文摘

G9a的组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294被检查的能力扩大心脏骨髓细胞的能力。G9a的抑制组蛋白甲基转移酶基因的特定击倒或BIX01294治疗足以precardiac标记的诱导表达Mesp1和brachyury在骨髓细胞。BIX01294治疗还允许骨髓间充质干细胞(msc)心脏转录因子表达Nkx2.5,GATA4,myocardin当随后暴露在Wnt11心原性的刺激因素。孵化的BIX01294-treated msc与心脏条件媒体引发阶段亮细胞的形成,表现出类似类似细胞的形态学和分子通常从培养心房组织形式。随后BIX01294-induced聚合和分化,明亮的细胞引起cardiomyogenesis MSC-derived阶段。后者的结果表明了他们的普遍表达式的主要sarcomeric肌肉的蛋白质α辅肌动蛋白和肌。MSC-derived文化起初未处理BIX01294展出相应的阶段亮细胞和刺激sarcomeric蛋白质的表达。总的来说,这些数据表明BIX01294效用作为药理剂可以提高丰富的和可访问的能力干细胞群再生新细胞心脏修复。

1。介绍

成人心脏含有内源性干细胞有助于新肌细胞形成正常的体内平衡和反应损伤(1- - - - - -3]。常用方法隔离这些心脏祖细胞(年度"特别关注国")是由扩展文化移植的心脏组织,在年度"特别关注国"成为可识别的小圆阶段亮细胞(/)出现在一个潜在的贴壁细胞层(4- - - - - -7]。内源性年度"特别关注国"的使用治疗人类患者需要心脏切片,这可能不是一个有效的协议严重患病的个体。因此,有必要发展新的和/或改进现有的心脏治疗的干细胞来源。

的丰度和可访问性骨髓中的干细胞,吸引了相当多的研究关注这个组织为心脏修复的潜在价值(8- - - - - -11]。尽管骨髓干细胞的分化潜能超出驻留在这个组织的细胞,这些细胞的内在能力生成心肌细胞似乎低,远远低于从胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(万能)12- - - - - -15]。由于多能细胞分化成单个细胞类型是很难控制的ESCs和倾向于形成肿瘤的细胞则当引入成人组织(16- - - - - -18),我们调查了骨髓细胞的分化潜力是否可以扩大而无需细胞多能性。共享中胚层来源的骨髓和心脏表明骨髓干细胞可以获得cardiopotency没有接近多能表型。在一项研究19),我们报道,治疗nondifferentiated G9a的骨髓细胞组蛋白甲基转移酶(HMTase)抑制剂BIX01294 precardiac标记基因的诱导表达,允许这些细胞分化为应对Wnt11心原性的刺激。跟进这些初步结果,我们检查的效果直接G9a的抑制HMTase基因击倒对骨髓细胞表型,探索抑制这种酶是否会提高心脏能力的间充质干细胞(msc),最丰富的和容易分离骨髓干细胞群。新数据在这份报告中提供进一步的证据表明,G9a HMTase是一种有效的目标增强骨髓细胞cardiocompetency,这种酶的抑制引起骨髓msc表现出相似的表型和心脏内源性干细胞的潜力表现出成人的心脏。

2。材料和方法

2.1。隔离和骨髓msc的文化

动物协议机构批准的动物保健和使用委员会在纽约医学院。从股骨骨髓来自8 - 12周C57BL / 6小鼠,描述(19]。标准程序被用来获得从骨髓msc21- - - - - -23]。分解骨髓细胞resuspended在10⁶细胞/毫升Iscove修改杜尔贝科的媒介(IMDM) + 20%的边后卫。4小时后,细胞的文化塑料被移除。剩余的细胞层培养,然后分裂之前成为支流,再经过。文化在通道2,收获前达到confluency,用于实验。

