人类在晚期妊娠羊水间充质干细胞从第二和羊膜穿刺术:分化潜力,分子签名,和蛋白质组分析

文摘

人类羊水干细胞已成为有吸引力的潜在应用干细胞来源在再生医学和组织工程。本研究的目的是描述羊膜fluid-derived间充质干细胞(AF-MSCs)第二,妊娠晚期。使用两级协议,msc被成功培养,表现出典型的干细胞形态,特定的细胞表面,多能性标记的特点。AF-MSCs分化成脂肪细胞,骨细胞,软骨细胞,细胞,神经元细胞,由形态学变化,细胞染色,RT-qPCR显示分化细胞谱系的组织基因的存在。使用SYNAPT G2高清质谱分析技术方法,我们进行了第一次未分化之间的比较蛋白质组学分析AF-MSCs从妊娠末三个月和分化成肌原性的,脂肪形成的,成骨和神经性的血统。分析250年高点丰富蛋白质的功能和表达模式选择来自1400多个展示了类似的培养和分化AF-MSCs但独特的蛋白质组表达谱的变化在细胞分化,可以帮助识别细胞分化的重要标志。我们的研究结果提供的证据表明,人类在晚期妊娠羊水的第二和包含与multilineage干细胞临床应用的潜力和可能有吸引力的来源。

1。介绍

人类羊水(AF)期间收集的羊膜穿刺术怀孕15周、19周之间用于广泛的常规产前诊断胎儿畸形和基因疾病(1- - - - - -4]。房颤代表一个异质的细胞群来自胎盘膜,胎儿的皮肤,和消化、呼吸和泌尿道。房颤从羊膜穿刺术样本包含有限的终末分化细胞增殖能力和胎儿间充质干细胞与multilineage分化潜能(5,6]。最近,房颤的被认为是一个有吸引力的来源间充质来源的干细胞治疗应用和致瘤性的低风险(7]。多种方法被用来分离和定性这些干细胞类型。基于形态特征、AF殖民地由纤维母细胞附着“主轴”型和“圆”形上皮细胞(8),但上皮细胞消失在传播的混合主要细胞培养。迄今为止,不同的克隆种群被稀释而直接电镀隔绝AF,包括表型和功能上不同的基质细胞克隆,长寿的上皮细胞,和人口老化9]。克隆种群克隆环或机械地拿起,建立了与表达的受体细胞的免疫选择钢铁因子(c - kit +)或磁性细胞分选CD117 + (10- - - - - -12]。大多数的孤立AFSCs共享多能间充质表型和展出高增殖和分化潜能[5,13,14]。AF-MSCs分化为脂肪细胞,软骨细胞,骨细胞、心肌细胞、神经细胞已报告在体外和在活的有机体内(15- - - - - -19]。

在羊水细胞群体有很大的多样性和变化在羊膜穿刺术样本不同的捐赠者,妊娠时间和培养。到目前为止,中期妊娠羊膜穿刺术样本通常是用于研究工作,但在这个妊娠时间是不可能收集大量羊水和增加子宫污染和流产的风险。到目前为止,对晚期妊娠的生物学特性AF-MSC,可能作为一种丰富的自体干细胞治疗(20.,21]。这些潜在优势导致的比较调查AF-MSCs第二和晚期妊娠后期。在这项研究中,我们证明了AF-MSCs可以成功地孤立和扩大在晚期妊娠第二和羊膜液,维持multipotency标记的表达和诱导不同的细胞谱系。蛋白质组分析记录相似性和特定的表达谱的变化未分化AF-MSCs和分化成肌原性的,脂肪形成的,成骨和神经性的血统。

2。材料和方法

2.1。隔离和扩张,从羊水间充质干细胞

样品(大约3到5毫升)通过活检(羊膜穿刺术)从第二代中期(16 ~ 24周,)或报(28-34周,)羊水从健康的女人需要产前诊断,但没有异常被遗传分析显示。样本保持在室温下放置4小时前羊膜细胞隔离使用两级协议(22]。样品在1800转离心20分钟,上层清液被免职,细胞颗粒在DMEM培养基清洗一次(Sigma-Aldrich有限公司)没有血清去除血液和细胞碎片。离心后,细胞颗粒resuspended 5毫升的生长介质AmnioMAX-C100基底与AmnioMAX-C100补充(Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(美国纽约Gibco,大岛)和镀25厘米²瑞士培养瓶(TPP)。Amniocytes培养10 - 15天在37°C公司5%₂当第一个殖民地出现(第一阶段)。培养AF-MSCs(第二阶段),nonadhering AF细胞收集的主要文化和进一步扩大新的25厘米²培养瓶在37°C公司5%₂。细胞的外观殖民地后,成长中每3天了。细胞亚文化与0.05%更高的段落在大约80%融合trypsin-EDTA (Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国),纤维母细胞形态均匀的人口获得了经过两轮的亚文化。

