文摘

衰老和久坐不动的生活方式现在很常见,而且与慢性疾病的增多有关。因此,体育活动推荐三个健康行为的因素之一,在卫生预防发挥着至关重要的作用。在目前的研究中,我们饶有兴趣的是,是否身体活动的数量和潜在的影响从骨髓间充质干细胞BMMSCs。在这项研究中,前不久雄性C57Bl / 6小鼠训练在跑步机上以进步的速度超过5周的时间。对比行使(特异)和久坐不动的动物组织透露(i)明显高于前的msc动物,(ii)碱性磷酸酶(ALP)活性升高,(3)提高水平的骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCL)和骨髓腔(iv)减少脂肪。获得的结果支持这一观点,可能交货间充质组织的再生起到了重要的作用。因此,交货可能代表一个小说,非药物的战略减缓与年龄有关的肌肉骨骼功能下降。

1。介绍

骨髓(BM)包含不同种群的发育早期的干细胞/祖细胞,包括内皮祖细胞(epc),非常小的胚胎干细胞/ epiblast-like (VSELs)造血干细胞(hsc)和间充质干细胞(msc) [1]。多功能细胞存在于成人骨髓msc,脐静脉,和脂肪组织具有增殖能力和分化成不同的间充质细胞谱系,包括脂肪细胞,软骨细胞,骨细胞(2- - - - - -4]。这些干细胞数量是由各种分子的表达,包括CD90、CD105, CD73,没有如CD34、CD45标记(5]。MSC分化潜能和旁分泌的影响使他们成为一个有吸引力的候选人组织修复和再生医学。msc显著影响再生过程中通过各种机制,例如,合成和分泌的膜囊泡(MVs) [6,7]。越来越多的证据表明,从骨髓msc在某些疾病的临床应用导致成功的受损组织再生(8]。增加骨髓msc的机制仍然知之甚少。因此,寻找有效的非药物方法,将大大增加骨髓msc的总数可能代表一个有用的组织再生的策略。

积极的生活方式提供了许多生理以及心理上的好处。许多疾病,如心脏病和II型糖尿病,已报告与有限的体育活动。因此,不同类型的练习建议作为一项预防措施,例如,高度的有氧耐力训练程序或温和的练习。他们每个人似乎行动在不同生理水平,包括改进的免疫和/或内分泌系统。虽然没有研究有关的机理解释的练习对健康的积极作用,它已经表明,练习积极与增加红细胞的内容(9,10)和增强抗病能力通过改善免疫功能(11]。反过来,适度的运动被报告为一个因素,可以提高免疫功能(12),而剧烈运动可以减少免疫反应,导致淋巴细胞浓度,降低自然杀伤细胞活性、淋巴细胞增殖(13]。此外,发现运动显著减少细胞凋亡,改善骨细胞的可行性,为研究使用一个osteopenic鼠模型(14]。这是青少年个人观察强化练习增加腰椎和股骨的骨密度15]。进一步,练习,通过生物力学刺激的骨墙,可以起到预防作用在骨吸收和形成16]。

集体的数据表明,体育锻炼是一种非药物因素,积极影响寿命,代谢疾病的预防,和干细胞动员(17- - - - - -19]。因此,在目前的研究中,我们主要集中在(我)定量分析骨髓msc的总数,(2)定量分析的早期和晚期的标志骨成骨细胞前体,和(3)评价股骨矿化过程的老鼠暴露在耐力运动训练。

2。材料和方法

2.1。动物和锻炼培训协议

久坐不动的(SED)和exercise-trained(特异)C57Bl / 6小鼠(4周)保持每笼在一个超净设施通风三架住在动物实验室(波兰弗罗茨瓦夫医学院,Norwida 34)。老鼠维持在12 h光暗周期22±0.2°C。实验项目与当地动物实验伦理委员会的同意。分配给实验动物组每组动物(6)分为久坐不动的动物,没有进行身体活动(SE),和动物运动耐力(特异)。动物是exercise-trained (每周3天(d /周)(周一、周三、周五)5周使用一个exe 3/6跑步机(哥伦布仪器,哥伦布,哦,美国)。后来,5-wk进步运动使用的协议。培训开始在14米/分钟45分钟(第1周),并逐渐增加到24米/分钟45分钟(周5)。之前的培训部分协议总是在10米/分钟10分钟热身,随后5分钟冷却在10米/分钟如前所述20.]。久坐不动的控制老鼠()暴露在跑步机,但不接受培训。采样后进行了最后的训练。骨骼(包括股骨和胫骨)收集,肌肉和脂肪的解剖,刷新1毫升Iscove修改杜尔贝科的介质(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)与2%的边后卫(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)骨髓细胞隔离。