一夜之间,开始治疗,msc被serum-starved IMDM然后培养新的10%的边后卫/ IMDM BIX01294各种剂量的存在与否,CHIR99021, dorsomorphin, IWP4, 1, 5-naphthyridine吡唑derivative-19 (Alk5抑制剂,Stemgent) 3-bromo-7-nitroindazole, trichostatin(开曼化学),SP600125 PD173074和/或PNU74654 (Tocris生物科学)。两天后,细胞RNA的收获或用新鲜培养基培养的边后卫/ IMDM组成的10%,加上或者减去Wnt11,七天。Wnt11是提供从Wnt11-secreting细胞条件培养基稀释50%,所述[24),与蛋白质的水平验证了免疫印迹。Immunofluorescent染色的细胞进行了金属堆焊后进入Lab-Tek 8-well室幻灯片(Nunc)或在组织学上cytospun幻灯片(25,26]。

2.2。小发夹RNA(成分)击倒

击倒G9a的HMTase使用gene-specific成分进行了质粒GI540026和GI540029(从OriGene),表示在这项研究shRNA676和shRNA3291参考G9a的初始核苷酸位置序列shRNA认可的。控制炒shRNA构造和空嘘克隆载体,由制造商提供,作为消极的控制。长期文化的骨髓细胞(19)与使用GeneCellin转染质粒转染试剂(BioCellChallenge)。细胞吸收质粒被选下1μM嘌呤霉素,多重文化每组蛋白质和基因表达。

2.3。心房文化和一代的心脏条件培养液(CCM)

心脏组织从8 - 12周C57BL / 6小鼠。切除心房被绞进1毫米³片段,用PBS洗净,用胰蛋白酶消化10分钟,在电镀之前明胶涂层菜肴的14天IMDM含有20%的边后卫+笔/喉炎的症状。培养基收集每周两次,透过0.2μm polyethersulfone膜,储存在CCM−20°C。减少批次变化,CCM收集来自多个批次的心房文化和彻底混合之前过滤。

2.4。形成、收获和明亮的细胞培养的阶段

骨骨髓来源msc培养没有或8的存在μM BIX01294 48小时。随后,细胞培养新鲜IMDM包含10%的边后卫,50% CCM 2周,每周与媒体改变了两次。此后,文化孕育了CCM 50%,地塞米松,10%的边后卫/ IMDM额外的2周。后一个时期,独立的细胞被媒体定期收集去除,然后轻轻贴壁细胞脱离文化接触后0.5毫米EDTA在室温下2分钟。细胞释放的EDTA是结合初始细胞隔离池的数量低附着的细胞。目视检查验证的人口集中隔离由中国人民银行的文化。收集/聚合了悬滴4天前转移到组织培养菜肴在CCM稀释1:额外的4周1在10%的边后卫/ IMDM。

2.5。RNA隔离和PCR扩增

获得的总RNA与Quick-RNA MiniPrep工具包(Zymo研究)并使用Moloney reverse-transcribed小鼠白血病病毒逆转录酶(Promega)。比较定量实时PCR (qPCR)都使用了正序连赢SYBR绿色FastMix火箭qPCR大师混合(量子生物科学),所述[19,27]。表达水平的表型标记基因被规范化GAPDHΔΔCt表达和计算的方法。未配对学生的统计差异比较测试使用InStat统计应用程序(GraphPad软件)。意义被定义为,对应于平均数标准误差的误差。

