文摘

间充质干细胞(msc)是一个有吸引力的来源的临床细胞治疗肝损伤。虽然使用成人血清血小板溶解产物,或脐血血清解决的一些问题引起的胎牛血清的边后卫,同种异体免疫反应,污染,和donor-to-donor donor-to-receptor差异仍然阻碍msc的应用。在这项研究中,自体血清的影响从liver-injured老鼠(LIRs)和同种异体血清健康大鼠骨髓msc的隔离和文化(bmsc)检查和比较的边后卫。结果表明,综合培养与自体血清或同种异体血清优于MSC-specific形态、降低细胞衰老的速度,比那些更高的增殖动力学的边后卫。此外,自体血清促进成骨分化潜能的bmsc同种异体血清。虽然在核扩散活动没有明显差异,immunophenotypic特征和分化之间潜在的bmsc与自体血清和同种异体血清培养,潜在的免疫不良反应患者的同种异体移植的材料必须被考虑。因此我们相信liver-injured患者自体血清MSC扩张可能是一个更好的选择以满足肝损伤治疗的需要。

1。介绍

间充质干细胞(msc)被Friedenstein和他的同事在1987年第一次描述了(1]。msc具有multilineage分化、自我更新,抗炎、免疫抑制功能,和移民潜在的(2- - - - - -4]。潜在的治疗,msc可以分化为骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、内皮细胞、肺上皮细胞、肝细胞、神经元和促进受损组织的修复(5,6]。此外,各种因素,如白细胞介素- 6 (il - 6)、白细胞介素- 10”(il - 10)、巨噬细胞集落刺激因子(csf)、前列腺素E2 (PGE2)和肝细胞生长因子(HGF),由msc可以刺激分泌内源性组织祖细胞的增殖和分化,减少炎症和免疫反应5]。

满足各种需求的治疗,获得高质量的MSC是必不可少的。急性心肌梗塞,例如,金和他的同事们发现,第一代的msc最好治疗效果在小鼠模型相比,第五段的(7]。尽管研究人员可以扩大足够MSC在良好生产规范(GMP)年级、不一致的干细胞效力,可怜的细胞移植,和年龄/疾病宿主组织损伤不可避免地遇到了MSC治疗(8]。因此有必要开发一个适当的文化系统在体外允许的稳定扩张干细胞临床应用。

血清是细胞培养中不可缺少的一部分,和胎牛血清(的边后卫)是使用最广泛的血清对MSC的文化。然而的边后卫,作为动物血清,可能是一个潜在的微生物污染物来源,如真菌、细菌、支原体、病毒、朊病毒,不同批次的血清显示定量和定性的变化他们的作文9]。此外,不良免疫反应引起的异源血清是一种障碍,应该考虑10,11]。一些新颖的文化补充,如成人血清血小板溶解产物,脐带提取、脐血血清,与理想的测试结果(12- - - - - -16]。为了避免交叉污染和同种异体移植引起的免疫反应,我们试图应用自体msc肝损伤治疗补充文化。

血小板溶解产物和脐血血清含有生长因子含量高于的边后卫或成人血清(16- - - - - -19]。这些生长因子可能发挥重要作用在维护msc的属性。同样,一些生长因子的内容,如胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和血小板源生长因子BB (PDGF-BB),更高的血患者比健康的人的血(肝损伤20.,21]。基本成纤维细胞生长因子的水平(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和HGF在受损肝组织(高22- - - - - -24]。这些因素也会影响MSC增殖和属性。

在这项研究中,自体血清和骨髓间充质干细胞(bmsc)从同一liver-injured鼠(LIR)是用来评估的可行性,利用自体血清作为替代的边后卫在bmsc文化。从健康大鼠同种异体血清是用作控制证明自体血清bmsc文化的优越性。

2。材料和方法

2.1。动物

成年雄性Wistar鼠体重200 - 220 g从吉林大学动物中心购买。所有的老鼠都安置在房间保持在恒定的温度和湿度与12/12 h光/暗周期根据吉林大学建立的指导方针。实验过程都是吉林大学动物委员会监督委员会批准。