2.2。流式细胞仪msc的准备

小鼠跨国公司(单核细胞)是无菌的隔绝大英博物馆,还是C57BL / 6小鼠。骨髓细胞悬浊液,孤立的冲洗股骨和胫骨,细胞溶解在BD赖氨酸缓冲区(美国BD生物科学,圣何塞,CA)在室温下15分钟,洗两次磷酸盐(PBS)。以下anti-mouse抗体(BD Pharmingen)被用于染色:anti-CD45 (allophycocyanin-Cy7克隆30 f11) anti-CD45R / B220 (PE、克隆RA-6B2) anti-Gr-1 (PE、克隆RB6-8 C5) anti-T-cell受体-αβ(PE、克隆h57 - 5970), anti-T-cell受体-γδ克隆GL3 (PE), anti-CD11b (PE、克隆M1/70) anti-Ter119 (PE、克隆ter - 119),和anti-Ly-6A / E(也称为本来,生物素,克隆e13 - 161.7,与链霉亲和素共轭PE-Cy5)。msc(本来+ /林−/ CD45 / CD31−−/ CD51 +)被孤立的多参数live-cell排序(流入,BD),如前所述[21]。单克隆抗体(mab)用于本研究增加了在饱和浓度。30分钟的细胞被孵化冰不同anti-mouse单克隆抗体,洗了两次,在染色缓冲resuspended 5×10的浓度⁶细胞每毫升。样本分析LSR II流式细胞分析仪(BD生物科学,山景、钙、美国)。以下anti-mouse马伯买来BD Pharmingen (CA)圣地亚哥:Ly-GA / E (FITC,本来就克隆D7)、谱系标记(CD45R(也称为B220)、PE、克隆RA3-6B2), Ly-6G / Ly-6C (PE、克隆RB6-8C5), t细胞受体b (PE、克隆h57 - 597), t细胞受体cd (PE、克隆GL3) CD11b (PE、克隆M1/70) Ter119 (PE、克隆ter - 119), CD51(与链霉亲和素生物素,克隆RMV-7,共轭PE-Cy5作为二级Ab), CD31 (APC,克隆390),和CD45 (APC-Cy7克隆30-F11)。结果是代表三个独立的实验。

2.3。Multipotency化验

细胞被播种在24-well板块2×10的浓度⁴细胞每口井和随后脂肪形成的,chondrogenic和成骨分化进行。msc的刺激进行使用StemPro脂肪形成,软骨形成,骨分化工具包(生命技术、波兰)(StemPro脂肪形成分化装备,StemPro软骨形成分化装备,和StemPro成骨分化工具包)根据制造商的指示。的分化开始后24 h接种和细胞培养14天。媒体改变了每三天。脂肪形成的阶段,chondrogenic和成骨分化的msc是评估使用特定染色:油红O (Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)检测中性脂质沉积,番红精O (Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)葡糖氨基葡聚糖染色,和茜素红(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)钙沉积。准备工作进行了分析使用Axio观察者A1倒置显微镜(Axio观察者A1,卡尔蔡司,耶拿,德国),而文档使用大炮博秀相机。

2.4。CFU-Fs化验

化验克隆形成单位成纤维细胞(CFU-Fs)准备根据贝克协议前面描述的et al。20.]。来自骨髓msc(200细胞)的运动(和久坐不动的动物)被镀在collagen-coated 35毫米组织培养板。文化的补充αmem 15%的边后卫,青霉素,链霉素,细胞保持文化14 d。接下来,细胞用4%多聚甲醛固定10分钟,随后沾0.5%结晶紫(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)在20%甲醇为5分钟。只有20聚合细胞或组成的殖民地被算作CFU-Fs。所有实验进行了一式三份。

2.5。组织学和免疫组织化学

肱骨的所有动物都是固定的(PBS甲醛4%,48小时;Sigma-Aldrich),由EDTA脱钙(Osteosoft,默克密理博)37°C 5天,并与PBS冲洗。所有样本脱水乙醇梯度增加50%,60%,70%,80%,96%,100%。然后,嵌在石蜡样本,如前所述[22]。样本分组横向(HM 340 e, Microm)厚度10μ米,干、水化酒精系列和苏木精和伊红染色(英国热科学、Lutterworth)。下一个样本脱水和盖玻片下安装。幻灯片是由光学显微镜检查(Axio,蔡司)。骨内膜的厚度测量和规范化的照片。免疫组织化学,6μm石蜡包埋部分被放置在胶板在37°C和干24小时。样本然后deparaffinized二甲苯和酒精系列的患者降低浓度。想象系统(Dako)被用来可视化抗原抗体反应。兔子anti-CD105 (Abcam,剑桥,英国)主要使用单克隆抗体。所有抗体稀释根据制造商的指示。图像被使用大炮博秀相机。