2.6。Immunofluorescent染色

如前所述(执行Immunofluorescent标签19,28,29日]。组蛋白的甲基化3赖氨酸9 (H3K9)评估使用兔子anti-dimethylated H3K9抗体(4658 p、细胞信号技术),细胞与福尔马林固定后,透化作用与0.25% Triton-X100 / PBS 10分钟,和10%的隔夜块山羊血清在4°C / PBS。Islet1染色,细胞与福尔马林固定的10分钟,其次是削弱固定的5分钟,然后用0.3% permeabilized triton / 10% BSA / PBS。鼠标anti-Islet1 (39.3 f7,杂种细胞发育研究银行;DSHB)应用阻塞隔夜后1% BSA / 0.3米甘氨酸/ PBS。染色与anti-muscleα辅肌动蛋白(EA-53σ),肌间线蛋白(D8281σ),肌(9 d10, DSHB) connexin40 (Cx40, 36 - 5000,生活技术),Cx43(13 - 8300,生活技术),CD90(553016年,BD Pharmingen)和本来(16 - 598,eBioscience)抗体后甲醇或多聚甲醛固定10分钟,多个PBS洗,隔夜孵化与5% BSA / PBS阻塞的解决方案。DyLight 488共轭二次抗体(杰克逊ImmunoResearch)用于标签绑定主要抗体,收购时灰色信号成像710年蔡司LSM共焦显微镜使用相关的禅宗成像软件(蔡司)。处理后细胞样本用于免疫染色,细胞复染色和4′,6′-diamidino-2-phenyindole (DAPI;生命技术)来识别核,这是根据其捕获蓝色荧光。提高感知DAPI信号在数字图像,蓝色的一小部分信号输出到绿色通道使用图像J软件(http://imagej.nih.gov/ij/)。

2.7。免疫印迹

溶解的蛋白质提取骨髓细胞里帕缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,钠脱氧胆酸盐1%,十二烷基硫酸钠0.1%,和1% Triton x - 100)含有哺乳动物ProteaseArrest蛋白酶抑制剂(G-Biosciences)。总蛋白聚丙烯酰胺凝胶上分离,转移到聚乙烯二氟化物膜,和孵化兔抗体特定于总组蛋白H3(微孔)dimethylated-H3K9 G9a HMTase(17 - 10046,细胞信号技术),或GAPDH (ab8245 Abcam)。蛋白质被发现使用碱性phosphatase-coupled anti-rabbit IgG抗体(Promega)和PhosphaGLO储备美联社衬底(KPL, Inc .)。

3所示。结果

3.1。击倒G9a的HMTase促进Precardiac基因表达

BIX01294 G9a的选择性抑制剂HMTase [30.- - - - - -32),这是一个使甲基化酶,这种酶目标赖氨酸在组蛋白H3 (H3K9) [920.,32,33]。正如我们先前的研究已经表明,BIX01294治疗precardiac祖标记骨髓细胞的诱导表达,我们试图验证这G9a的表型变化是由于抑制HMTase。长期骨髓文化受到BIX01294 48小时显示明显减少H3K9甲基化(数字1(一)-1(e)),而不改变总组蛋白H3的水平(图1(e))。G9a HMTase水平也影响BIX01294(图1(e)),这是按照G9a BIX01294干扰HMTase活动的机制是由于竞争结合酶的底物结合位点30.]。减少BIX01294 H3K9甲基化的反应相当的效果观察直接抑制G9a的HMTase表达基因击倒(图1(f))。G9a的击倒HMTase,两个截然不同的gene-specific shrna被雇佣,既抑制生产G9a的HMTase蛋白质(图1(f))。两个G9a HMTase-specific shrna大大减少H3K9甲基化,在不影响组蛋白H3蛋白质水平(图1(f))。相比之下,无论是炒shRNA还是空向量减少G9a HMTase表达式或H3K9甲基化(图1(f))。当G9a HMTase撞倒了gene-specific shrna, precardiac标记物的表达Mesp1和brachyury诱导的骨髓细胞(图1(g)),这是符合我们之前的结果显示感应这些precardiac基因的骨髓细胞在回应BIX01294 [19]。因此,治疗减少G9a HMTase活动可以引起骨髓细胞表现出特征的分子标记precardiac早期胚胎的中胚层细胞。