2.2。流式细胞术分析

的表型鉴定AF-MSCs从段落4 - 5,离心收集的细胞在1200 rpm 6分钟,洗一次磷酸缓冲盐(PBS)与0.2%胎牛血清(FCS),并再次离心。总共5×10⁵细胞被resuspended 50μL PBS的1% BSA和孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠标反抗体CD44表达载体,CD34 (Miltenyi生物技术),CD90(分子探针,生活技术)或藻红蛋白——(PE)贴上CD105表达载体,和适当的同形像控制鼠标IgG2A-FITC (Miltenyi研究)或IgG1-PE(分子探针,生活技术)。样本在黑暗中孵化在4°C 30分钟和分析进行流式细胞分析仪BD FACSCanto II (Beckton和迪金森)与BD FACSDiva软件。

2.3。分化分析

AF-MSCs分化能力进行详细的单层制造商的协议使用商用STEMPro分化工具包(Gibco表达载体细胞培养)。AF-MSC在80% - -90%融合和随后分化培养STEMPro分化培养基在37°C公司5%₂。细胞染色,AF-MSCs被播种到4(3.85厘米²)板(Nunc,热科学、鲁开德、丹麦)1×10⁴细胞/厘米²。每一个细胞群在3复制使用未分化细胞分化的控制。在细胞分化过程中,媒介是每2 - 3天更换一次。基因表达研究AF-MSCs在T-25培养瓶。

脂肪形成的差异化,AF-MSCs培养融合和随后分化STEMPro 80%脂肪形成的分化培养基14 - 18天37°C的5%股份₂。特定时期的培养后,细胞内脂滴的形成进行油红O染色。简言之,细胞用60%的异丙醇,洗净晒干,和彩色的10分钟油红O解决方案刚到蒸馏水稀释的比例3:2,紧随其后的是三个在蒸馏水洗。脂联素表达式由RT-qPCR决定。

播种后的成骨分化,AF-MSCs 1×10⁴细胞/厘米²4板或T-25烧瓶在STEMPro成骨分化培养基培养14 - 18天37°C的5%股份₂根据制造商的指示。成骨分化是由茜素红染色钙化的细胞外基质沉积。总之,样本与4%甲醛固定在室温下15分钟,洗两次与PBS、pH值4.2,茜素红染色和2%去离子水为20分钟37°C,紧随其后的是两个洗在PBS。骨桥蛋白表达式由RT-qPCR决定。

chondrogenic分化,micromass文化生成的播种20μL细胞液滴(1.6×10⁴细胞在生长介质/微升)成单个井4板。细胞被允许附加4 h在37°C的5%股份₂在高湿度条件下之前添加STEMPro Chondrogenic分化培养基14 - 18天。Chondrogenic丸是由阿尔新蓝染色为30分钟1%醋酸3%,其次是三个洗3%乙酸,最后在水中。

肌原性的分化,细胞被镀1×10⁴细胞/厘米²培养在80%融合然后用PBS在孵化前含抗生素和2%的马血清DMEM(表达载体),14 - 18天低血清媒体改变每2 - 3天。多核细胞可视化相衬显微镜(Nicon Eclipse TS100)在20%的乙醇和0.1%结晶紫染色后,紧随其后的是在水中清洗。Myogenin表达式由RT-qPCR决定。

神经分化,包含1毫米——感应介质反式视黄酸(σ)在DMEM / F12 GlutaMax和N2补充(Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国)培养细胞为60%融合后使用。neuron-like细胞形态学变化与轴突被相衬显微镜形象化产物结晶紫染色后0.1%。巢蛋白表达式由RT-qPCR决定。

2.4。RNA隔离和RT-qPCR

AllPrep RNA /蛋白质工具包(试剂盒)用于分离和净化总RNA和本地蛋白质(随后用于蛋白质组学分析)同时从单一的控制或分化AF-MSCs样本。信使rna,筛选了AllPrep旋转列,被反向转录cDNA最大值合成第一链cDNA工具包(热科学、维尔纽斯)。RT-qPCR, Maxima SYBR绿色qPCR大师混合(热科学、维尔纽斯)Rotor-Gene 6000系统(Corbett生命科学)的应用。相对基因表达是由一个比较阈值计算周期δCt方法。比较阈值周期(Ct)是用来确定相对于GAPDH基因表达。作为一个相对mRNA水平n未经处理的细胞倍差异。学生的以及用于执行统计分析和< 0.05的值被表示为显著。