量化CD105阳性染色进行了使用计算机辅助图像分析与基于java的开放源码的图像处理软件ImageJ v1.48c。图像分析进行六个随机选择先前捕获的图像。分析包括颜色阈值方法,二进制转换,和活跃的地区使用的测量测量插件和表达为阳性染色的百分比/形象。

2.6。成骨、脂肪形成的msc分化

骨生成,使用MSC盘子的一半。第一段后,细胞被置于24-well文化板块在浓度为1.5×10⁵每口井的细胞和培养成骨的介质(StemPro成骨分化工具包,生活技术)。成骨分化开始接种后24小时,21天后完成。文化媒体改变了每三天。除了成骨分化,脂肪生成化验也执行。这些细胞被维护αmem, 15%的边后卫,青霉素和链霉素,14天。量化脂肪形成,细胞被沾油红O (Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国),筛选了异丙醇。代表图像捕获使用Axio观察者A1(蔡司,从)。为定量分析,吸光度测量在490海里,与100%乙醇使脱色后20分钟。

2.7。扫描电子显微镜和能量色散x射线能谱(SEM-EDX)分析

肱骨在2.5%戊二醛固定一个小时,在蒸馏水洗,脱水乙醇分级系列,气急败坏的说用金(ScanCoat 6,牛津),并使用扫描电子显微镜成像(EVO LS15,蔡司)在10 kV丝的张力。此外,标本准备EDX分析根据我们实验室以前描述的方法(23,24]。观测进行了10 kV的丝的张力。矿化矩阵的检测进行了使用SEM结合EDX(力量、考文垂、英国),通过分析表面钙和磷的分布。获得的值被当作重量百分比(wt %)。

2.8。茜素红染色,定量碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCL)和骨桥蛋白(OPN)测定

茜素红S染色进行评估钙沉积的形成。简而言之,在21天的时间的成骨分化,细胞被固定在10%福尔马林1 h在室温下,其次是与蒸馏水洗涤和孵化的5分钟的工作解决方案茜素红s染色后,细胞被洗了三次蒸馏水和钙沉积在倒置显微镜下观察(Axio观察者A1,蔡司)。照片是获得使用大炮博秀数码相机。茜素红染色法的定量分析,盘子和10%醋酸孵化30分钟然后井收集的内容到1.5毫升样品管,混合,加热到85°C 10分钟,在冰上冷却5分钟,pH-neutralized 10%氢氧化铵。下自旋(1200×g后,15分钟),在上层清液的吸收波长405纳米测量使用标(SPECTROstar Nano, BMG Labtech)。细胞外活动的高山决定上层清液收集细胞培养的最后一天。执行试验使用碱性磷酸酶比色测定工具包(Abcam,剑桥,英国),根据协议由制造商提供。实验样本准备一式两份和稀释双重的。控制样本的背景中,背景被减去纠正值来源于零标准从所有标准,样品,控制样本。p-nitrophenyl磷酸(pNPP)被用作磷酸酶底物。底物被水解成p硝基酚在碱性磷酸酶。

反应产物为405 nm波长使用标(BMG Labtech)。样本数据被应用于标准曲线获得pNP型高山生成的样本的数量。酶活性测定使用以下公式:高山活动(U / mL) =,(我)是pNP型生成的样本的数量(在nmol), (2)是样品的体积增加了试验(mL),和(3)反应时间。

骨钙素的水平(OCN)和骨桥蛋白(OPN)测定21 d后上层清液的细胞培养。在三个独立的复制中收集。蛋白质水平测量前,样本完全混合。为了确定细胞外蛋白质的浓度,使用特定的ELISA试剂盒:(i)鼠Gla-Osteocalcin高敏感的酶联免疫试剂盒(Saint-Germain-en-Laye豆类生物欧洲,法国)和(2)鼠标/大鼠骨桥蛋白Quantikine酶联免疫试剂盒(英国研发系统)。定量测定OCN和OPN执行根据制造商的指示。蛋白质检测的数量被表示为一个蛋白质质量和上层的体积比(w / v)。

