 - 19751,罗福斯生物制剂)在4°C。与PBS + 0.1% BSA几个洗后,网格是孵化20 nm二级antibody-gold粒子复杂(琼脂科学、斯坦斯特德埃塞克斯CM24 8英国女朋友)在1:10在PBS稀释0.1% BSA在室温下2小时。immunolabeling之后,部分用PBS + 0.1% BSA,蒸馏水洗,干,与醋酸双氧铀复染色。所有部分被日立7100 FA电子显微镜检查。

2.8。统计分析

使用GraphPad棱镜5执行统计分析软件(La Jolla、钙、美国)。免疫组织化学分析的数据Mann-Whitney测试( )。

3所示。结果

3.1。纤维成分和纤维萎缩的发生率

肌肉纤维束的形态学检查进行数字化扫描图像显示减少约20%的肌肉组织在OA和OP组(数字1(一),1 (b),1 (c))。

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图1
肌肉纤维组成和萎缩。((a)、(b)和(c))在OA患者肌肉流失的速度取代主要由脂肪组织(18.32%),而在OP肌肉萎缩的肌肉纤维束被脂肪(8.27%)和结缔组织取代(6.68%)。((d)、(e)、(f) (g), (h)和(i))在OA患者我们没有观察到显著差异在纤维类型萎缩,而在OP组我们观察到超过50.00%的萎缩性II型纤维的纤维与患病率(21.10% i型和II型39.20%)。

OA患者肌肉损失率取代主要由脂肪组织(18.32%)(图1(一)),而在OP肌肉萎缩性纤维取代了脂肪的混合物(8.27%)和结缔组织(6.68%)(图1 (b))。

慢肌球蛋白抗体和快肌凝蛋白抗体染色允许我们歧视I型和II型纤维,分别。肌肉纤维的形态测定分析OA患者显示,38.00%的萎缩纤维直径小于30μm (I型和II型20.10%)17.90%(数据1 (d),1 (e),1 (f))。在OP组中,我们观察到50.00%以上的萎缩性II型纤维的纤维与患病率(21.10% I型和II型39.20%)(数据1 (g),1 (h),1(我))。

3.2。BMP-2和肌肉干细胞活动

肌肉活检OA和OP患者并没有显示出特殊的肌肉病理的迹象。

BMP-2表达式被计数的数量评估积极纤维25-high权力领域(高通滤波器(图)2(一个))。BMP-2阳性纤维在细胞核周围的空间,显示了强烈的染色纤维体(图3 (c))。值得注意的是,我们发现OA肌肉活检显示数量明显高于BMP-2-positive纤维( ,205)与肌肉的OP患者( )(图2(一个))。通常情况下,我们观察到BMP-2阳性纤维脂肪组织或接近纤维变性区(数字3 (c)和3 (d))。

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图2
蛋白表达分析。疣状BMP-2,肌肉生长抑制素,CD44是评估通过计算阳性纤维的数量/细胞25-high权力领域(高通滤波器),而免疫印迹BMP-2被行测密度术评估。(一)值得注意的是,我们发现OA肌肉活检显示明显高于BMP-2-positive纤维的数量( )与肌肉的OP患者( )( )。(b)免疫印迹行显示更高的表达BMP-2 OA患者相比,OP组。(c)的肌肉生长抑制素阳性纤维OP患者相比,明显高于OA组( )。(d) CD44表达了明显不同的CD44阳性细胞在OA组与OP ( )。
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图3
BMP-2和卫星干细胞肌肉再生。((a) (b))苏木精和伊红部分的肌肉活检显示显著增加的脂肪组织在OA (a)与OP患者(b) (40 x)。(c)图像显示许多BMP-2阳性纤维(40 x)。OP患者通常,我们没有观察到BMP-2表达式(40 x) (d)。肌肉生长抑制素在OA -肌肉组织的免疫组织化学(40 x) (e)。肌肉活检显示高/ OP组中表达的肌肉生长抑制素(40 x) (f)反向BMP-2相关应用。卫星细胞CD44阳性组局部分散的组织(200 x) (g)高于OA患者中观察到OP患者(200 x) (h)。