3.2。响应BIX01294骨髓msc

建立BIX01294可以诱导表达precardiac表型标记在异构骨髓的文化中,我们研究了这种药物是否会有更大的功效在促进cardiocompetency如果开始人口进一步浓缩干细胞。因此,我们调查的反应msc、最丰富、容易分离骨髓干细胞群,但拥有有限的心脏的潜力。因为我们没有假设msc的行为完全相同一样长期骨髓BIX01294文化,我们广泛地分析了这种药物的功能在促进precardiac基因表达在msc。确定BIX01294拥有独特的能力扩大MSC细胞表型的潜力,这些实验都是在治疗的同时与其他药理试剂,如BIX01294,被证明为协助效用多能干细胞的生成和/或维护,但只有作为复合治疗(34- - - - - -40]。具体地说,我们研究骨髓间充质试剂的反应,抑制一氧化氮合酶(3-bromo-7-nitroindazole;GSK3 BNI),β(CHIR99021), BMP (dorsomorphin), Wnt (IWP4), TGFβ(1、5-naphthyridine吡唑derivative-19;NPy19), FGF (PD173074),β连环蛋白(PNU74654) c-Jun n端激酶(SP600125),和组蛋白脱乙酰酶(trichostatin;TSA)活动。msc是处理这些不同的试剂或BIX01294一系列剂量和曝光,随后分析了实时定量PCR (q)转录因子的表达Mesp1和brachyury,识别precardiac在早期胚胎中胚层祖细胞(41- - - - - -44]。为了应对BIX01294的最佳剂量,msc 195 - 98倍增加的生产Mesp1和brachyury基因表达,分别与参与(图2(一个))。CHIR99021产生了轻微的增强Mesp1和brachyury转录,但增加在应对这种药物是远远低于获得BIX01294(图2(一个))。没有其他的药理试剂显著增强Mesp1和brachyury表达参与控制水平(图2(一个))。剂量反应分析确定有效的刺激BIX01294浓度precardiac基因表达范围从4 - 12μ米,最佳剂量是8μM(图2 (b))。时间过程分析表明,48小时BIX01294治疗是最佳的最大化precardiac基因表达的诱导BIX01294(图2 (c))。接触BIX01294了很长一段时间没有有益的和生成的减少precardiac基因表达水平比为期两天的治疗。

证明BIX01294促进precardiac基因表达后,我们确定这种治疗是否会提高msc接受myocardiogenic分化的能力。msc培养没有或8的存在μM BIX01294 48小时,在随后的孵化与心脏分化Wnt11刺激因素。文化与WNT11后,细胞分离和分析供qPCR心脏基因表达。文化没有预曝光BIX01294显示只有最小的心脏基因的表达是否随后Wnt11处理(图3(一个))。相比之下,文化与BIX01294 preincubated显示一个健壮的回应Wnt11心脏转录因子的表达Nkx2.5,GATA4,myocardin40岁,是放大19日37-fold控制权文化(图3(一个))。然而,sarcomeric转录的基因编码的蛋白质显示小增强控制水平(图3(一个))。疣状显示,尽管后者结果与控制文化,BIX01294 + Wnt11-treated文化显示小补丁心肌蛋白表达阳性的细胞(数字3 (b)- - - - - -3 (d))。

3.3。BIX01294治疗提高阶段的细胞从骨髓msc的形成

msc的心脏容量的进一步测试是通过将心脏的细胞环境。这些实验,文化上层清液从成年老鼠心房文化被用作一种心脏条件媒体(CCM)治疗preincubated 48小时的msc BIX01294的存在与否。CCM, 48小时内BIX01294-treated MSC文化开始的小圆阶段亮细胞(/)出现在粘附细胞层(数据4(一)和4 (b))。在CCM随后天的孵化期间,从BIX01294-pretreated文化传播/整个培养皿,人口上显示剩余的贴壁细胞(数字4 (c)和4 (d))。并行文化msc孵化与CCM没有预处理BIX01294没有显示类似的中国人民银行形成的破裂,虽然少量/摆脱这些控制文化随着时间的推移(数字4 (e)和4 (f))。骨骨髓来源的收益/估计通过计算低粘附细胞释放的短暂EDTA曝光后,从文化收集与CCM潜伏期2周。平均而言,从10开始的细胞群⁶细胞,生成的CCM孵化和低贴壁细胞,分别从存在与否的msc预处理BIX01294(图4 (g))。/中生成BIX01294 + CCM-treated MSC文化似乎形态出现的类似于/自发地从心房文化(图4 (h))。进一步描述/收获来自心房和BIX01294 + CCM-treated MSC文化表示,这两个种群之间的相似之处不仅仅是形态。Immunofluorescent染色分析表明,心房和MSC-derived /共享的表达干细胞标记Sca1, CD90、Islet1(图5)。此外,中国人民银行细胞群都是积极的缝隙连接蛋白connexin43(数据5 (d)和5(我))和connexin40(数字5 (e)和5 (j)),后者被发现在这两个人口只有当信息联系得以形成。

