文摘
长期的文化后,间充质干细胞生物属性和改变他们进入复制衰老状态。虽然有几个经典的生物标志物定量评估细胞衰老,没有标志被证明完全独特的细胞衰老状态。我们使用骨骨髓来源msc (BM-MSCs)从不同的健康年轻的捐赠者和一个在体外衰老模型定义的端点来确定一组健壮的标记,可以预测msc的扩张能力达到衰老之前准备工作。为每个通道BM-MSC早期样本(5或6通道),规范化senescence-associated标记的蛋白质表达水平,、SOD2和;白细胞介素6的浓度和IL8细胞培养上清液;和标准化的基因表达水平的多能性标记OCT4,NANOG,SOX2与最终人口翻倍(PD)号码。我们显示的低表达蛋白质和高OCT4基因表达,而不是其他评价指标,可能是潜在的特点和预测更大在体外寿命和增长潜力,影响因素的成功治疗使用msc准备。
1。介绍
间充质干细胞(msc)有能力自我更新和分化成不同的中胚层的血统骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。越来越多的研究表明,msc不同起源的代表有前途的再生医学的细胞来源。然而,由于msc的低频率发生在人体组织,广泛在体外扩张通常需要获得足够数量的细胞的临床应用。众所周知,在长期的文化和连续的段落在体外msc,大多数成年细胞,改变他们的生物属性和进入复制衰老状态(1,2]。
复制衰老是指本质上不可逆转的增长逮捕发生在细胞失去能力复制后一定数量的人口(PDs)在文化[倍增3]。这些衰老细胞变大,收购一个扁平的和不规则的形态,并显示一个senescence-associated分泌表型(SASP),增加分泌的细胞因子,生长因子,和矩阵重构酶。这些后果的端粒缩短,氧化应激,DNA损伤、外遗传性中断,和其他senescence-inducing刺激(4]。目前,相信复制衰老的生理相关性躺在试图抑制癌症和促进组织修复(修订(5,6])。
用于定量评估了生物标志物的细胞在文化和衰老在活的有机体内。的senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加)作为第一个更具体的标志出现衰老细胞的识别和复制衰老期间似乎反映溶酶体质量增加(7,8]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和细胞周期的重要监管机构,也被广泛作为衰老的分子标记。这些蛋白质是组件的两个主要的肿瘤抑制通路,/复审委员会和p53 /,参与控制的永久性增长逮捕衰老细胞(9,10]。老化的研究显示的表达增加实足年龄或PDs的细胞在文化。然而,是表达的很多,但不是全部,衰老细胞(修订(11])。事实上,一些似乎主要是由衰老状态由p53和其他人,这取决于需要耦合逮捕了细胞增殖到其他细胞反应,满足各种各样的生理需求和应对各种形式的压力(5]。
其他经典测量标记与衰老相关的国家包括调节分泌白细胞介素- 6的促炎的分子和interleukin-8(白细胞介素6和IL8), SASP的关键组件,积极参与衰老进程和加强衰老增长逮捕(修订12])。此外,有许多重要但不太常用的标记评估衰老,包括蛋白质参与氧化应激反应,如抗氧化剂酶诱发差别SOD2的对这些线粒体氧化应激(13]。同时,组件mTOR的信号通路,例如核糖体蛋白(激活Ser240/244网站作为信号转导过程的一部分),最近证明发挥重要作用在细胞衰老和生物的衰老14- - - - - -16]。
Senescence-associated标记通常是衰老的段落没有限制,但不断以来的收购在体外文化(1由[],修订17]。此外,没有标志或标志已被证明完全独特的细胞衰老状态,而不是衰老细胞表达所有衰老标记。因此,替代标记在细胞衰老的评估是有用的。因为他们表现出一种相反的生物功能与衰老相比,pluripotency-related转录因子的表达下调表达可能指出作为一个潜在的候选标记细胞的衰老状态,尤其是对于干细胞。多能性基因,如OCT4和NANOG,显示表达多能和成年干细胞(比如msc)和长期表达下调在体外扩张和分化18,19]。然而,仍有待阐明是否coexpression衰老和pluripotency-related因素影响msc的寿命,因此,他们在治疗蜂窝性能和有效性。