转发(F)和反向(R)引物(5′3′)用于RT-qPCR如下:OCT-4 - F: CTCCTGGAGGGCCAGGAATC;接待员:CCACATCGGCCTGTGTATATNanog - F: CCTATGCCTGTGATTTGTGG;接待员:CCGGGACCTTGTCTTCCTTTSox-2 - F: GGCAGCTACAGCATGATGCAGGAC;接待员:CTGGTCATGGAGTTGTACTGCAGT骨桥蛋白- F: GTCCAGTCTTACCTCTCAAACCT;接待员:ATGTGGTCAGCCAGCTCGTC脂联素- F: GGAGACAGCTACTCCCCAAGAT;接待员:GTCCAGTCTTACCTCTCAAACCT巢蛋白- F: CAGCTGGCGCACCTCAAGATG;接待员:AGGGAAGTTGGGCTCAGGACTGGMyogenin - F: CAGCGAATGCAGCTCTCCACA;接待员:AGTTGGGCATGGTTCATCTGGAPDH - F: AACTCTGGTAAAGTGGATATTG;接待员:GGTGGAATCATATTGGAACA

2.5。Filter-Aided蛋白质样品制备(FASP)进行质谱分析

样本集中在Amicon超- 0.5毫升30 kDa离心过滤装置,在8 M尿素变性,100毫米德勤的解决方案与连续旋转800 rpm的温度控制瓶3小时37°C。

根据修改FASP胰蛋白酶消化完成协议所描述的Wiśniewski et al。23]。简而言之,样本与缓冲区包含8 M尿素洗。使用碘乙酰胺烷基化的蛋白质。缓冲区被交换与50 mM NH洗涤两次₄HCO₃一夜之间和蛋白质消化TPCK胰蛋白酶20233(美国热科学)。一夜消化后,肽被离心分离回收,然后使用50% CH两个额外的洗₃CN是结合,酸化,冻干,再溶解在0.1%甲酸,然后通过质谱分析。

2.6。液相色谱和质谱分析

肽是加载在PST C18反相器列,100 5μ米、180μm×20毫米(英国水域公司)和15的流量μL / min使用加载缓冲0.1%的甲酸和随后分离HSS-T3 C18 1.8μ米、75μm×250毫米分析柱(水公司、英国)90分钟线性梯度(0.1%的甲酸,B: 100% CH₃CN, 0.1%甲酸)的流量每分钟300问。

nano-LC是加上hdm Synapt G2质谱仪(英国水域公司)。数据获得使用Masslynx 4.1版本软件(英国水域公司)在正离子模式。但是有的数据收集使用数据独立收购(DIA)模式MSE结合在线离子流动分离。质谱仪的陷阱碰撞能量增加从18到40 eV MSE的高能扫描模式。陷阱和转让为高能碰撞能量扫描hdm模式增加4 - 5 eV和27日50 eV。对分析、质量范围设置为50 - 2000 Da扫描时间设置为0.9秒。参考化合物[Glu1]血纤维蛋白肽B(水公司、英国)注入持续(500 fmol /μL在流量每分钟500 nL),每1分钟扫描在线质谱计校准的目的。样本一式三份。

2.7。数据处理、搜索和分析

原始数据文件处理和搜索使用ProteinLynx全球服务器(身为)(英国水域公司)。以下参数被用来生成峰列表:(i)最低强度前体被设置为100项,(ii)最低强度碎片离子被设置为30项,和(3)强度被设置为500项。处理数据分析使用胰蛋白酶为解理蛋白酶,错过了乳沟是允许的,固定的修改将carbamidomethylation半胱氨酸、蛋氨酸和变量修改将氧化。最小识别标准包括2碎片离子/肽、5碎片离子/蛋白质,最低2肽/蛋白。错误发现率(罗斯福)肽和蛋白质识别是4%。所确定的蛋白质的功能性质进行分析通过使用UniprotKB / SwissProt人类数据库(2015-01-29)。生物信息学管道等产量曲线(http://www.immunologie.uni-mainz.de/isoquant/)是用于label-free量化。测试进行数据评估的区别组(MarkerView软件,AB Sciex)。

