小鼠骨胳肌源性干细胞的动态支持文化改善他们的心原性的潜力在体外

文摘

缺血性心脏病是主要的死亡原因在西方国家和它的全球负担正在增加。这通常涉及不可逆转的变性和心肌组织的损失导致预后不良和致命的结果。自体的细胞有可能再生受损的心脏组织细胞治疗方法的理想来源。这里,我们条件文化的不同方法相比提高了产量和心脏发生的小鼠骨胳肌源性干细胞的潜力。不依从细胞的一群被preplating隔绝骨骼肌,应用细胞培养条件不同支持集群的形成。与静态培养条件,动态文化有或没有先前的悬滴preculture导致显著增加集群直径和心脏上的特定标记蛋白的表达和mRNA水平。全细胞膜片钳研究显示相似起搏器动作电位和响应性心脏具体药理刺激。这些数据表明,骨胳肌源性干细胞有能力采用增强心肌细胞样的属性通过应用特定的文化条件。为建立一个可持续发展的选择这条路线,自体的细胞来源心脏治疗持有的潜在临床比转基因操纵细胞更容易接受。

1。介绍

缺血性心脏病是世界范围内最常见的死因1)和心脏肌肉组织的特点是变性的细胞死亡所产生的氧气和营养供应的短缺。通常情况下,这将最终导致心脏衰竭和心脏衰竭,造成巨大的社会经济负担,在发达国家最突出的,但越来越多的世界各地。人体左心室包含大约2到4×10⁹心肌细胞(CMs),其中高达25%可以迷失在一个非致死性心肌梗死(MI)[事件2]。自从成年哺乳动物心肌再生(只有非常有限的潜力3),对心脏细胞疗法的研究旨在开发方法来修复受损的心脏组织细胞移植治疗有效的(4,5]。

不同类型的细胞在心脏细胞疗法测试效果在动物模型和早期临床设置。自细胞最明显的选择,功能CMs,没有相关数据由于其有限的增殖潜力在体外,替代细胞群,主要是干细胞或祖细胞,进行了调查。早期的研究集中在骨骨髓来源的细胞,由于其相对容易获得从骨髓造血作用吸入物,建立了再生潜力和血管生成6]。这些细胞的一般安全温和的治疗效果治疗急性心肌梗死的临床试验的荟萃分析所示(7]。最近,有前景的结果从临床研究使用心脏干细胞来自患者心肌组织已发表(8),但潜在的生物机制仍未解决的(9]。

另一种自体的细胞来源的上下文中使用心脏细胞疗法是骨骼肌祖细胞,招募了卫星细胞在应对肌肉拉伤原位和增殖骨胳肌母细胞(MBs)在体外(10]。在这里,尽管最初有前景的结果在动物模型(11,12和临床试验13,14),安全问题变得明显在心律失常被观察到在心肌梗死后患者接受MBs (13,15),最有可能由于移植细胞的电生理隔离16,17]。因此,当考虑MBs心脏细胞疗法作为一个选项,修改前的细胞为宜,如最近我们组使用nontransgenic方法(18)或移植转基因MBs表达心肌缝隙连接蛋白(19]。

各种各样的出版物报道,骨骼肌的多功能干细胞,此外港口群已被称为肌源性干细胞(MDSCs)和有争议的讨论20.- - - - - -23]。利用的潜力MDSCs作为心脏细胞疗法的自体来源的细胞,进一步说明细胞的身份,分化潜能,功能属性,和治疗效果是必需的。隔离期间MDSCs从肌肉组织持续报道的特征,通常用于分离MBs和成纤维细胞18),是细胞培养的倾向的不依从塑料表面和细胞集群的形成。

我们的目的是利用这个特性通过支持不依从和集群形成早期特级MDSCs通过特定培养条件的应用。通过观察细胞形态、表达和功能的电生理研究中,我们可以确认改进的心原性的潜在的MDSCs应对动态的文化相比,标准的支持在体外。

