文摘

结直肠癌(CRC)是全球最常见的和致命的恶性肿瘤之一。结直肠癌患者的预后不良是由于药物抗性和癌症转移的发展。最近骨桥蛋白(OPN)在大肠癌与干细胞相关的属性。本研究进一步检查OPN在CRC的临床病理的意义及其对化学抗性的影响和转录的干细胞标记。我们检查了84年OPN的转录水平CRC患者和相关的表达与临床病理的参数。OPN的关联超表达的转录干细胞标记和对化疗的反应在DLD1-OPN overexpressing克隆和CRC患者也被调查。我们的结果表明OPN是明显在CRC,及其超表达与肿瘤分期和预后不良。过度的CRC诱导OCT4和SOX2表达式在体外和与SOX2在CRC患者过度。此外,DLD1-OPN overexpressing细胞显示在铂治疗,增强生存能力和OPN表达在CRC患者高耐oxaliplatin-involved化疗治疗。因此,CRC overexpressing细胞OPN证明干细胞属性和OPN抑制是一个潜在的治疗方法应对CRC进展和药物抗性。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是全世界第三个最常见的恶性肿瘤1]。每年有超过120万人患CRC在全球范围内,有超过600000名患者死于该病于2008年(2]。发病率和死亡率从亚洲国家(CRC正在迅速增加3]。CRC发病率和死亡率已下降改善测试的结果,使癌症的早期检测,当它可以更容易地接受手术治疗和化疗和放疗4]。尽管这些临床治疗的进步,CRC患者的总体预后仍不满意,由于药物抗性和癌症转移的发展。因此,重要的是要了解CRC细胞获得生存能力在化疗和转移到遥远的地区,为了开发新的治疗目标和方法来改善预后和CRC患者的存活率。

骨桥蛋白(OPN),小的一员Integrin-Binding配体N-linked糖蛋白(兄弟姐妹)的家人,表示在正常矿化组织,上皮细胞的新陈代谢活跃的导管,和一些肿瘤组织(5]。OPN是大多数肿瘤生物学方面的参与。通过其多元化的报道功能与扩散有关,生存,血管生成,逃避宿主防御,肿瘤的发展,入侵和转移,OPN涵盖多种癌症的标志(6]。事实上,OPN表达明显与各种癌症肿瘤的阶段。

在结直肠癌,抑制差别OPN对这些在体外扩散和在活的有机体内致瘤性和抑制在体外入侵和迁移能力(7]。我们在之前的研究也显示,稳定的超表达细胞DLD1 OPN的显著诱导蛋白质表达和分泌的OPN水平,和DLD1细胞的迁移能力8]。此外,OPN超表达与上皮间充质通路的激活通过感应的转折和蜗牛的差别,对这些钙粘蛋白。

最近,OPN与癌症干细胞有关自然在结肠直肠癌。OPN分泌在大肠癌肿瘤细胞CD44v6表达增加有关干细胞通过激活Wnt /β连环蛋白通路,促进迁移和转移(9]。本研究将进一步调查在体外OPN的过度增长反应化疗。此外,最近的一项研究表明OPN沉默抑制转录的关键转录因子具备干细胞,SOX2 Oct3/4, Nanog在体外和恶性胶质瘤干细胞样细胞的性格和致瘤性在活的有机体内(10]。本研究还将研究OPN的影响过度CRC具备干细胞的细胞,通过调查其与转录相关的干细胞标记。

2。材料和方法

2.1。病人和标本

人类的样本收集协议已经批准的机构审查委员会(IRB),香港大学的所有临床研究根据表达的原则进行了《赫尔辛基宣言》。通知参与者取得书面同意。组织样本来自84名患者,立即在液态氮冷冻,保存在−80°C到分析。临床病理的数据从数据库获得病人的医院。

2.2。细胞系、组织文化、转染试剂

建设稳定的OPN overexpressing或矢量控制细胞DLD1是前面描述的8]。DLD1-OPN稳定的克隆和矢量控制是维护在DMEM 10%胎牛血清和抗生素(表达载体,卡尔斯巴德,CA) 5%的股份₂在37°C。

2.3。RNA提取

总RNA提取使用试剂盒试剂和Purelink RNA迷你包(生活技术,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。2000年NanoDrop RNA产量和品质进行了分析(热科学)。