3所示。结果

3.1。MSC描述人口第二和晚期妊娠羊水的晚

先前报道(9,24),羊水细胞代表异构人口和只有1%的人表明干细胞特性。在这项研究中,一个两步培养协议(22)是用于生产房颤与均匀纤维母细胞群形态。贴壁细胞来源于新鲜的房颤的样本二、晚期妊娠晚期主要文化导致了混合人口与主轴和圆形形态形成殖民地文化(图15 - 20天左右1(a))。小和球形细胞集中的殖民地位于核类似上皮细胞形成岛屿文化(图2 - 3的通道1(b))。主要的文化包含一个缓慢增长的细胞群,大而平的“基质”显示细胞不规则细胞质扩展和很小的原子核在细胞质(图的边缘1(d))。纺锤状纤维母细胞形态学具有高增殖潜力主要是出现在第二和第三段后文化(图1(c))。间充质干细胞群的推导使用两步协议是成功的,和后4 - 8通道在文化、人口成为形态均匀与成纤维细胞的形态学数据1(c)和2(一个))。这些AF-MSCs增长到80 - 90%的2 - 4天,随后通过文化测试他们的细胞表型特点和分化潜能在段落4 - 6。

细胞表面标记的特点AF-MSCs流式细胞术测定(数字2 (b)和2 (c))。结果表明,从不同的AF样本(msc)表达粘附分子CD44(从53.9到69.9%),高水平的CD90 (Thy-1)(从69.9到91.2%),和mesenchymal-related抗原CD105 (endoglin)(从49.3到61.6%),为造血干细胞标记CD34阴性。值得注意的是,“具备干细胞”标记的表达水平(CD44和CD105)在msc人群提供更多更高的间充质干细胞形态和表型特征和人口更高水平的CD90表示,这可能与AF-MSCs的增长率(8]。

msc房颤的不同妊娠年龄(16-28周)进行评估的表达干细胞多能性标记(图2 (d))。Q-RT-PCR分析结果表明,msc在4 - 6通道持续表达Oct-4, Nanog Sox-2,和Rex-1与维护相关的未分化状态和多能性。AF-MSCs从第二和晚期妊娠(16-28周)表达了类似的水平Oct-4和Nanog的表达水平,而有些不同Sox-2和Rex-1是与孕龄有关。msc在妊娠末三个月(34周)表现出较低的表达Sox-2和Rex-1。msc诱导多能干细胞分化不表达这些基因(数据未显示)。

3.2。分化的潜力AF-MSCs

此外,AF-MSCs从羊膜穿刺术获得不同的妊娠时间的样本进行分析的能力向脂肪形成的区分,成骨,chondrogenic,肌原性的和神经性的血统。所有克隆的AF-MSCs羊膜穿刺术的第二个样品——(16 - 19周)和晚期(34周)在文化超越4或8通道能够区分在所有血统测试(图3)。细胞培养12天积累脂质空泡脂肪形成的条件下,表现出强烈的与油红O染色(图3(b))。RT-qPCR分析显示高表达水平(456倍增加控制)的脂肪细胞标记脂联素(图3(c))。同样,与成骨的培养基培养后12天,大多数的细胞表现出细胞外基质矿化检测到茜素红染色。在这个细胞培养,分析成骨的转录水平取决于RT-qPCR显示意想不到的低表达骨桥蛋白相对于未经处理的控制,这种基因表达。在6 - 12天后神经感应,形态neural-like细胞后,光学显微镜观察结晶紫染色法为0.1%。分化细胞的表达水平巢蛋白检测到RT-qPCR分析调节(28-fold增加)相对于未经处理的控制,巢蛋白也表达了。肌原性的分化很明显的多核细胞由相衬显微镜与0.1%结晶紫染色后(图3(b))和的表达myogenin三倍增加(12日)被RT-qPCR(图3(c))。chondrogenic的诱导分化,msc在高密度颗粒大众文化培养。Chondrogenic分化决定后20天Chondrogenic颗粒的外观和粘多糖生产被阿尔新蓝染色。培养AF-MSCs(控制)并没有显示任何上述分化形态(图3(a))。