免疫印迹分析BMP-2, OA和10 OP 10日执行随机选择样本,证实了免疫组织化学数据。事实上,我们观察到一个更高的BMP-2表达式在OA患者相比,OP组(图2 (b))。

肌肉干细胞活动被肌肉生长抑制素和CD44表达研究。肌肉生长抑制素阳性纤维的数量相比,OP患者明显高于OA组(图2 (b))。免疫组织化学分析表明,BMP-2阳性纤维对肌肉生长抑制素和不利反之亦然(数据3 (e)和3 (f))。

我们的结果显示一个明显不同的CD44阳性细胞在OA组与OP(图2 (c))。OA患者特别是,许多团体CD44阳性的卫星细胞局部观察组织(数据3 (g)和3 (h))。

3.3。透射电子显微镜(TEM)

TEM分析来确定卫星细胞根据其超微结构特征。在OA肌肉活检,我们发现几个卫星细胞通常位于正常和退化纤维之间(图4(一))。引人注目的是,这些细胞似乎是紧密关联的其中或融合形成合胞体。值得注意的是,在这些细胞的细胞质中,我们记录新创sarcomeric结构(生产数据4 (b)和4 (c))。在OP患者中我们发现许多退化地区和免疫细胞浸润(数字4 (d)和4 (e))。卫星细胞的数量很低,他们的利基市场显示明显的退化的标志(图4 (f))。

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图4
肌肉干细胞的透射电子显微镜分析。TEM分析来确定卫星细胞根据其超微结构特征。在OA肌肉活检,我们发现几个卫星细胞通常放置在正常和退化纤维之间。在卫星细胞合胞体(a)(箭头),我们观察到新创sarcomeric结构(箭头)的生产(10.000 x 50.000 x) ((b) - (c))。TEM分析OP患者肌肉活检显示许多退化地区(箭头)(2.500 x 5.000 x) ((d) - (e))。罕见的卫星细胞合胞体(箭头)明显退化的标志,如核异常和空泡形成,我们发现OP患者(5.000 x) (f)。
3.4。Immunogold标签

为了验证BMP-2之间的相关性和卫星细胞活动我们进行了超微结构的immunolabeling OA和OP肌肉组织。

在OA组我们发现卫星合胞体更常与BMP-2阳性纤维而(图5),我们没有发现任何关联BMP-2染色和卫星细胞在OP患者的肌肉。特别是高放大图片显示immunolabeling BMP-2在细胞核周围的区域(图5 (b)),线粒体(图旁边5 (c)),并在纤维体(图5 (d))。反应然后BMP-2的表达了一个电镜下观察卫星细胞在超微结构水平的合胞体OA肌肉活检显示一个严格的相关性BMP-2表达式和肌肉再生能力。

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图5
BMP-2表达的分子分析。为了验证BMP-2之间的相关性和卫星细胞活动我们进行免疫印迹和immune-gold分析。肌肉活检的OA患者我们发现几家大型卫星细胞合胞体(箭头)(a)。高的放大显示immunolabeling BMP-2细胞核周围的地区(广场)(40.000 x) (b)。BMP-2合胞体卫星细胞细胞质中表达分子(广场)和线粒体旁边(插入)(40.000和60.000 x) (c)。许多BMP-2纤维体内分子被发现(40.000 x) (d)。OP患者不表达BMP-2卫星细胞(10.000 x 40.000 x) ((e) - (f))。

4所示。讨论

骨关节炎软骨退化矩阵在一起的特点与生产新的结缔组织形成骨赘的节理面或更多尤其是在联合利润。《盗梦空间》刺激没有即使机械定义负责骨赘形成和体液因素可能参与其中。在OA的实验模型,注射TGFb小鼠关节BMP-2诱导或增强骨赘的形成。一些研究调查每个位置的角色分化因素在骨组织再生(21,22]。事实上,BMP-2骨折后立即调节,它可以检测到在骨再生的整个过程23,24]。相反,每个位置的角色在骨骼肌生理病理学仍然是有争议的。小野et al。25持续,肌原性的前体细胞分泌最佳管理(如BMP-4)为了抑制卫星干细胞的分化成新的肌肉纤维,而Sartori集团(26]建立了BMP信号是不可缺少的积极监管成人肌肉在正常和病理情况。