2.4。互补脱氧核糖核酸合成和定量实时聚合酶链反应

500 ng总RNA与PrimeScript第一链cDNA相对地转录合成装备(豆类、东京、日本)按照制造商的指示。实时PCR进行最后一卷15μL包含1.5μL RT成绩单,0.2μ每个引物的M, 1 x火箭参考染料,和7.5μL由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(火箭)巴塞尔(瑞士罗氏诊断)。每个基因的没有包括RT记录控制,确保信号是真正由目标基因扩增。引物序列如下:OPN-Forward底漆:5′-TGGGGGTCACTGCAATTAG-3, OPN-Reverse底漆:5′-TGGGGCTAGGAGATTCTG-3′;GAPDH-Forward底漆:5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′, GAPDH-Reverse底漆:5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′;OCT4-Forward底漆:5′-GTGGAGGAAGCTGACAACAA-3 OCT4-Reverse底漆:5′-GCCGGTTACAGAACCACACT-3′;SOX2-Forward底漆:5′-GACAGTTACGCGCACATGAA-3 SOX2-Reverse底漆:5′-TAGGTCTGCGAGCTGGTCAT-3′;Nanog-Forward底漆:5′-GTGATTTGTGGGCCTGAAGA-3 Nanog-Reverse底漆:5′-ACACAGCTGGGTGGAAGAGA-3′。实时PCR进行了使用ABI 7900 ht快速实时PCR系统(应用生物系统公司,福斯特,CA) 10分钟95°C,紧随其后的是40周期在95°C的15秒和56°C 1分钟。每个试验做一式三份,平均计算,和目标mRNA的表达水平是规范化的表达GAPDH(δCt);δCt越高,降低目标基因的表达。

2.5。细胞生存能力分析

相同数量的细胞被播种在96孔板24小时,然后接受治疗化疗药物5μ米铂或50μ米5 -氟尿嘧啶(5 fu)。药物治疗后细胞生存能力在72 h决心使用3 - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT)(表达载体)。

2.6。免疫组织化学染色

如前所述(执行免疫组织化学染色11]。部分是主要抗体孵育anti-OPN(位于马里兰州Rockville OriGene技术)和anti-SOX2(细胞信号技术,丹弗斯,MA) 1: 100稀释一夜之间在潮湿的室4°C。一个评分系统相关的程度和强度使用肠上皮细胞组织化学染色。阳性染色强度得分为0,阴性;1、弱;2、温和;3、强大的由两个独立的观察员。阳性染色的程度得分为1(< 10%),2(10 - 50%)和3 (> 50%)。最后的得分是由繁殖强度得分,得分和程度的范围从0到12。

2.7。统计分析

协会OPN水平与干细胞标记测试皮尔逊相关性。学生的以及用于比较两组之间的差异。存活率与生存率较进行了分析。所有这些统计分析与SigmaPlot 10.0 (Systat软件公司,圣何塞、钙、美国)。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。OPN在CRC过表达

我们第一次OPN的表达相比84年CRC的成对nontumor粘膜CRC患者。OPN的表达是由存在决定和表达为褶皱变化到邻近nontumor组织使用方法。我们的研究结果表明,意味着在CRC OPN的表达显著高于nontumor组织(7.4倍,)。

3.2。OPN表达降低与先进的肿瘤的阶段

我们下一个检查的临床病理的意义OPN超表达(表达为(CRC,nontumor组织),也就是说,低值代表更高OPN超表达84年在CRC) CRC患者(表1)。OPN超表达并不与年龄、性别、肿瘤大小,但有一个更高的趋势OPN过度患者淋巴结转移()和远处转移()。此外,当我们把患者分为低阶段(没有淋巴结和远处转移)和高级阶段(淋巴结和/或远处转移),患者更高的CRC阶段显示明显高于OPN超表达()。OPN超表达也显著相关肿瘤阶段(,;图1 (b))。此外,我们的研究结果表明OPN超表达与CRC的年级。低分化CRC,往往是更积极的显示更高的OPN超表达与好或中度分化CRC(相比)。这些结果表明OPN表达降低与CRC的疾病进展。