众所周知,长期msc的增殖能力的差异与不同捐赠者的存在(1,20.),重要的是,在体外扩张的潜力不同msc样本可能与形态学和分子特征表现在早期的段落。为了进一步探索这个假设,本研究旨在研究衰老的早期表达如何标记,,白细胞介素6、IL8 SOD2,多能性标记,OCT4,SOX2,NANOG,将有助于预测msc的增殖在文化进入一个长期增长逮捕典型的衰老。我们使用骨骨髓来源msc (BM-MSCs)从不同的健康年轻的捐赠者和一个在体外衰老模型定义的端点来调查这一重要问题。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
主要人类从骨髓msc孤立的健康的年轻成年人(3男性和女性,老化21-39岁)从患者获得前交叉韧带(LCA)重建手术。这项研究是完全按照道德准则,进行书面知情同意后,样本收集。
骨髓msc隔离,体积小的从远端股骨吸气,与相同体积的PBS稀释(磷酸缓冲盐),然后覆盖在Ficoll-Paque(密度= 1.03到1.12 g / mL;通用电气医疗集团)密度梯度离心分离的500 g 30分钟。单核细胞收集和培养DMEM-low葡萄糖(Gibco /生命技术)补充15%胎牛血清(Gibco /生命技术),1毫米谷酰胺,1% antibiotic-antimycotic解决方案(Gibco /生命技术)T-25烧瓶,孵化37°C湿润5%股份有限公司2。不依从细胞24小时后被删除,和媒体取代每周3次,直至细胞融合达到70 - 80%。这些细胞被收获与胰蛋白酶/ EDTA溶液(0.25%胰蛋白酶,EDTA约4毫米;Gibco /生命技术),细胞数量和生存能力被台盼蓝排斥法评估。在每一个段落,细胞被播种密度4000细胞/厘米2。
PDs的数量计算基于总细胞数在每个通道使用以下方程: PD人口倍增,NH细胞收获数量,镀镍是细胞数量。
2.2。骨髓间充质干细胞的特征
BM-MSCs扩展直到第五段,流式细胞术分析确定干细胞标记物的表达谱所定义的细胞疗法的国际社会。所有BM-MSCs样品被发现阳性CD90、CD73,和CD105(阳性细胞> 95%)和消极CD45, CD34, CD14、HLA-DR。数据收集使用FACSAria (BD生物科学)和分析使用FlowJo软件(树星有限公司、亚什兰或)。BM-MSCs分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞成功地通过使用特定的媒体(StemPro脂肪形成,软骨形成和成骨分化工具包,Gibco /生命技术)和确认使用lineage-specific细胞染色:油红色代表脂肪细胞,软骨细胞阿尔新蓝,茜素红S骨细胞。
2.3。Senescence-Associated -β牛乳糖化验
细胞衰老是评估使用β牛乳糖染色工具包(细胞信号)根据制造商的指示。总之,细胞被播种在48-well盘子和培养24小时。与PBS洗涤后,细胞被固定为4%甲醛在PBS 15分钟和染色β牛乳糖活动使用半乳糖苷溶液pH值(6.0)在一夜之间37°C。相差显微镜下细胞进行了分析。歧视形态,细胞也与苏木精染色。
2.4。免疫印迹
从培养细胞总蛋白提取得到使用缓冲区里帕(50毫米TrisHCl pH值7.4,150毫米氯化钠,2毫米EDTA, NP-40 1%和0.1% SDS)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(σ)。等量的蛋白质(20μg)是由sds - page分离并通过免疫印迹转移到硝化纤维膜。膜被封锁和孵化后主要抗体:anti-P16 (ab108349 Abcam) anti-P21 (ab109199) anti-SOD2 (sc - 30080,圣克鲁斯生物技术),anti-phospho -(编号为5364,细胞信号技术)和B-actin (A2228σ)加载控制。执行检测使用辣根peroxidase-coupled anti-mouse或anti-rabbit二级抗体(细胞信号),电解研磨衬底(通用电气医疗集团),使用x光片和常规发展。乐队的强度是由微使用Totalab TL120软件(非线性动力学、纽卡斯尔、英国)。
