文摘
骨髓基质细胞(bmsc)可能在一定条件下分化成神经细胞;然而,治疗神经系统疾病的临床应用尚不清楚。目的是评估安全性,可行性和有效性的手术结合自体bmsc移植治疗我。206年我收到了外科手术的患者被分为移植)和对照组()。移植组,bmsc注入perihemorrhage区域基地神经节通过颅内引流管手术5.5(3.01 - -6.89)天之后,紧随其后的是第二个注入蛛网膜下腔通过腰椎穿刺4周后。神经损伤和日常活动与中风研究所评估量表(署),Barthel指数和兰金规模移植前和移植后6个月和12个月。我们的研究结果显示,与对照组相比,署兰金分数和规模都明显下降但Barthel指数增加6个月后移植组。有趣的是,没有显著差异观察12个月和6个月之间。期间没有transplantation-related不利影响进行了随访评估。我们的研究表明,结合自体bmsc移植手术治疗是安全的,我提供的短期疗效。
1。介绍
我排名第三大死因,心血管疾病和恶性肿瘤。大多数情况下有我的各种神经赤字,包括失语症,半身不遂,括约肌异常(1]。修复受损神经组织和神经功能的恢复是不满意与传统方法如手术、物理康复、药物、高压氧治疗(2]。
干细胞移植治疗和细胞工程已经成为候选人的各种神经损伤(3]。目前,主要来源的成体干细胞治疗的目的是骨髓、脐带血,和成年动物脂肪和大脑组织。同种异体干细胞疗法已严重限制由于难以获得,和道德和法律的限制也难以获得材料。骨髓干细胞,包括造血干细胞和骨髓基质细胞(bmsc),多功能,可以自我更新。因此,骨髓基质细胞(bmsc)作为丰富的资源,吸引了越来越多的关注multipotential分化和方便获得4,5]。有限的信息可以在治疗与自体伴着我,及其有效性、安全、时间进程和方法尚未建立。
一群我手术后患者自体bmsc移植治疗神经外科学系,聊城人民医院泰山医科大学,中国,根据前面的结果(6]。治疗是安全有效的,基于在评估与控制的结果进行移植后6 - 12个月。
2。材料和方法
2.1。一般信息
2.1.1。临床信息
移植手术是聊城人民医院伦理委员会的批准(批准ID: 20080008)。从2009年1月至2011年9月,755例急性我登记在神经外科学系。540例排除不满足标准()或拒绝参与这个研究()。215年我患者参加本研究。知情同意是获得所有的参与者或他们的授权客户。
2.1.2。包含和排除标准
入选标准用于研究(1)< 80岁;(2)格拉斯哥昏迷评分的得分为5 -;(3)我的位置在CT扫描在有限的大脑基底神经节;(4)减压手术的适应症:我卷> 20毫升CT扫描和> 10毫米的大脑中线的转变。
用于研究的排除标准是(1)我头部受伤等因素造成的,抗凝血剂,或肿瘤,排除高血压;(2)过敏史;(3)温和的我焦神经赤字没有指示进行开颅手术或手术得到疏散血肿;(4)并发慢性疾病如肝或肾功能不全;(5)凝血障碍;和(6)体温超过37.5度移植前。
开颅手术引流,得到后,选中的病人或其家属进一步咨询的潜在益处和风险的综合治疗,特别是在不确定性的临床疗效和长期的副作用。最后,完整的书面同意从114年获得的细胞植入病人。其他101个不愿接受综合治疗的患者参与了这项研究作为对照组。
2.2。治疗程序
2.2.1。手术治疗
手术术前检查后,详细的计划是为个人根据自己的临床信息和血肿体积。留置引流管保持在蛀牙的病例接受通过小骨窗开颅血肿或骨瓣开颅。
2.2.2。自体BMSC准备
骨髓愿望是由血液学家在局部麻醉下一个100级层流手术室,手术后5.5天(3.01 - -6.89)。自体骨髓(200毫升)收集添加了柠檬酸钠,防止凝血和干细胞分离试剂(Wealthlin科技有限公司、加拿大)超净工作台。这些细胞被离心机在1100 g 30分钟。在间期细胞恢复和PBS洗两次10分钟(300克)。干细胞悬液(0.5毫升)得到去除红细胞后,离心法,收获和冲洗。