在这项研究中,我们选择从OA肌肉活检的妇女接受了那和OP的女性宫颈股脆弱性骨折。

根据以前的数据(2)的形态学特征的肌肉活检显示出更高比例的萎缩性纤维在OP患者对OA组。至于肌肉神经束的组织成分,OA患者表现为肌肉纤维的高脂肪替代。的存在更大数量的脂肪组织在OA受试者临床对应于已经提到增加BMI和更高的功能障碍。事实上,超重和随之而来的联合错乱排列影响关节和加速变形和退化。

这些初步clinical-morphometric数据允许我们假设BMP-2表达在骨和骨骼肌组织的OA患者通过卫星产生骨赘形成和肌肉再生肌肉细胞。

我们的研究结果表明,肌肉组织的年龄OA患者经常表达BMP-2接近退化区域或脂肪组织。事实上,这些分子的表达明显高于OA患者相比OP组。

值得注意的,在我们的肌肉活检,BMP-2表达式模式描述的是类似于骨活检。事实上,OA患者的骨微环境通常指的是BMP-2[增长5倍27]。此外,肌原纤维有很强的积极性内BMP-2细胞膜不表达肌肉生长抑制素、转化生长因子β蛋白家族中的一员,抑制肌肉分化和生长28),而反之亦然。

众所周知,肌肉卫星细胞在成年人口作为储备细胞能够增殖反应损伤(29日]。

为了更好地定义一个卫星细胞激活和BMP-2我们之间可能的相互作用研究CD44受体。这个膜分子参与卫星细胞迁移,融合,合胞体形成能力所需的新的肌肉纤维的形成29日]。我们的研究结果表明大量的卫星细胞CD44抗原OA患者。总之,这些数据,BMP-2高、低肌肉生长抑制素,和高CD44的表达,表明BMP-2的积极作用肌肉再生。给这些免疫组织化学数据我们执行一个强度与immunophenotype表征标签然后在电镜下观察超微结构的研究。

组织的超微结构分析有很强的积极性BMP 2 (OA患者)允许我们确认的高速率的单卫星细胞和卫星细胞形成合胞体。相反,在bmp表达较低的肌肉和肌肉退化方面(OP患者)我们报道稀疏,单身,也不是融合卫星细胞。此外,BMP-2的表达反应在细胞核周围的区域,然后通过超微结构的电镜下观察纤维体内的卫星细胞合胞体表明严格BMP-2表达之间的相关性和肌肉再生能力。

总结,BMP-2越高表达在骨关节炎患者可以解释增加骨密度以及减少osteoarthrosic患者的肌肉萎缩。特别是,我们证明BMP-2诱导骨骼肌干细胞再生通过激活卫星。这证据让我们假设内分泌肌肉组织和骨骼疾病的失败是严格相关。

5。结论

的发现卫星肌肉干细胞的活性和骨重建相同的因素可能会揭示相关的分子机制更相关的骨筋相关疾病的老年人,如sarcopenia、骨关节炎和骨质疏松症。诊断和治疗的角度来看,控制生理BMP-2骨骼和肌肉组织之间的平衡可能被视为一个新的药理的目标。

信息披露

原始研究论文尚未发表和出版没有被视为在任何语言整体或部分除抽象。所有作者都同意提交在当前(和随后的)形式。

利益冲突

没有任何潜在的利益冲突相关的论文,也没有单位以外的来源支持这项研究。

作者的贡献

Manuel Scimeca和埃琳娜·布莱诺同样导致了工作。

确认

作者承认ASI(意大利航天局)和罗马大学“Tor Vergata”(空间生物医学中心)资助这项研究。非常重要的利用ASI的资金可用,因为它鼓励我们目前的项目名为多学科研究和进一步研究微重力的影响骨细胞呼叫号码搜索dc - dte - 2011 - 033。此外,他们要感谢塞Rossato(罗马Tor Vergata大学)在规划阶段的工作有益的讨论。