2.9。统计分析

使用Statistica 9.0执行统计分析软件(StatSoft波兰Sp. z有限责任。克拉科夫,波兰)。获得的结果之间的差异的重要性是评估使用未配对以及或单向方差分析与费舍尔的事后测试。结果被认为是重要的。所有数据被当作平均数±标准差。

3所示。结果

3.1。从骨髓msc孤立的总数和单独使用潜力

为了证实细胞的间充质来源的标准定义msc满:(i)典型塑料附着生长;(2)表达msc表面标记和缺乏造血标记;和(3)在体外向chondrogenic成骨分化潜能和脂肪形成的血统(图1)。

殖民地的数量由MSC祖细胞经过21天的文化明显高于endurance-trained动物相比,久坐不动的。练习导致21 MSC殖民地的形成(21±2;每口井的),而在久坐不动的集团16殖民地观察(;)(图2)。

msc孤立的耐力训练后的数量明显升高(;),与msc与久坐不动的动物(;)。此外,免疫组织化学染色检测CD105⁺细胞在endurance-trained动物(数据显示更密集的反应3 (b)和3 (c))相比,久坐不动的集团(数字3(一个)和3 (c))。

3.2。钙和磷的浓度在骨墙

SEM-EDX分析估计交货在骨矿化的影响。定量EDX分析表明,Ca和P的浓度在久坐不动的动物的骨墙高42% (26 wt %±6;11)相比,运动组(wt %±2;)。数据呈现在图4。

3.3。MSC成骨的潜力

两组之间的比较分析进行调查是否施加影响交货的成骨分化潜能。我们分析了早期和晚期骨生成的标志以及Ca和P浓度表面成骨细胞前体。更高水平的碱性磷酸酶(ALP)中检测出endurance-trained动物(19 uU /毫升±1;)相比,久坐不动的组(16 uU /毫升±1;)(图5(一个))。类似水平的相关性观察骨桥蛋白(OPN)。OPN水平最高,等于48±2 ng / mL,被记录在endurance-trained动物,而在久坐不动的集团,它相当于32±2 ng / mL(图5 (b))。这种趋势也保留对骨钙素(OCL)水平在两组调查。OCL更高级别(170±1.3 ng / mL;)是执行组中发现,相比之下,久坐不动的组(130±1.4 ng / mL;)(图5 (c))。获得的数据强烈与定量分析使用SEM-EDX执行的Ca和P。更高浓度的钙(14±1 wt %;)和磷(6±2 wt %;)是执行组中观察到久坐不动的组相比,Ca和P等于wt %和wt %,分别为()(数据5 (d)和5 (e))。茜素红染色显示显著差异(MSC矿化过程中)两组测试。一个相当强大的反应和吸收的比例最高茜素红观察行使动物(81%±9)(数据6 (b)和6 (c))相比,久坐的人(56%±3)(数据6(一)和6 (c))。

3.4。骨髓腔的脂肪细胞数量减少和抑制MSC脂肪形成的潜力

的骨髓腔研究用苏木精和伊红染色(H + E)。更大的存款在久坐不动的动物脂肪滴观察骨髓腔(数字7(一)和7 (d)锻炼动物(数据)相比7 (b)和7 (e))。定量评价总数的脂肪细胞在骨髓腔透露,久坐不动的动物有多出55%的脂肪细胞(20±3;)相比,行使动物(;)(图7 (f))。此外,厚骨墙(328µm±36)在行使动物相比,控制个人(223µm±14;)。

MSC与久坐的脂肪形成的潜力和endurance-trained动物是评估使用标准MSC adipogenesis-inducing协议。油红O染色显示更广泛的脂肪形成久坐不动的动物相比,运动组(数字6 (d)和6 (e))。此外,发现msc的脂肪形成的分化潜能来源于endurance-trained动物降低低百分比的基础上吸收油红O染色(17%±3;)相比,久坐不动的组(46%±3;)(图6 (f))。

4所示。讨论

近年来,已经受到了人们足够的重视发展战略旨在减缓老化过程及其后果。衰老和久坐不动的生活方式有助于减少骨骼数量和质量,减少肌肉和力量,并削弱了姿态稳定,最终一个骨骼骨折风险升高。再生能力的个体强烈与干细胞的数量可以作为备份人口受损组织的修复/复兴(21,24]。因此,寻求非药物方法将增加不同来源的干细胞的数量似乎是医学的一大挑战。