2.2.3。第一个自体BMSC移植
体积为0.25毫升的收获细胞悬液稀释1:20与生理盐水。一个整除(0.5%)被在4°C神经实验室有核细胞计数和bmsc,剩下的用于移植。干细胞管理通过留置引流管,被吸引的边缘血肿腔注入和之前被移除后注入。
2.2.4。自体BMSC文化
基质细胞悬液的体积为0.25毫升被亚文化使用以下过程:收集干细胞被停职αmem(表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国、猫:12714010年代)(2 - 7.5×106细胞/毫升)的10%胎牛血清(美国的边后卫,GIBCO,卡尔斯巴德,CA,猫:16000 - 004)和接种(2.5 -10×105细胞/厘米2);媒介改变了2 - 3 d后删除不依从细胞,随后改变3 - 5 d后紧随其后。消化通过融合达到80%时进行。微生物水平,细胞计数,存活率是由第三方独立检查以确保文化素质。细胞收获和计算通道3(图1)。
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2.2.5。第二个自体BMSC移植
在局部麻醉下,bmsc悬浮液是通过腰椎穿刺注入蛛网膜下腔。之间的一个间隔4周内移植治疗周期构成。
2.3。细胞计数
有核细胞收集样本和细胞悬浮液与显微镜计数,使用流式细胞仪和综合统计。+ CD29、CD44 +、CD106 +和CD166 +细胞被公认与相应的抗体。简单地说,这些细胞被收集和孵化的单克隆抗体后1小时在室温下:CD106-PE(猫:555647),CD29-FITC(猫:555005),CD44-PE(猫:550989),和CD166-PE(猫:559263)。所有抗体都从正欲购买(CA)圣何塞。然后用磷酸缓冲盐细胞被洗3次(PBS)。细胞被衡量FACSCalibur (BD生物科学)。
2.4。功能评估
bmsc移植6个月后,病人的吞咽困难(日本久保田公司水实验),肌肉力量(MMT),肌肉紧张(MAS),语言能力(GCS)的“V”部分,计算(“计算”项目部分),认知(MoCA),和对痛苦的刺激响应性的“M”部分(GCS)分别接受神经科医生谁是失明患者的治疗根据国际统一的规模。
署得分,Barthel指数和兰金规模评估移植前和移植后6 - 12个月。统计结果进行比较之前和之后获得的移植组移植和移植和对照组之间。自体bmsc移植的安全性监测使用颅CT或MRI,血常规检查、生化指标,和肿瘤生物标记物(包括ca - 153、了无高山,AFP、CEA、CA242、CA125、CA199)移植前和移植后6 - 12个月。图2显示程序流程图的手术和监控过程的bmsc的安全性和有效性。
2.5。统计分析
数据提出了均值±SEM或中位数(四分位范围)。SPSS软件包(版本13.0;美国SPSS,芝加哥,IL)是用于统计分析。样本的分布是由Kolmogorov-Smirnov测试。学生的实验数据进行了分析t以及或非参数Mann-Whitney测试被认为是统计学意义。
3所示。结果
3.1。一般的发现
4名患者的移植组和五个从控制没有回到医院进度跟踪,被排除在最终分析。植入组的110名患者和96例对照组包括在最终的分析中。没有显著差异的人口数据,包括年龄、性别、神经系统发现,两组均值之间的流血量(、表1)。简单的排水、疏散血肿或得到颅骨切开术中执行所有的病人,没有显著差异在两组之间的手术方法(、表2)。
3.2。细胞计数