3.3。与肌原性的相关蛋白质组的差异,脂肪形成的,成骨的,神经源性分化的预测AF-MSCs测定

比较蛋白质组的资料,我们提出了一个样本的正常培养AF-MSCs从中期(16周,通过5),在适当的条件下培养诱导肌原性的,脂肪形成的,成骨的,神经源性分化。SYNAPT G2高清基于质谱分析证明1423年AF-MSCs蛋白质表达。相关蛋白表达率为每一个微分计算,和蛋白质的表达率高于1.5相比,未分化的控制选择,提出了补充表1(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/319238)。缩写和蛋白质的全名,加入数字,理论分子量和π值,马克斯得分和发生的肽,覆盖率的百分比确定蛋白质的表中列出。图4(一)代表了250年的功能性分类选择从AF-MSCs分化为肌原性的蛋白质,脂肪形成的,成骨的,神经性血统表达率高于1.5与控制。选定的组蛋白是细胞生长和分化(12%)、管理(13%)、细胞信号/交流(9%),和转录/翻译(8%)。其他团体代表代谢(22%)、交通(18%)、结构(6%),和免疫反应(5%)的蛋白质,包括未知蛋白质的7%。在250年选择高蛋白质丰度(图4 (b))、91、89、96和87年被调节到89年,105年,106年和81年AF-MSCs发生肌原性的表达下调,脂肪形成的,成骨,分别和神经源性分化。许多蛋白质在未分化AF-MSCs缺席,包括latexin (LXN,参与负调节肽酶活动),生长分化因子6 (GDF6,参与多细胞生物的发展),搞笑μ重链疾病蛋白质(MUCB,一个细胞外水泡外来体),α晶状体蛋白B链(CRYAB,参与代谢过程),糖原合成酶激酶3β(GSK3β、参与糖原代谢和信号)和ATP依赖的RNA解旋酶DDX 19 (DD19A,参与了许多生理、代谢和运输过程)(补充表1)。接下来,我们识别重要的表达水平的变化,和分化细胞中表达下调的蛋白质与未分化的控制(图5)。

在肌原性的分化(图5(一个)),这种蛋白质的表达最高比率被发现:跨膜糖蛋白NMB (GPNMB,比11.7,参与负调节细胞增殖和细胞粘附),我组织相容性抗原HLA类B7α链(1 b07比率11.2,表示在几乎所有细胞),tropomodulin 2 (TMOD2,比10.0,参与调节肌动蛋白细丝在肌肉和nonmuscle细胞),热休克相关70 kDa蛋白2 (HSP72,比9.2,参与信号转导,细胞有丝分裂细胞周期调控),角蛋白家族I / II型细胞骨架(K1C9、K1C14 K1C16, K2C14,比率7.9 - -5.8,参与细胞骨架组织和细胞分化),β-actin-like蛋白2 (ACTBL,比7.3,肌肉组织细胞骨架组件),磷酸载体蛋白线粒体(MPCP比率6.6,催化磷酸的运输到线粒体基质),和ATP依赖的解旋酶(DHX9,比5.7,参与细胞生长、分裂、分化)。9个蛋白质的表达,调节不同的细胞过程,显著下调(13.8比-58)以及额外的20个蛋白质比例高于5(补充表1)。

在脂肪形成的差异化(图5 (b)),7个调控蛋白,种种锚蛋白域家人E (POTEE,表达在胚胎干细胞lineage-specific分化期间与一个特定的函数),热休克相关70 kDa蛋白2 (HSP72),假定的一半寿命热休克蛋白β3 (H90B3、分子伴侣蛋白促进成熟、结构维护和适当的监管的具体目标蛋白质),肌酸激酶B型(KCRB,表达的各种组织和细胞类型)与比率37.9,18.8,10.6,和8.6,分别和蛋白质代谢的作用,如谷胱甘肽S转移酶μ2 (GSTM2)和谷酰基氨基肽酶(AMPE)比率9.8和7.9,分别或运输功能,如跨膜域包含emp24蛋白质(TMED7,比10.0),高度表达。十蛋白高表达下调与比率(8.0 - -40.6),而1 aldo-keto还原酶的表达家庭成员去往B15 (AF1BF,参与氧化还原过程)与控制相比减少108.6倍。

成骨分化(图5 (c)),10个蛋白的表达明显高于控制:POTEE,比51.9;HLA一级组织相容性抗原B7α链(1 b07,比27.4);干扰素诱导的跨膜蛋白3 (IFM3,比14.9);跨膜糖蛋白NMB (GPNMB比率14.8,参与成骨细胞分化、骨矿化);S100蛋白4 (S10A4比率12.9,诱发骨桥蛋白的表达和分泌);HSP72比率为12.4;异构核核糖核蛋白c 1 (HNRCL,比9.3),胸苷磷酸化酶(TYPH,比8.6);tropomodulin 2 (TMOD2,比6.8,参与肌动蛋白丝组织)。两个蛋白高表达下调,aldo-keto 1还原酶家族成员去往B15 (AF1BF,比62.0,参与氧化还原过程)和14 3σ3蛋白(14 3 3 s,比64.3,有能力结合多种功能不同的信号蛋白)。6蛋白的表达水平下降了(图8.8 - -23.4倍5 (c))和其他六个蛋白质5.9 -7.9倍(补充表1)。