3.3。OPN超表达与预后不良相关

OPN的关联超表达和无病生存期(DFS)和总生存期(OS)。我们将84年的CRC患者分成2组根据OPN超表达他们的CRC的地位。对病人的OPN超表达低于平均水平的84名患者(),他们被视为低OPN超表达。另一方面,对于那些OPN超表达是高于平均水平(),他们被视为高OPN超表达。我们首先比较两组患者之间的DFS利率。虽然高OPN过度病人似乎有比这更糟糕的DFS弱超表达组,差异无统计学意义(;图1 (c))。另一方面,患者低OPN过度患者有一个更好的操作系统比高OPN超表达(;图1 (d))。这些结果表明OPN表达降低与CRC患者的不良预后相关。

3.4。OPN的相关性进行靶向治疗与干细胞标记物的水平

调查的影响OPN超表达的转录干细胞标记,我们确定的转录水平OCT4、SOX2, Nanog [12)在两个DLD1-OPN overexpressing细胞DLD1-OPN # 1和# 3和矢量控制DLD1-Vc [8)存在。如图2(一个),OPN成绩单DLD1-OPN # 1和3的表达显著高于矢量控制。OCT4的表达式和SOX2在DLD1-OPN也明显高于稳定的克隆与矢量控制(数据相比2 (b)和2 (c)),这表明OPN的超表达诱导的转录OCT4 SOX2。此外,OPN的感应效果超表达SOX2在高于OCT4。另一方面,尽管Nanog在DLD1-OPN稳定的克隆表达出现高于在矢量控制,区别并不显著(图2 (d))。

我们下一个检查的相关性与OCT4 OPN, SOX2, Nanog在CRC患者。过度的OPN在CRC呈正相关SOX2超表达(,;图3(一个)),这表明高的肿瘤细胞OPN表达具有癌症干细胞的特性。另一方面,OPN在CRC过度不与Nanog超表达(,),这是按照我们的细胞系实验结果。此外,过度OPN在CRC没有与OCT4超表达(,),这是不符合我们细胞系数据。

我们进一步研究了OPN和SOX2蛋白表达的相关性在11 CRC患者使用免疫组织化学。之间存在着正相关CRC标本检测OPN和SOX2表达(,;数据3 (b)和3 (c))。

3.5。OPN超表达诱发药物抗性铂治疗

OPN表达降低与药物抗性在小细胞肺癌,乳腺癌和神经胶质瘤(13- - - - - -15];然而它的角色在CRC药物抗性还没有被证明。检查CRC细胞OPN进行靶向治疗对药物抗性的影响,我们把DLD1-OPN稳定细胞和矢量控制与铂和研究者用常见chemodrugs治疗CRC患者和确定的相对数量可行的细胞MTT试验72小时后。对CRC细胞生存的影响表示成比例的可行的细胞治疗与汽车相比。如图2 (e)后,我们的研究结果表明,5μ米铂治疗,可行的矢量控制细胞的比例(43.0%)明显低于DLD1-OPN # 1 (56.7%,)和DLD1-OPN # 3 (53.3%,)。另一方面,OPN过度不提高DLD1细胞的药物抗性50μM(图5 -氟尿嘧啶治疗2 (f))。

我们也比较了OPN过度CRC患者接受化疗。55管理化疗治疗后患者详细的临床信息包含在这个比较。在这些病人中,29人敏感治疗(肿瘤对化疗和没有至少1年内复发),26人抗(肿瘤对化疗或1年内复发)。化学抗性的病人显示更高的OPN过度敏感的患者相比(与−2.427−0.385,)。

4所示。讨论

此前,OPN在大多数肿瘤生物学方面的参与报道。通过其多元化的报道功能与扩散有关,生存,血管生成,逃避宿主防御,肿瘤的发展,入侵和转移,OPN涵盖多种癌症的标志(6]。事实上,OPN表达明显与各种癌症肿瘤的阶段。

在结直肠癌,抑制差别OPN对这些在体外扩散和在活的有机体内致瘤性和抑制在体外入侵和迁移能力(7]。我们在之前的研究也显示,稳定的超表达细胞DLD1 OPN的显著诱导蛋白质表达和分泌的OPN水平,和DLD1细胞的迁移能力8]。在这项研究中,我们进一步研究了CRC的OPN表达的临床病理意义及其与茎状的财产和药物抗性。