2.5。炎性细胞因子测定
的炎症分子白细胞介素6和IL8水平文化上层清液进行评估使用仪珠阵列(CBA)人类炎性细胞因子工具包(BD生物科学)流式细胞术在制造商的指示。数据分析使用FCAP阵列软件(软流Inc .)。
2.6。基因表达分析
从培养细胞总RNA提取使用Illustra RNAspin微型RNA隔离设备(通用电气医疗集团)和逆转录1μg提取的RNA进行与QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)。实施中存在的ABI7500 thermocycler(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,加州)使用最大值SYBR绿色qPCR大师混合(热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,MA),根据制造商的建议。Gene-specific引物设计使用底漆表达软件(版本1.5;应用生物系统公司,培育城市,CA)和表中列出1。感兴趣的基因分析的存在OCT4,NANOG,SOX2。每个目标基因的表达水平是标准化的GAPDH信使rna水平,同时测量。结果表示成规范化的意味着折叠改变基因表达相对于校准器样本(参考RNA实时qPCR、636690号Clontech,山景城,美国),使用方法(21]。
2.7。统计分析
用SAS软件进行统计分析(SAS研究所,1998)。评价的因素可能与寿命,这里测量累积PD,是由SAS的CORR过程,使用斯皮尔曼相关法。为每个通道BM-MSC早期样本(5或6通道),规范化的蛋白表达水平,、SOD2和;白细胞介素6的浓度和IL8细胞培养上清液;和标准化的基因表达水平OCT4,NANOG,SOX2策划反对最后PD(衰老通道)。在所有的分析中,被认为是水平的意义。
3所示。结果
3.1。主体间变异性BM-MSCs形态学和长期增长
BM-MSCs得到从六个健康年轻的捐助者(称为BM07样品,09年12 13日,16日和18)。在章节5到6,immunophenotypically均匀BM-MSCs人口(CD73+,CD90+CD105,+、CD45−,CD34−,CD14−,HLA-DR−)与脂肪形成的、成骨的观察和chondrogenic分化潜力为所有样本(数据未显示)。然而,在这些早期的段落,我们观察到不同捐赠者的BM-MSCs呈现不同的形态,从一个典型的细长和spindle-like形态(样本BM09、12和18)与更大的形状不规则的外观,符合细胞进入衰老(样本BM07 BM13, BM16)(图1(一))。
(一)
(b)
(c)
的增殖潜力BM-MSCs文化被累积测量PD水平,从12到32累积PDs(图1 (b))。人口翻倍曲线之间的差异的文化。同样,时间衰老之间的不同的文化。在文化评估在目前的研究中,BM16 BM13停止增殖早期段落11.8和8.8 PDs,分别。有趣的是,BM07从未完成一个PD(0.95),这表明它已经显示出衰老的迹象甚至在早期的段落。相比之下,BM12和BM18花了长时间达到衰老,达到超过25 PDs。课程实验表明,扩散时间下降时间进入增长逮捕典型的衰老。虽然细胞被播种在同一密度,也有相当大的变化在人口倍增时间(PDT)文化。总体而言,PDT变异性降低段落与后者相比年初段落。PDT也增加,当然,后者通道(图后较慢的增长速度1 (c))。
3.2。文化扩张BM-MSCs原因变量的变化形态和表达模式的古典Senescence-Associated标记
描述BM-MSCs表型和分子变化与衰老有关,我们分析了细胞形态学和古典senescence-associated标记的表达模式,β牛乳糖,,白细胞介素6,和IL8 BM-MSCs在早期通道(P5)和衰老(去年)。