在神经源性分化,8蛋白与不同的功能角色高度表达下调(15.6 -56.8倍(图)5 (d))。其中,显著降低表达测定α2巨球蛋白(A2MG,比56.8,参与调节许多生长因子和细胞因子),α胎蛋白(羊乳酪,比47.9,参与保护胎儿从母体雌二醇),和微管蛋白α8连锁(TBA8),比31.9,参与axonemal微管的组装和动态监管。

特定的蛋白质被确定AF-MSCs分化神经源性谱系,包括硒结合蛋白1 (SBP1),这是完全位于神经突的生长;分泌卷曲的相关蛋白1 (SFRP1)的差别参与对这些Wnt信号;金属蛋白酶抑制剂3 (TIMP3)配合物与金属蛋白酶(如胶原酶)和不可逆转地灭活;积分器复杂的亚基4-like蛋白2 (IN4L2)的未知函数(补充表1)蛋白在神经元细胞呈现在图5 (d)参与信号和监管流程,和高度调节,即肌球蛋白轻链6 b (MYL6B比100年,atp酶细胞马达蛋白);POTEE比率28.4,细胞视黄酸结合蛋白2 (RABP2,比20.1,参与类维生素a信号通路);血液结合素(麻,比19.0,从氧化损伤保护);HLA类我组织相容性抗原B 13α链(1十三区最,比16.3);转化生长因子β诱导蛋白质ig h3 (BGH3,比16.3,参与细胞分化);不活跃的酪氨酸蛋白激酶7 (PTK7,比15.6,参与积极的调节神经元投射);磷酸丝氨酸转氨酶(SERC,比15.5,参与丝氨酸生物合成);磷酸丝氨酸转氨酶(GPNB比率13.7,树突状细胞表达);色氨酸tRNA连接酶胞质(SYWC比率11.9,具有多功能的监管角色)。与神经源性分化相关的蛋白质,这显示显著增加他们的表达与比率1.5 8高于控制,也被发现(表1(b)),包括整合素α8 (ITA8,比7.2,参与神经系统开发);seprase(比6.6,参与开发epithelial-mesenchymal交互控制);tenascin(比4.69,参与神经系统开发);HLA一级组织相容性抗原,B7α链(比1.88,参与调节树突细胞分化);蛋白质精氨酸N-methyltransferase 1(比1.76,参与神经元投射开发);段位结合蛋白2(比15.6,发现neuronal-derived细胞)。其他调节与神经源性分化相关的蛋白质鉴定:整合素19α11(比2.39),prosaponin(比2.34),钙粘着蛋白13(比2.5),蛋白质S100 A6(比2.5),calponin 3(比2.1),神经细胞粘附分子L1(比1.53),和巢蛋白(比1.5)。

UniprotKB / SwissProt人类数据库的分析和做蛋白质组的分类是用来确定的重大变化与细胞分化相关的蛋白质(补充表1)。基于这些结果,与微分表达蛋白质的数量比例高于1.5(1组肌原性的,脂肪形成的,和成骨分化)或以上2神经源性分化(第2组)与控制如图4 (c)。在第一组,14个蛋白质调节和15个蛋白表达下调,而神经源性分化表现出更高的识别蛋白质表达的这种变化(52,31,职责)。(表中differentiation-related蛋白质1()),糖原合成酶激酶3β细胞周期蛋白依赖激酶1只出现在第一集团的分化细胞整合素α8只被发现在第二组(表1(b))。在两组中,蛋白质的表达,如生长分化因子6、3-hydroxybutyrate脱氢酶2型,原肌球蛋白α链,膜联蛋白4,蛋白质精氨酸N甲基转移酶1,鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α11,和有丝分裂原激活蛋白激酶1,调节。高表达的GPNMB肌原性的特点,成骨的,和神经源性分化,而DD19A GNA11肌原性的,脂肪形成的,成骨分化和K1C14只有肌原性的分化。表1(一)也代表表达下调与分化相关的蛋白质对四个血统;他们中的一些人,包括AINX和BGH3调节在神经源性分化。这种类型的分化显示蛋白质的最大相对表达变化比率高于2 - 7.45。ERAP1的表达,ITA8、WNT5A CO1A1 TENA, PML,基本是7.45高-4.64倍细胞分化神经源性血统而未分化的控制(表1(b))。