样本从206例和发送到神经有核细胞实验室和BMSC计数。单核细胞是统一与圆的身体形态,尽管一些polykaryocytes被发现(图3)。有核细胞,孤立的BMSC,总结了培养BMSC计数(表3)。
3.3。功能评估
的比例从预处理吞咽困难患者经历了完全恢复,减少肌肉力量或紧张,语言和认知损害,或减少表列出应对痛苦的刺激4。更高的速度完全恢复在上面的指数移植组(表中被发现4)。改善上述一个或多个观察神经功能评估的措施在102年(92.7%)移植组患者和对照组42例(43.8%,)。有12例和3例完全恢复的症状在MSC组和对照组,分别(表4)。
署,Barthel分数,兰金规模得到移植前和移植后6 - 12个月两组。所有的变量被证实不是正态分布。署的两组分数和兰金规模减少,Barthel的分数增加移植后6个月。署移植组分数和兰金规模较低,而Barthel分数高于对照组()。得分无显著差异的观察12个月和6个月(表之间的关系5)。
3.4。移植的安全性
7例(6.36%)移植组与低烧(< 38.5°C)在24 h后第一次移植。两个病人(1.81%)也经历了低烧第二次移植。所有9个病人的发热消退3天没有具体药理干预。除了一个病人(0.91%)在移植组与ca - 153,脑CT或核磁共振成像(图中没有异常4),血常规和生化指标,或癌症生物标记(ca - 153,分析了无,高山,法新社,东航、CA242、CA125、CA199)被确定在后续研究。病人被诊断为肺癌。没有调查随访评估期间transplantation-related副作用。
(一)
(b)
4所示。讨论
骨髓基质细胞(bmsc)使用在我们的研究中有明显的优点:(1)易于获得大量的细胞与骨髓的愿望;(2)在短时间内快速放大;(3)这些细胞穿过血脑屏障的概率(7];和(4)与自体移植免疫排斥不会发生。像干细胞,bmsc具有多向分化的潜能。他们潜在的分化成神经细胞是治疗神经疾病的基础(8]。在最近的一项研究中,bmsc移植从男女老鼠我BrdU阳性细胞明显增加,基于免疫测定BrdU和neuromarkers [9]。马哈茂德et al。10和陆等。11]表明,bmsc可以迁移到大脑损害的网站,分化成胶质细胞,表达神经元标记和受损神经元的功能被发现改善。Zhang et al。12)也表明,神经生长因子的水平显著增加,这可能促进bmsc分化成神经组织。
移植的安全是我们最大的担忧。在一项由大米等。13),自体bmsc移植治疗relapsing-progressive多发性硬化症被证明是安全的。在目前的研究中,低烧(< 38.5°C)观察9例(8.18%)从移植组的第一个24小时内移植。自从bmsc来自自体骨髓移植,我们建议这个临时发热可能源于内生致热源释放单核细胞和粒细胞或缺陷在无菌过程而不是免疫排斥。几个发现揭示bmsc与癌症之间的关系,提供假设癌症是起源于癌症干细胞。最近,据报道,bmsc移植容易分化成胶质细胞在合适的宿主微环境。脑损伤和变性总是伴随着强烈的神经胶质过多症,血脑屏障损伤和炎症。这可能引发神经胶质再生信号,削弱神经再生信号,从而偏见分化的bmsc移植14]。目前神经胶质过多症等未知是否将推动bmsc移植分化成神经胶质过多症病变或神经胶质瘤。没有报告大脑肿瘤的发展后胚胎大脑或bmsc移植。肿瘤生物标志物和脑CT或MRI异常的情况下在我们的研究中没有观察到在手术后的考试长达三年。