我们发现BM-MSCs复制衰老是伴随着典型的形态学改变和细胞成为扩大和增加细胞质粒度和增强夷为平地β牛乳糖活动(图2(一个))。然而,这些senescence-associated BM-MSCs样本显示相对变化更明显了在体外寿命(BM09 BM12 BM18),表明样本senescence-like形态在早期的段落和减少PD潜在可能已经衰老。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
大部分衰老BM-MSCs也显示增加蛋白表达与早期相比通道BM-MSCs来自同一个捐赠者(图2 (b))。另一方面,我们观察下降蛋白表达,另一个CDK抑制剂,在大多数衰老BM-MSCs相比,早期通过细胞来自同一个捐赠者(图2 (c))。奇怪的是,这两种蛋白质的不同表达水平,和,提出了一个强有力的褶皱和逆关系变化(早期衰老/通道)(,),这可能表明,在衰老的BM-MSCs表达了相反的方向。另外,大多数衰老BM-MSCs还显示增强分泌的促炎细胞因子白细胞介素6和IL8(数字2 (d)- - - - - -2 (e))。最后,值得注意的是所有蛋白质测量中有个别间变异性褶皱变化(衰老/年轻的通道)的表达水平。
3.3。和OCT4是最健壮的早期培养BM-MSCs寿命标记
为了识别很容易衡量的因素可能是BM-MSCs增长潜力的预测,我们的策略是量化的表达水平早已经建立了衰老的标志和多能性的段落(第五或第六章节)每个BM-MSC样本和相关PDs的最终数量。
衰老的标志之一,蛋白表达显著负相关性和寿命(,)(图3(一个)),这表明细胞表达水平相对较低的蛋白在早期文章提供了一个扩展复制的潜力。其他伴随老化蛋白质等、SOD2和与寿命没有显著相关(数据3 (b)- - - - - -3 (d))。同样,白细胞介素6的数量和IL8分泌在早期文章不能与BM-MSCs增长能力(数据3 (e)- - - - - -3 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
由于低蛋白表达的多能性标记(NANOG,OCT4,也SOX2在BM-MSCs),我们不能估算寿命评估这种蛋白质的能力。由于基因表达技术可能更敏感,我们提出了测量实时PCR mRNA pluripotency-related基因的丰度。我们观察到的表达OCT4表现出强烈的正相关和寿命(,)(图4(一)),表明细胞多能性等更丰富的表达基因在早期文章有可能延长寿命。其他评估pluripotency-related基因的表达,NANOG和SOX2与细胞寿命,没有呈现出显著相关性(数字4 (b)- - - - - -4 (c))。
(一)
(b)
(c)
因为OCT4/比率与寿命直接相关(,),我们的研究结果表明,较低和更高的OCT4表达水平的工作作为一个伟大的标志来估计msc的衰老状态准备工作,因此可以很好地预测出他们在体外可扩展性。
4所示。讨论
Culture-expanded人类msc正越来越多地用于研究和临床用途。形态分析、评估特定的细胞表面标记和分化为间充质血统msc扩展特征主要是有用的在体外根据最低标准,由国际社会建立细胞疗法(22]。没有保证,然而,msc特征样本期间表现良好在体外扩张和在活的有机体内细胞移植。因此,这将是最大的兴趣来确定一组健壮的标记,预测msc准备到达衰老的扩张能力,可以将有价值的信息,当大量的msc是必需的。本研究旨在提高这方面的知识。
在此,我们使用一个健壮的模型复制衰老的良好定义的端点。然而,使用BM-MSCs样本显示高个人间变化形态,长期增长,衰老和时间到达,类似于以前的研究[描述是什么23- - - - - -26]。值得注意的是,捐助者之间没有观察临床相关的差异和BM-MSCs孤立,培育和扩大在相同的标准化控制条件。然而,矛盾在这样的过程中可以扮演一个角色在描述变化,因此不能排除。或者,重新编程的去除在活的有机体内骨髓利基(27),不同的克隆数量28,改变由于高氧物种积累和甲基化(29日也可以解释观察到的形态和功能异质性。