2.2。准备的自体血清和同种异体血清

在大鼠肝损伤是引起腹腔内管理单一剂量的0.5毫升四氯化碳(三地₄)每公斤体重25]。CCl后第四天₄管理、麻醉大鼠()按顺序用75%的酒精消毒和聚乙烯吡咯酮碘。老鼠血液是通过下腔静脉,然后老鼠牺牲。每个大鼠肝组织后被剪的牺牲和存储在福尔马林后续实验。的股骨和胫骨LIRs分离,肌肉组织被取消。整个血液样本注入15毫升无菌管没有抗凝和孵化37°C 30分钟或直到凝血的发生。血清被离心分离10分钟的3000克。随后,使用0.44上层清液的过滤μ过滤器(BD生物科学,圣何塞、钙、美国),转移到新的15毫升无菌试管,储存在4°C。健康的老鼠()受到相同的程序准备同种异体血清。

2.3。组织和文化的bmsc LIRs

综合了如前所述[26]。首先,股骨和胫骨的骨髓与磷酸盐(PBS)中被淘汰了。细胞来自同一只老鼠被分成三个相等的小分支,离心机在1500 g 5分钟15毫升无菌管,和resuspended 2.0毫升的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM):营养混合物F-12 (DMEM / F-12;生命技术公司,马里兰州,美国)补充10% (V / V)自体血清(AuSM),同种异体血清(AlSM),或的边后卫(HyClone,澳大利亚;FSM)。resuspended细胞接种到6-well板块(美国康宁公司)包含不同的媒体和孵化37°C在湿润的气氛中含有95%的空气和5% (V / V)二氧化碳(有限公司₂)。72 h后所有不依从细胞被移除。当这些主要文化达到~ 70%融合,这些细胞被主文化亚文化具有相同的介质中使用。

2.4。评估Senescence-Associatedβ牛乳糖(SA -β加)染色

从不同的介质通道4 (P4) bmsc被播种到6-well盘子1×10的密度⁵细胞/。24小时后文化,SA -细胞被染色β使用SA -加来检测细胞衰老β加工具包(Beyotime,北京)按照制造商的指示。衰老细胞与光学显微镜观察和计算三个随机领域的视野。

2.5。扩散动力学

综合使用不同的补充剂被数的扩张和通道融合的70 - 80%。在每个通道,人口倍增率(PDR)和人口倍增时间(PDT)测定根据以下方程:和,在那里是种植细胞数,在收获细胞数量,然后呢是在文化。计算累积人口翻倍(CPD),每个通道的PDR决心,然后添加到前面的段落。

同时,bmsc生长曲线的扩展与上述三种不同的补充剂在P4开始。细胞种植在24-well板1×10⁴细胞/厘米²和三个井使胰蛋白酶化(胰蛋白酶/ EDTA (0.25%);生命技术公司,马里兰州,美国),计算每24小时7天。

2.6。Immunophenotypic分析

Immunophenotypic bmsc的分析不同的文化媒体在P4以前公布的协议后27]。孵化后,细胞和抗体治疗,包括anti-rat CD44, CD73, CD90、CD34、CD45 (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。最后,流式细胞仪石中剑流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)配备电池追求专业分析软件(BD生物科学)是用来分析表型。

2.7。在体外分化分析

测试分化成脂肪形成的细胞和成骨细胞,P4 bmsc被视为前面描述的(27]。三周后归纳文化脂肪形成的或成骨的媒介,细胞被沾油红O(奥罗)或茜素红S相应地(ARS)。ARS的光学密度和奥罗测量在405和520海里,分别为(28]。

2.8。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。多重比较分析了两组克鲁斯卡尔-沃利斯非参数检验。所有由SPSS统计分析软件套件(V19.0窗口;美国SPSS, Inc .,芝加哥,IL)。一个双边< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。CCl的验证₄全身急性肝损伤

苏木精和伊红())染色肝组织切片来验证在大鼠急性肝损伤的感应。发现了大量空泡的,脂肪和水肿的退化在肝脏的老鼠收到CCl剂量为0.5毫升₄每公斤体重(图1(一))。这些特性是伴随着vacuole-shaped细胞质、核破裂在细胞核固缩、核溶解对健康大鼠的肝脏组织的组织病理学形态(图1 (b))。这些观测结果符合急性肝损伤的组织学特征。

3.2。形态和发展趋势

在主文化中,少量的短梭形细胞爬进一个轮生的架构后培养3 - 5天(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。在这一点上,没有明显的差异不同的培养基。延长培养时间、长梭形细胞的大小和数量增加(数据2 (d)- - - - - -2 (f))。细胞培养的自体血清(图2 (e))和同种异体血清(图2 (d))出现更小更纺锤形,细胞培养的边后卫显示大的细胞大小和更多的不规则形态(图2 (f))。