我们还发现了蛋白质表达水平增加,这被称为标记的谱系特异性分化细胞。的摘要的表达为肌原性的标记,脂肪形成的,神经源性分化成骨的,如表所示2。肌原性的标记前体(整合素α5,窖蛋白1),平滑肌标记(肌间线蛋白,calponin 1, transgelin 3 caldesmon和肌球蛋白轻链激酶平滑肌),和肌肉细胞结构蛋白(原肌球蛋白alpha 4链,肌凝蛋白和肌球蛋白轻链监管12 a)被发现调节平均1.2 - -3.3的叠化和未分化的控制。脂肪细胞的标记物的表达,比如细胞视黄酸结合蛋白2,过氧化物酶病多功能酶类型21日和脂肪细胞的质膜相关蛋白,为1.3 -2.4倍高分化细胞与控制。原肌球蛋白α4链,胶原蛋白α3 - 6链、酪蛋白激酶ⅱ亚基α和基质金属蛋白酶14日与成骨分化,也增加了显示比率(1.2 - -2.5与控制)在分化细胞。神经源性标记,calponin 3,钙粘着蛋白13日,微管蛋白β3链,巢蛋白与比率1.2 - -2.5与调节控制。

一些蛋白质的例子(补充表1)表达在大量培养AF-MSCs,是表达下调(约1.2倍)在细胞发生分化不同的血统,包括波形蛋白(msc)的发展标志,galectin 1(干细胞调控分子),proliferation-associated蛋白质2 g4(参与msc增殖和维护),gelsolin (calcium-regulated, actin-modulating蛋白质),cofilin 1(细胞内actin-modulating蛋白质),transgelin (actin-binding蛋白质收缩属性),和蛋白质二硫化物异构酶(参与蛋白质折叠和氧化还原信号)。蛋白质调节(约1.2 -2.4倍)相比,养殖AF-MSCs分化细胞包括prohibitin(参与细胞发展),氯细胞内通道蛋白4(参与细胞过程监管),蛋白质使同族体(参与细胞结构重组),或GDPρ分离抑制剂1(参与细胞的能动性和信号)。

4所示。讨论

在当前研究中,我们探索AF-SCs间充质特征和multilineage从妊娠晚期妊娠第二和潜力。我们证明AF-MSCs孤立的两阶段培养法是成纤维细胞的f型细胞间充质来源的干细胞的表型特征。这些细胞增长超出5 - 8通道表达间充质细胞标记(CD44, CD90和CD105),没有表达造血细胞表型的标志(CD34)。这里,我们发现了一些变化的表达CD44和CD105房颤相关样品和人口的纯度测试可能因为一小部分的存在形态和表型不同的细胞中丰富的间充质细胞类型的细胞。正如先前所显示的,房颤的细胞群,富含CD44 + / CD105 +细胞和“具备干细胞标记物的表达,表现出扩散率高于CD44−/ CD105−人口(8]。在我们的研究中,高表达水平的CD90被发现在所有房颤样本,是强阳性胚胎干细胞特征标记(Oct-4, Sox-2 Rex-1, Nanog)与维修相关的未分化状态和多能性证明之前(13,16,24,25]。重要的是,这些细胞能够分化向脂肪细胞,成骨细胞,内层细胞,neural-like细胞。另外,我们观察到,报AF-MSCs细胞分化潜力较低和更强的neuron-like细胞。我们的数据证实最近的一份报告(26),它描述了孤立AF-SCs人群从报几文化表达神经元和神经胶质的标记,包括巢蛋白,表明神经的命运,但他们潜在的态度分化成脂肪形成的能力差和成骨的血统。此外,巢蛋白不仅AF-SCs样本被发现,但也被发现在胚胎stem-derived祖细胞丰富,代表神经上皮干细胞的特征标记(27]。其他的研究(15,26,28)还认为存在的神经祖细胞中期妊娠房颤从正常怀孕。此外,我们的数据表明AF-MSCs分化,细胞的可能性。之前的研究(19)表明,房颤干细胞有能力区分cardiomyogenic表型。

这里我们发现msc从晚期妊娠第二,甚至表达了类似水平的因素多能性和自我更新,Nanog Oct-4。这是符合报告,从早期孕周细胞分离1,3,8]以及后期mid-trimester [21表达多能性的标记,Oct-4和Nanog,尽管减少Oct-4表达式被发现在房颤细胞培养15至22周的妊娠8 - 10通道(29日]。

如上所示,孤立AF-MSCs克隆可以扩大在文化15 - 20年或10通道在15 - 16周或18 - 20周胎龄,分别为(29日]。一个文化之间存在负相关的持续时间和胎龄。缓慢增长的孕龄房颤可能是由于细胞非整倍体分析,易位,反演[30.]。我们的数据表明,msc羊膜穿刺术样品每三个月学习和扩大在文化保留了增殖和分化潜能在5 - 8通道。它已被证实(11,25],c - kit阳性细胞只占1 - 5%总房颤的细胞,有着广泛的多功能,尽管这些细胞的数量增加16到22周的妊娠,但后来消失了(3,12]。最近,建议一线和中期妊娠AF-SCs是相关的,但不同的人群。对于妊娠前三个月的AFS细胞小,有较高的增长率比中期妊娠(31日]。芯片的转录组分析c - kit积极人口AF-SCs显示一个共同的基因表达谱(88.8%),但独特的特异性基因表达。对于妊娠前三个月AF-SCs更未分化的多能细胞的表型和表达更多的瀑特异基因,而中期妊娠AF-MSCs表现出较高的表达水平的基因在细胞和组织规范,但一些多能性基因的关闭(31日]。