利用个人间的变异性的复制寿命BM-MSCs样本,本研究侧重于理解关键因素可以预测在体外长期增长潜力的msc的准备。我们的策略是找到在早期的段落标记,其表达水平与寿命和老化状态的细胞。最初,通过分析建立了衰老的标志,我们观察到,与之前的研究结果相一致30.,31日的表达水平在衰老BM-MSCs蛋白质增加,更重要的是,其在早期通过细胞表达显示一个强大和与PDs的最终数量负相关。协会和细胞寿命似乎是由于审查委员途径建立的直接作用和/或逮捕和维持经济增长,因此,锚定的细胞衰老状态(32]。事实上,击倒在体外已经证明逆转衰老msc的行为在不同的模型19,30.,31日]。这些结果表明,尽管衰老是一个动态的过程,细胞以更大表达式可能接近复制衰老阶段。
另一方面,我们观察到的表达水平蛋白质p53增长逮捕通路的下游效应,降低衰老BM-MSCs和它的表达在早期通过细胞与细胞的增长潜力。有趣的是,我们观察到的褶皱和逆关系(早期衰老/通道)的变化和。这一结果的理由是观察到的激活在一些细胞在衰老过程中只有短暂的增长被捕后水平下降,而负责维护增长逮捕衰老细胞(32]。虽然到目前为止没有衰老标记能够明确确定的衰老细胞在体外或在活的有机体内,我们的结果与先前的研究表明,但不,可能是一个更好的msc的老化状态的标志(5,30.]。
虽然我们观察到增强释放促炎细胞因子白细胞介素6和IL8在大多数衰老细胞相比早期通过细胞来自同一个捐赠者,我们没有发现任何显著的上层清液中白细胞介素6或IL8水平之间的相关性从早期通过细胞和寿命。这些结果显示,与之前的研究结果相一致,收购SASP是后来事件在衰老过程中,行为加强衰老增长逮捕以自分泌的方式(33由[]修正12,34]。
类似之间缺乏相关性观察BM-MSCs寿命和蛋白表达水平的抗氧化酶SOD2或核糖体蛋白在早期细胞通道数字。最近的研究表明,线粒体氧化应激增加,mTOR信号通路参与细胞衰老,衰老包括msc (16,35]。尽管目前的研究的范围之外进一步探索这些生物过程,我们的研究结果表明,观察白细胞介素6、IL8 SOD2的表达水平msc在早期文章不是预测潜在的可扩展性。
除了他们的角色在维持多能干细胞的未分化状态,pluripotency-associated基因也已与msc的干细胞特性的规定(19,36]。我们的研究结果表明,msc与相对较高OCT4基因表达增加寿命。此外,高OCT4/比例是与增加寿命,据我们所知,这是第一个研究演示了一个直接关联的多能性基因及其结合,细胞寿命和衰老。此外,我们还发现了一个强大的逆相关性早期的表达OCT4和在我们的样本。这并不出人意料,因为关键的多能性基因表达的增加会使细胞周期调控等和(19]。背后的机制这观察包括直接绑定OCT4 NANOG DNA甲基转移酶1的启动子,增强其表达,反过来,保持DNA甲基化,会使和表达式,从而调节msc的增殖和未分化状态19]。
我们的数据表明,低水平的和高水平的OCT4可以预测衰老状态,早期通过msc的增殖能力。因为复制衰老也减少了msc分化能力(37),在未来的研究中,将会很有趣地址是否表达相结合和OCT4相反的方向也将是最好的预测multipotency个人MSC的准备。
5。结论
综上所述,我们的研究结果进一步证实和扩展先前的研究结果表明,(1)有高可变性早期形态学和长期msc的增殖能力与不同的捐赠者;(2)低表达,但不,可能是一个更好的msc的老化状态的标志;(3)表达水平的il - 6、引发SOD2,,SOX2,NANOG在早期细胞通道不与msc寿命;(4)msc pluripotency-associated基因表达OCT4和它的表达与这些细胞的增殖能力。总之,早期低和更高的OCT4表达水平的工作作为一个伟大的标志来估计msc和预测他们的衰老状态在体外可扩展性。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢所有的受试者参与这项工作。这项工作是支持由FAPESP (Proc: 2012/00831-7)必须占州政府。