我们能够成功地扩大了细胞与不同媒体P0 P6。开始在P4, FSM-incubated bmsc失去spindle-like形状和显示一个更大、更平坦,和不规则形态,而AuSM-incubated和AlSM-incubated bmsc保留更长时间的纺锤状形态,不显示相同的增长模式FSM-incubated的P4到实验的最后(数字2 (g)- - - - - -2(我))。

3.3。衰老的分析

为了检测不同形态变化伴随着不同程度细胞衰老,SA -β加染色是用于检测bmsc的P4。有明显的区别在AuSM bmsc培养或AlSM与FSM(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。衰老细胞的百分比在AuSM AlSM,分别为0.085±0.015,0.093±0.017,而在FSM 0.186±0.021(图3 (d))。

3.4。扩散活动

检查扩散活动的CPD和PDT bmsc培养在不同媒体进行比较。CPD值计算为所有段落比较不同的补充剂对msc的扩张能力的影响。数据显示CPD明显高于bmsc培养时AuSM或AlSM而不是在FSM(图4(一))。我们也比较不同代的PDT和发现AuSM-incubated AlSM-incubated bmsc显然短PDT从P2到P5(图4 (b))。这些数据表明,bmsc培养AuSM或AlSM显示增加增殖的潜力。AuSM-incubated之间没有明显差异,AlSM-incubated bmsc。

进一步阐明不同培养基对细胞增殖的影响,msc在P4的增长曲线开始为不同品牌的边后卫(;网上看到补充图S1的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/459580和所有的文化条件;图4 (c))。不同品牌的的边后卫的结果表明没有明显差异bmsc培养与HyClone的边后卫(澳大利亚维多利亚),Gibco(美国),或BioInd(以色列)。不同文化条件下的数据表明,AuSM-incubated AlSM-incubated msc粘附率较高和较短潜伏期在第一天。AuSM-incubated和AlSM-incubated msc达到最终的细胞计数12.71±1.72,12.19±1.45,分别在7天。相比之下,FBS-incubated msc达到细胞计数仅5.89±0.878 7天。因此,AuSM或AlSM高刺激的影响msc使它们乘12 7天内而不是6倍扩大观察的边后卫在相同的时间跨度。考虑到AuSM和AlSM烧瓶近5天达到融合,这些细胞的增殖可能更高,如果提供一个较低的播种密度和更大的增长领域。

3.5。Immunophenotypic特征

选定的表面标记物的表达CD44, CD73, CD90、CD34、CD45评估使用流式细胞仪。bmsc培养在AuSM、AlSM或FSM的总分析前三个段落。的细胞为阳性CD90、CD73和CD44和消极CD34、CD45(图5)。没有显著差异表达的表面标记根据不同的文化条件()。

3.6。分化潜能

分化的潜能是msc的最重要的一个特征。msc的属性可以通过分析评估其潜在区分脂肪形成的和成骨的血统(29日]。在这项研究中,P4 bmsc的脂肪形成的和成骨的能力培养在不同的媒体因此相比。去证实了脂质空泡的形成彩色的奥罗(数字6(一)- - - - - -6 (c)),而成骨分化是由沉积矿化的矩阵表示的沾ARS(数字6 (d)- - - - - -6 (f))。成功来自媒体观察msc诱导分化培养,AuSM AlSM, FSM。

确定分化潜力改变,染料的吸收光谱分析进一步量化。数据显示,AuSM-incubated和AlSM-incubated bmsc比FSM-incubated的矩阵可以产生更多的脂质空泡(图6 (g)),而没有发现显著差异在不同细胞的成骨诱导培养基培养后各种条件(图6 (h))。此外,没有发现显著差异的脂肪形成的和成骨的能力bmsc孵化AuSM AlSM。

4所示。讨论

multilineage属性的分化潜能,自我更新,并根据环境因子分泌,msc是理想的种子细胞对很多疾病的治疗,包括心肌梗塞、脑和脊髓损伤,肾脏损害(5,7]。因为肝移植的器官短缺和缺乏其他有效的治疗方法,MSC治疗肝脏疾病(也成为新的希望6,30.]。然而,大多数的msc栽培的边后卫,与临床应用相关的一些限制,如朊病毒和病毒传播,与异种的组件不良免疫反应和交叉污染(31日]。一些研究检测人血清、血浆、血小板溶解产物,脐带提取,脐带血血清替代品的边后卫和发现这些替换可以显著刺激msc的增殖12- - - - - -18]。尽管如此,所有这些以前的协议使用同种异体材料,而细胞中符合病人的内部环境可能导致更好的治疗效果。人们需要移植治疗患病的状态,所以我们试图评估自体血清对bmsc的形态和行为的影响相比,同种异体血清的边后卫。