3.4。/源自BIX01294-Treated msc是心脏的能力

确定骨骨髓来源/能够接受心脏分化,我们检查了文化条件促进心肌表型。/产生msc预处理的存在与否BIX01294被挂掉了4天,聚合被转移到组织培养塑料和随后的CCM孵化。文化是收获qPCR转录的RNA和检查的心肌基因(图6)或immunofluorescently彩色作为sarcomeric蛋白质的表达的直接测定(图7)。基因表达分析显示BIX01294预处理的msc /生产,表现出显著的增强Nkx2.5、肌肉α-actinin(Actn2),肌基因表达,13 - 17,52-fold更高,分别比/收获从并行文化未曝光G9a HMTase抑制剂(图6)。这些早期心肌细胞基因相比,BIX01294生成/没有展览后期心肌标记心肌肌钙蛋白I(cTnI),在这些条件下培养(图6)。Immunofluorescent染色并行文化展示相关的蛋白质含量,结果α辅肌动蛋白和肌显示整个中国人民银行文化源自BIX01294-treated msc,但缺席BM /文化,远离BIX01294(图7)。此外,高的放大视图BIX01294 / CCM-generated PBC文化表明这些sarcomeric蛋白质开始被显示在一个有组织的模式(数据7 (d)和7 (f))。总的来说,这些数据表明msc暴露BIX01294随后孵化在CCM生成的细胞表现出一种类似内源性心脏祖细胞的表型分化潜能。

4所示。讨论

骨髓提供一个可访问的和丰富的干细胞的来源,它一直被研究用于心脏修复(8- - - - - -11]。然而,动物实验和临床试验已经产生了不一致的结果,据一些已发表的研究,不祥的结果(8,45- - - - - -47]。本研究扩展了我们之前的努力扩大骨髓干细胞的表型潜力,以提高它们的心脏能力。遗传和nongenetic方法生成的发展表明,成年体细胞的分化潜能的细胞则可以扩大生产多功能表型(34,48,49]。与骨髓干细胞并不是我们的目标,产生多能细胞,但开发方法,将扩大其分化潜力足以获得心脏主管表型,而没有使细胞多能性。自骨髓和心脏都是中胚层衍生品,我们假设骨髓干细胞的表型潜力可以扩大pan-mesodermal因此cardiocompetent细胞。我们检查骨髓干细胞对应对各种各样的分子,已经被证明可以帮助生产万能当结合其他治疗,但不能促进多能性的本身。筛选的分子中,唯一一个明显调节precardiac标记和允许骨髓细胞应对G9a的HMTase抑制剂BIX01294心原性的信号。