bmsc移植的疗效神经损伤发生通过多种途径。首先,bmsc移植都迁移到病变部位,融合到组织,取代受损的细胞,修复和重建神经回路,从而修复神经系统功能。第二,bmsc和主机之间的交互神经组织可能产生细胞因子,改善神经功能恢复。60我接受自体BMSC移植的情况下有所改善的生活质量进行的一项研究李et al。6]。在我们的研究中,细胞的数量增加到107通过三代文化。结果,91.9%(101/110),移植组病例显示改善性能和手术后6个月的生活质量,以降低NIHSS分数和Barthel高。与此同时,例()没有显著改善并不比之前。比较随访结果6和12个月移植后显示无显著差异,甚至适度降低Barthel的分数移植后12个月内表明复苏并不是长期的有效窗口。我们推测,发生了一些变化随着时间的延长,如神经可塑性、功能重组、病变胶质增生,瘢痕形成。bmsc可能不扮演重要的角色在这个队伍。我们建议bmsc移植6个月内最好的效果。
移植的位置相对于病变是由凯利等人对生存至关重要的bmsc移植治疗神经与血管的疾病(15]。目前,大多数bmsc移植在本地通过脑脊液循环或静脉访问。我们建议在基底神经节颅内注射提供的优点避免穿过血脑屏障,直接参与peri-injection站点恢复由于bmsc集群、增殖,在注射部位和迁移。引流管被撤回的边缘血肿腔注射,以避免损伤微环境之前,有严重的细胞死亡,水肿和各种炎症的产品可以妥协移植细胞的存活16]。相比之下,移植细胞病变的外围网站可以提高移植细胞的存活和幸存的神经细胞损伤(脑缺血半影),这是最好的策略,显著降低的程度和残疾患病率(17]。如果原位移植是不可能的,注入蛛网膜下腔通过腰椎穿刺提供了另一种方便、低损,可重复策略移植干细胞。所有110例移植组细胞通过腰椎穿刺蛛网膜下腔的第二次移植的消除需要反复存在管。
移植治疗bmsc的最佳时间我还不清楚,虽然从动物模型和临床数据表明,bmsc可存活当管理的一系列病理阶段(18- - - - - -20.]。我们推测,出血后的急性期可能会阻碍移植细胞的生存。一个可能的解释是,缺氧,缺血,凝固,解散和血肿的吸收引起生物活性物质的释放,如兴奋性神经递质,自由基和炎症因子,创建一个有利于发展的微环境细胞凋亡(21]。尽管一些炎症因子促进细胞增殖和趋化作用[已报告17),高水平的有害介质可能会影响移植细胞的生存。另一方面,自然恢复神经功能后出血应考虑这样的最佳时机修复神经结构不是错过了移植发生几个月或几年后。事实上,它已经被Urdzikova建议等人受伤后,延迟时间过长导致密度胶质疤痕病变部位、损害神经干细胞的生长和抑制了他们的角色在复苏22]。移植时间在我们的研究是第一个选择是大约一个星期后出血,当疏散完成和急性期几乎结束了。这可能不是最优时机移植干细胞的生存,但移植前清除引流管的平衡原位移植和可能的伤害,由于放置第二个留置。我们还执行临床评估3周后第一次输液,比如署和Barthel的得分,并发现与对照组相比没有显著性差异,虽然价值高于对照组(数据没有显示)。因此,我们做了第二个输液。自从bmsc被收购的低产量105细胞,我们放大细胞的数量为107通过三个周期。这些增加的细胞移植到蛛网膜下腔后约一个月手术是在急性期和胶质瘢痕的形成,这有助于巩固和提高疗效。
bmsc移植提供了一个新的方法治疗神经功能障碍导致的我。我们的结果显示,本研究成功的大规模临床试验在我BMSC移植患者,与先前的研究在我的治疗23,24]。然而,目前的研究也有一些局限性,如大样本大小,后续周期短,缺乏神经细胞分化的直接证据。还需要进一步的临床探索和后续研究来确定移植的最佳地点和时机,以及潜在的长期的肿瘤发生。尽管这样的缺点,改善临床结果的情况下是令人鼓舞的。自体BMSC移植是一种方便、安全、有效的方法,应该提高受伤的神经功能的恢复,提高患者的生活质量跟踪我。本研究的目的是增加细胞纯度和识别的最佳时间和最佳方法移植来治疗神经系统疾病。bmsc移植有利于治疗各种神经系统疾病进一步发展医疗技术的研究进展。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
李建欣朱和肖Yilei同样这项工作。