马和他的同事们已经表明,msc扩大与脐血血清显示更少的细胞质流程和留住他们的纺锤状形态在长期文化比那些扩展的msc的边后卫(16]。在这项研究中,急性肝损伤大鼠模型成功建立,和bmsc与不同血清培养获得的。正如预测的那样,大多数企业综合培养与自体血清或同种异体血清保持轴的形状为长时间比栽培的边后卫。

尽管bmsc具有自我再生的能力,衰老和自发的分化,这可能导致研究结果之间的矛盾,在bmsc扩张中是不可避免的事实在体外(32- - - - - -35]。此外,衰老可能产生自发的恶变,严重影响临床应用msc (36]。许多研究已经证实,大大影响使用的介质类型的msc扩张形态、增殖,通道数,clonogenicity和分化潜能37,38]。达尔和同事确认,bmsc扩大自体血清往往产生更加一致的基因背景和DNA甲基化模式(39]。为了检测血清对BMSC衰老,SA -β加染色。数据显示bmsc培养AuSM和AlSM显示低的比例比在FSM衰老细胞。结果,与之前的研究一致(39),表明自体血清和同种异体血清可能更好的补充稳定bmsc的文化。

多数临床细胞治疗需要大量的细胞,也就是说,> 2×10⁶细胞每公斤体重(18,40,很难产生足够的msc (41]。研究人员一直试图找到一个安全、高效的协议扩大msc,它已经发现,人类自体血小板溶解产物从不足70毫升的全血可以满足扩张需求42]。在这项研究中,我们已经表明,自体血清和同种异体血清对bmsc增殖效果明显高于的边后卫,7日内提供解释为留学生和扩张的边后卫在相同的时间跨度。此外,bmsc培养AuSM和AlSM揭示更高的CPD和PDT的更少。所有这些事实使得MSC扩张自体血清和同种异体血清有吸引力的候选人在临床的设置。所需的大量的msc移植可以在很短的时间内实现。大约3 - 4毫升的自体血清可以获得一个老鼠,和血清,约1.5×10⁶bmsc可收获。根据这一模型,2×10⁸bmsc,足够的肝损伤的药物治疗可以获得约150.0毫升的自体血清。

除了呈形态、特定表型分化潜力的其他两个基本属性是bmsc识别(29日]。本研究的数据表明,之间没有显著的不同表型标记bmsc从各种媒体。此外,bmsc培养AuSM和AlSM保留他们的分化成骨的能力和作为FSM-incubated的脂肪形成的血统。结果表明,文化与自体血清和同种异体血清隔离和传统文化的本质并没有改变bmsc的方法(43]。

在这项研究中,自体血清和同种异体血清增强bmsc的脂肪形成的差异化脐带血清,虽然他们并不影响成骨分化(28]。彭和他的同事们发现,msc密切相关细胞的分化潜力大小和密度,和较小的msc和高细胞密度可能会导致高脂肪形成的分化(44]。如我们所示细胞生长研究,综合培养AuSM和AlSM较小的细胞大小和高细胞密度以及高脂肪形成的分化。所以我们相信bmsc培养自体血清和同种异体血清有更好,更适合干细胞疾病治疗。

虽然没有显著区别自体血清和同种异体血清增殖活动,immunophenotypic特征和分化潜能,病人的潜在不良免疫反应和同种异体材料必须考虑移植。此外,自体血清培养系统更符合自体移植的概念。所以从liver-injured患者自体血清BMSC的可能是一个更好的选择比同种异体血清治疗。

5。结论

同种异体血清,自体血清能促进增殖和减少bmsc的衰老。此外,bmsc培养AuSM保持更好的干细胞形态和表现出更高的潜力脂肪形成的差异化,在FSM的比较。此外,考虑到潜在的同种异体免疫不良反应材料和自体移植的概念,似乎从身体liver-injured自体血清肝损伤治疗的最佳补充。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Qinglin张和荀太阳这个研究做出了同等的贡献。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81270529),吉林省科学技术振兴机构(20120935和20120935号)。

补充材料