机械信号影响骨骨髓来源干细胞的数量,特别是间充质干细胞(msc),它有一个显著影响骨骼和脂肪形态(25]。在这项研究中,我们已经表明,增加耐力运动训练(特异)间充质干细胞/祖细胞的总数(msc)骨髓腔。此外,在我们之前的研究中,我们已经证明,前女友的总数增加VSELs循环在PB和居住在BM。因此,我们可以推测,可能有益影响交货的扩张在早期发育干细胞(VSELs)和干细胞/祖细胞可能扮演重要的角色在组织和器官再生。之前报道,循环干细胞参与修复组织和器官损伤(小状况25]。此外,我们发现前提高成骨的潜在的msc与贝克等人的结果是一致的。(20.]。后者作者集团报道,前提高造血作用由于内分泌信号增加骨骼muscleand重建髓造血的利基。

考虑到骨头上,居住着msc、数量和分化潜力似乎是一个关键因素在身体再生需要的背景下。msc在骨髓微环境提供支持造血干细胞(hsc)另外,可以分化成多种中胚层细胞系(21,26]。目前的研究表明,体育活动可以增加从骨髓msc的总数。增加骨髓msc数量有密切关系更多的纤维母细胞克隆形成单位(CFU-Fs)行使的动物。在阿尔贝克也得到类似的结果。20.),报告更多的CFU-Fs msc在训练有素的动物。我们已经发现,在当前工作减少脂肪的数量交货在骨髓腔。我们已经注意到较低的脂肪细胞在骨髓腔endurance-trained个人相比,久坐不动的动物。我们的数据是一致的其他研究小组的发现也观察到的脂肪细胞数量减少了动物和人类(20.]。众所周知,对造血骨髓脂肪有负面影响。这不仅是由于骨髓的职业空间,而且蛋白质脂肪细胞释放的因素,如neuropilin-1 [27],lipocalin 2 [28),或脂联素29日),可以显著影响造血细胞增殖。

在干细胞的角度在临床实践中的应用,不仅增加造血作用是很重要的,但也达到和维持足够数量和质量的骨组织。有趣的是,在我们的研究中,成骨细胞前体(突发)表现出更高的成骨的潜力endurance-trained动物相比,久坐不动的。我们已经找到更高的碱性磷酸酶(ALP)活性,骨的早期标志以及高浓度的后期骨生成的标记,也就是说,骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCL)。此外,发现耐力训练增强矿化突发交换的过程。高钙(Ca)和磷(P)水平检测到突发交换来自msc行使动物,它强调骨生成的效率体外。相比之下,较低的Ca和P水平观察肱骨的训练有素的动物。这可能是由于Ca和P释放到外周血演习期间,之前报道的其他作者(30.]。改变分化的潜力以及观察来自前,动物的矿化过程可能的机械应力刺激的结果。据报道,机械力应用于骨在跑步机训练程序激活细胞外signal-regulated激酶途径(ERK1/2),导致一个更成熟的成骨表型的msc (20.]。此外,骨暴露身体劳损被证明表达下调过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR -γ),也被称为受体类艾可拓和文迪(PPARG)促进脂质吸收和抑制脂肪形成30.,31日]。在我们的研究中,我们观察到一个显著的低脂滴数量前动物的脂肪细胞的前体细胞来源于msc。这表明前脂肪形成的潜在的抑制作用msc。机械和物理压力,包括运动,可能会影响组织细胞肌动蛋白的变化。肌动蛋白细胞骨架动力学与脂肪形成的的规定和成骨分化。信号转发来自身体活动的整合蛋白转导的肌动蛋白细胞骨架机械信号切换到生化pathways-from脂肪形成的成骨分化(32- - - - - -34]。

研究由Menuki艾尔。35)报道,攀爬运动增强MSC分化潜力和骨重建。另一项研究证明了循环应变增强基质矿化在人类间充质干细胞(hMSCs)。

5。结论

总之,我们已经表明,耐力训练的总数增加骨髓间充质干细胞/祖细胞。我们的研究结果表明,不仅支持造血作用的过程,但也显著增强的成骨分化潜能msc、同时抑制脂肪形成的属性。结果支持这一观点,耐力训练可以发挥重要的作用在间充质组织的再生,因此代表了一种新颖的非药物方式推迟老年性肌肉骨骼系统的弱化。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

弗罗茨瓦夫研究中心支持的研究EIT +项目“生物技术和先进的医疗技术”下生物医学(POIG.01.01.02-02-003/08)从欧洲区域发展基金资助(操作程序创新经济,1.1.2)。本文是在弗罗茨瓦夫生物技术中心的支持下,项目主要国家研究中心多年来(知道)2014 - 2018。