2。材料和方法

2.1。组织处理和细胞隔离

骨骼肌细胞被隔绝的前肢和后肢骨骼的新生儿C57BL / 6小鼠如前所述[18,24]。短暂,肌肉组织被剁碎,摆脱结缔组织残留酶消化在磷酸缓冲盐(PBS;表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),包含0.2%胶原酶IV型和2.4 IU /毫升dispase(表达载体)和3毫米氯化钙(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)。原代细胞分离过滤使用70μm细胞过滤器(BD生物科学、海德堡、德国)和培养与5%胎牛血清的DMEM / F12培养基,它的x 1%, 1%,青霉素和链霉素0.5点μg / mL二性霉素b(所有的表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),10 ng / mL重组人类基本的纤维母细胞生长因子,和10 ng / mL重组人表皮生长因子(PeproTech,德国汉堡)。这些细胞受到串行preplating步骤2 h (pP1), 26个h (pP2),和74 h(项目)在10厘米隔离后细胞培养菜(猎鹰、BD、海德堡、德国)。每一步preplating后只有不依从细胞通道,而贴壁细胞被丢弃。很少出现后,不依从细胞被定义为第0天细胞(ISH0)和培养(10⁵细胞/厘米²)使用三种不同的细胞培养条件:我(孵化器),指的是培养的细胞应用静态条件标准的细胞培养孵化器在37°C和5%的公司₂;年代(瓶),指孵化在50 rpm水平摇摆平台上;H(悬滴),指的是初始在悬滴培养48 h (6×10⁴细胞/ 20μL下降)在37°C和5%的公司₂,其次是年代文化条件。

天4、8和12,不依从细胞收集,统计和通道。不依从细胞被称为根据收集的数量一天和应用条件,也就是说,H12:悬滴条件在12天。集群直径测量从微观图像(2.5 x放大,Axiovert 25、蔡司、从德国)。至少3图像样本(ISH0, I12 S12, H12)的隔离(分析了使用AxioVision4.5软件(蔡司)。在使细胞数量从样本获得的评估。样本与Accutase孵化(表达载体)15分钟37°C分离集群。细胞被使用纽鲍尔血细胞计数器(Marienfeld, Lauda-Konigshofen,德国)。MBs (18)和胚胎干细胞(ESC)派生的CMs (25)被用作控制免疫细胞化学和定量实时PCR (qPCR)。

2.2。免疫细胞化学

采用免疫染色,完整的或Accutase分离集群是离心机(500 g, 10分钟)到纤连蛋白涂层(2.5μg / mL;Sigma-Aldrich Taufkirchen、德国)盖玻片,进一步培养分析前72 h。样本有4%多聚甲醛固定,permeabilized Triton X-100/0.5 M NH为0.25%₄Cl,阻止了PBS山羊血清(所有Sigma-Aldrich) 5%(表达载体)。样本沾4,6-diamidino-2-phenylindole (DAP;英杰公司)。初级和二级抗体(见表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/247091)在PBS稀释1%牛血清白蛋白(BSA,英杰公司)。荧光显微镜进行使用Ti-U显微镜和NIS BR元素3.10软件(尼康,杜塞尔多夫,德国)。比率的细胞标记阳性表达评估通过分析5个视野(20 x放大)3生物复制(即。,总共> 500个细胞分析每笔和示例)。特异性染色测试的适当控制(S7 S3数据)。

2.3。流式细胞术

流仪分析细胞内的标记,单个细胞从Accutase分离固定和permeabilized集群Cytofix / Cytoperm解决方案(BD)。钢(PBS 0.5% BSA和乙二胺四乙酸2毫米,EDTA, Sigma-Aldrich)被用于稀释的抗体,洗涤和孵化。表S1列出详细信息使用的抗体。进行测量FACSCalibur流式细胞分析仪与CellQuest Pro 6软件(BD)。

2.4。定量实时聚合酶链反应

在最后一个静态孵化72 h,至少5×10⁵细胞从所有条件用于总RNA提取使用Nucleospin RNA XS工具包(Macherey内格尔,Duren,德国),其次是反转录,使用高容量互补脱氧核糖核酸逆转录工具包和DNase我治疗(两种表达载体)。SYBR绿色能源混合10毫米寡核苷酸引物(两种表达载体),和10 ng cDNA /反应被用于基因表达的量化StepOne +实时PCR系统(应用生物系统公司,ABI,达姆施塔特,德国)。数据分析使用StepOne 2.2软件(ABI)。引物序列见表S2。