在先前的研究中,我们显示骨髓细胞暴露BIX01294引发pan-mesodermal潜在但不赋予能力为内胚层和外胚层的血统19]。这份报告提供证据证实G9a HMTase授予心脏nondifferentiated骨髓细胞的能力,抑制这个基因的诱导表达的特定击倒precardiac祖细胞标记。瞬态药理G9a的抑制与BIX01294 HMTase允许骨髓msc回应心原性的刺激,如Wnt11表示的upregulation主要心脏转录因子Nkx2.5,GATA4,myocardin。BIX01294 / Wnt11治疗也生成小补丁的肌纤维蛋白阳性细胞,尽管这些肌肉分子的表达是不够广泛反映在整个文化的基因表达的整体水平。当msc预处理与CCM BIX01294随后被孵化,生成的文化/表现出形态和分子特征类似于细胞来自心房文化油然而生。心房/,也称为cardiosphere-forming细胞,被认为包含内生心脏祖细胞,导致在成人心脏肌细胞更新4- - - - - -7]。像内源性心脏祖细胞,骨骨髓来源/源自BIX01294预处理和孵化CCM显示的证据表明,他们可以区分心脏细胞。当这些/聚合悬滴和进一步孵化CCM,骨骨髓来源的细胞表现出的表达显著增强α辅肌动蛋白和肌,这是两个主要的sarcomeric分化心肌细胞的蛋白质表现出早期胚胎(50,51]。虽然没有心脏标记cTnI[末52,53]表明,悬滴试验没有产生完全分化的细胞,迅速增长的条纹观察α辅肌动蛋白和肌表明myofibrillogenesis骨骨髓来源/被启动。msc培养没有BIX01294预处理与CCM还生产/当孵化。然而,收益率远低于展出了BIX01294经过不同的文化。与来自BIX01294-treated msc /, /从文化未曝光BIX01294没有显示cardiomyogenesis的证据。因此,关键在促进cardiocompetency BIX01294从骨髓细胞,当细胞培养在相同的条件下,但没有预曝光这个试剂,不显示sarcomeric蛋白表达。

BIX01294已被证明是非常具体的针对G9a HMTase [30.,32),尽管这并不排除这种药物的疗效在培养一个心脏有能力从骨髓细胞表型是由于其副作用在其他无特征的目标。然而,相应的结果中观察到反应BIX01294治疗和G9a HMTase击倒似乎表明BIX01294对细胞表型的影响可能是由于这种酶的抑制。此外,有整体降低H3K9甲基化之间的相关性和影响G9a的HMTase击倒或BIX01294暴露在促进骨髓细胞表型的改变。研究活动G9a的HMTase表明赖氨酸9组蛋白H3是这种酶的主要底物虽然赖氨酸27组蛋白H3已被确定为一个额外的目标(20.,32,33,54]。最近的研究表明,G9a HMTase也可能修改几个非组蛋白的蛋白质(55,56],我们目前的数据并不排除候选分子靶点负责赋予心脏骨髓细胞的能力。然而,当这种酶组蛋白的监管活动的广泛的描述和对基因转录的影响被认为是有关,似乎赖氨酸的甲基化状态可能9和赖氨酸27组蛋白H3是关键决定因素在影响干细胞是否展品心脏的潜力。

染色质重塑在分化被认为扮演至关重要的角色限制细胞表型。Dimethylation G9a的组蛋白H3 HMTase与转录镇压[20.,56,57]。已经假定效用的BIX01294协助“诱导多能性”细胞的生成是由于干细胞基因的反转录镇压的能力(34,48,49]。尽管这些属性允许BIX01294帮助赋予多能从成年体细胞表型,它必须伴随着其他药理和/或遗传操作。我们的研究表明,影响BIX01294介导的染色质结构和基因表达的足够自己扩大骨髓msc的表型潜力足以让细胞主管产生心脏细胞,可能其他的中胚层的血统。

总之,我们报告,骨髓msc可以使心脏主管瞬态接触G9a HMTase抑制剂BIX01294。早期中胚层的表情,precardiac标记Mesp1和brachyury为了应对BIX01294接触表明,msc被转换为pan-mesodermal, cardiocompetent细胞表型。随后孵化BIX01294-treated msc与CCM提示/碳化的形成类似于内源性心脏祖细胞,增加接受心脏分化的能力。总的来说,这些数据表明,BIX01294效用作为协议的药理成分,可以用来提高能力丰富的和可访问的干细胞群的心脏修复。未来实验研究如何比较BIX01294-treated msc和内源性心脏祖细胞在动物移植化验以及是否G9a HMTase抑制也有类似的对心脏的影响成人干细胞的潜力将考验本研究提出的假设。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢纽约医学院的支持/威彻斯特医学中心转化干细胞中心。赞助提供的工作是纽约医学院Castle-Krob研究养老支持纽约医学院校内研究支持计划。