第一次,我们的研究提供了证据AF-MSCs发生肌原性的差异表达蛋白质概要的脂肪形成的,成骨的,神经源性分化。SYNAPT G2高清晰度的质谱应用于更准确地定义了蛋白质组的变化。到目前为止,数量有限的蛋白质组学研究是人类羊膜fluid-derived msc上执行。羊水细胞提取物,含有e, AF-type,和f型细胞,进行了分析和二维数据库显示432种不同的基因产物(2400点)32]。23的表达蛋白质的变化发生在早期和晚期培养CD117的段落⁺AF-MSCs是通过蛋白质组学分析(33]。使用二维凝胶电泳和MALDI-TOF / MS方法,比较分析蛋白质组地图之间的培养从羊膜穿刺术AF-MSCs 15和18周的妊娠和骨骨髓来源msc是由Roubelakis et al。14),确定了261种不同的蛋白质与类似的功能蛋白质组学模式来自两个来源。其中,137只在AF-MSCs蛋白质在场;78蛋白独特的和相关的扩散和原始的表型。之后,作者(8)建立了一个比较蛋白质组学的地图两种形态不同粘附细胞类型(从中期纺锤形和圆形),确定两种人群的25个差异表达蛋白质。这些研究结果帮助我们识别lineage-specific蛋白质表达的变化,提出了表2。基于分类,我们的研究显示differentiation-related蛋白质,这种上涨或下调差异在细胞发生分化不同的血统(表1(一)和1(b))。此外,我们发现大约20家不同的蛋白质强烈,和过表达(6以上,10和更多的褶皱与控制)的四个分化数量(图5),参与许多细胞过程,包括蛋白质与特定的分化,如TMOD2 K1C9, K1C14, K1C16,和K2C14肌原性的分化;GPNMB, S10A4成骨分化;PTK7、GPNB ITA8, WNT5A神经源性分化。此外,我们确定了蛋白质的表达变化与未分化AF-MSC状态,称为特定分化标记(24]。一般来说,蛋白质组学分析表明类似的蛋白质组的差异和分化AF-MSCs,和只有6个蛋白在培养AF-MSCs不在,而从250年约215高蛋白质丰度从超过1400被发现,或选择在分化不同细胞系表达下调。

5。结论

这里给出的结果表明,健康女性晚期妊娠羊水msc从末二显示类似的间充质干细胞相关的形态学特点,扩散能力,表达特定的细胞表面和多能性标记,multilineage分化潜能。使用SYNAPT G2高清质谱分析技术方法,我们确定了蛋白质组学的培养AF-MSCs从妊娠末三个月,对四个不同血统的分化。250年详细的比较蛋白质组学分析蛋白质选择来自1400多个蛋白质导致明确具体的差异表达蛋白质AF-MSCs发生分化,促进研究的说明分子概要文件和关键标记表示这些细胞的识别。

缩写

AF-MSCs:	羊膜fluid-derived间充质干细胞
hdm:	高清晰度质谱
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
Oct-4:	Octamer-binding转录因子4
RT-qPCR:	定量实时聚合酶链反应
Sox-2:	性别确定区域Y-box 2。

伦理批准

研究与人类羊水是生物医学研究的伦理委员会批准维尔纽斯地区,没有。158200-123-428-122。

利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

作者的贡献

Jurate Savickiene设计研究,写论文,进行细胞培养实验。桑德拉Baronaite羊膜fluid-derived干细胞进行隔离,分化和表征。Giedre Valiuliene RT-qPCR和流量仪进行分析。Grazina Treigyte、Algirdas Kaupinis Mindaugas Valius进行蛋白质组学分析。Audrone Arlauskiene设计研究,导致数据的解释。太阳之Navakauskiene设计项目,负责数据生成,导致数据的解释和修订。

确认

这项工作是支持的研究委员会的立陶宛(项目MIP-033/2013)。作者要感谢Ilona Zaikova和Ieva Stirblyte帮助蛋白质组和RT-qPCR实验。

补充材料

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版权

版权©2015 Jurate Savickiene等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。