我们表明,OPN在CRC超表达与更高的年级,肿瘤阶段,和生存的CRC患者,这表明OPN超表达与预后不良相关。茎状的CRC的细胞被建议与肿瘤进展,转移,和穷人的生存16,17),这是按照我们患者的临床病理特征观察高OPN超表达。此外,OPN在结直肠癌与癌症干细胞。OPN分泌在大肠癌肿瘤细胞CD44v6表达增加有关干细胞通过激活Wnt /β连环蛋白通路,促进迁移和转移(9]。本研究进一步研究OPN的影响过度具备干细胞关键转录因子SOX2音标,OCT4、和Nanog OPN转录镇压的沉默已经证明在茎状的胶质母细胞瘤细胞在活的有机体内(10]。OCT4和SOX2的表达明显高于DLD1-OPN稳定克隆# 1和# 3,相比与矢量控制。此外,他们的表情DLD1-OPN # 1中更高层次的OPN表达高于DLD1-OPN # 3,进一步表明OPN过度诱导的表达OCT4 SOX2,这与CRC细胞的干细胞特性相关联(18]。接下来我们研究了超表达的相关性与OCT4 OPN和SOX2在CRC患者。按照我们的在体外在CRC显著相关数据,OPN过度SOX2超表达。有趣的是,观察OPN和OCT4之间没有相关性。作为我们的在体外数据显示,DLD1-OPN # 1和# 3展示了22.8倍和5.7倍SOX2感应,分别只有3.6倍和2.2倍的感应OCT4中检测出DLD1-OPN # 1和# 3,分别,我们建议的相关性OPN与OCT4 SOX2比,因此只在我们的病人队列观察这种相关性。尽管如此,就像我们所看到的SOX2在CRC干细胞因子增强CRC细胞增殖,迁移和入侵19,20.),我们的研究结果表明OPN过度CRC诱导干细胞性质的细胞通过SOX2超表达。

这项研究也表明,DLD1-OPN稳定克隆显示改善生存率在铂治疗。此外,DLD1-OPN # 1显示OPN表达高于DLD1-OPN # 3是对铂的影响,表明OPN确实过度监管此类药物抗性。此前,据报道,差别OPN对这些增强在体外辐射敏感度的CRC细胞(7]。本研究进一步加强OPN的不利影响过度CRC患者的治疗。据我们所知,这是第一个报告显示OPN过度诱导oxaliplatin-chemoresistance。我们相信这种耐药效果与干细胞的相关属性OPN overexpressing细胞,oxaliplatin-resistant CRC细胞表现出更高水平的干细胞标记SOX2和OCT421,22]。我们也调查了OPN的影响过度在55 CRC患者对化疗的反应包括铂。平均OPN的过度26耐药患者高于29敏感的患者,这表明OPN表达CRC患者可能是一个生物标志物预测响应涉及铂的化疗。同时,OPN的影响抑制oxaliplatin-based化疗的CRC患者需要进一步调查。

最近,CD44v6被报道为结直肠CSC标记所需的转移潜力二者,OPN, HGF, SDF-1二者(CD44v6的表达增加9]。OPN一直建议激活与HGF和SDF-1相关的通路。结扎HGF的OPN蛋白导致激活受体(满足)和已知的敏感性增加乳腺上皮细胞系的细胞迁移促进效应HGF /遇到[23]。OPN强与间充质基质细胞移植肿瘤的生长通过互动表达CCL5和癌症相关的纤维母细胞标记包括SDF-1 [24]。这些结果表明OPN在CRC可能过度增强癌细胞的具备干细胞特性通过感应CD44v6的表达,以及通过激活或upregulation HGF和SDF-1,也是upregulators CD44v6。

这项研究中,结合其他OPN的研究结果(了25]),表明OPN是一种针对癌症的治疗目标。沉默的OPN使用RNAi技术,使用特定抗体阻断OPN活动,和小分子抑制剂可能抑制肿瘤进展和转移,提高对化疗的反应在儿童权利公约,并可能在其他类型的癌症。

5。结论

这项研究表明OPN超表达与肿瘤进展和CRC患者预后不良,CRC细胞可能通过诱导干细胞属性所反映的SOX2的过度表达,这是与转移能力和生存在oxaliplatin-involved化疗治疗。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。