2.5。膜片箝分析

电生理学性质MDSCs评估使用全细胞patch-clamping [26]。细胞分裂的集群镀在纤连蛋白涂盖玻片作为免疫细胞化学的描述。吸量管(3 - 5 MΩ阻力时充满了标准细胞内液,表S3A)是由薄壁硼硅玻璃毛细血管管(世界精密仪器WPI) Zeitz DMZ普遍拉(DMZ)。所有录音都执行一个或两天后细胞板,使用一个EPC 9放大器和脉冲软件(HEKA乐器,Lambrecht德国),应用连续灌注缓冲区(细胞外的解决方案,表S3B)浴温度保持恒定在37°C。建立gigaohmic密封后,膜电容和串联电阻补偿电容瞬态降到最低。细胞表现出稳定的价值观包括在分析中。APs current-clamp模式和有趣的当前记录()电压钳模式。为记录,超极化步骤从潜在的−−40 mV的范围150−100 mV mV-steps被应用。数据数字化10 kHz,过滤1 kHz和存储在硬盘上。跳动频率测量APs的数量每分钟超过5分钟的时间。表示测量0.5毫米CdCl₂或1μ异丙肾上腺素(Sigma-Aldrich)添加到缓冲区。

2.6。统计分析

使用执行统计分析SigmaStat4软件(Systat软件GmbH, Erkrath,德国)。比较组使用单向方差分析(方差分析)之后事后Bonferroni或通过学生的测试多组比较以及针对单一组比较(被认为是重要的)。数据显示为平均值±标准平均误差(SEM)除非另有说明。

3所示。结果

3.1。骨骼肌准备和初始细胞特征

骨骼肌的机械和酶分离孤立从新生儿老鼠导致27.5±1.4×10⁶每克组织()。三个连环preplating步骤(pP1-pP3)细胞数量减少,也就是说,重要的不依从细胞的数量,20.3±1.9×10⁶pP1后,9.4±1.2×10⁶pP2后,7.9±1.0×10⁶后项目(图1)。由此产生的不依从人口,cluster-forming细胞很少被称为ISH0后,因为它作为初始种群(天0)的细胞,然后分裂和被三个不同的细胞培养条件:静态孵化(我)、动态孵化水平瓶(年代在悬滴),preculture (H瓶)和随后的文化。ISH0集群形成的细胞自发跳动的细胞。流仪分析()显示一个异构与大多数细胞的细胞群表达pan-muscle标记肌间线蛋白(82.5%±4.4%)和大量的细胞表达心肌肌钙蛋白T的分数(cTnT, 35.6%±7.4%),干细胞谱系标记本来(32.0%±3.7%),和骨骼肌祖细胞特定转录因子Pax7 (19.9%±10.4%)。此外,较小的细胞的分数也为造血干细胞标记CD34阳性(9.0%±0.8%)和心脏转录因子Nkx2.5 (1.9%±0.1%)。

3.2。影响的动态支持集群文化形态和细胞数量

大小的细胞集群(数字2(一个)和2 (b))经过12天的静态培养条件从最初的ISH0细胞集群之间没有显著性差异(ISH0: 66.4±2.0μ米,;I12: 68.2±5.2μ米,),但集群明显较大的两个动态条件下(S12: 121.2±3.9μm;H12: 114.7±5.2μm;这两个与ISH0和I12)。悬挂不依从细胞的数量计算的发展在过去的12天中我没有显著差异,S和H和显示每天损失大约6%的不依从细胞,导致28.4%(我:3.13±2.36×10⁶细胞),19.4% (2.14±1.34×10⁶细胞)和17.3% (H: 1.9±1.53×10⁶细胞)的原始ISH0细胞(图12天之后2 (c))。尽管细胞数量不断下降(图12天的静态或动态文化2 (c))的增加比率的不依从细胞观察(图2 (d))。

3.3。动态支持文化心脏标志物表达的影响

从ISH0集群,经过12天的培养在不同条件下分析了采用心脏的表达和肌原性的标记。染色完整的集群并没有透露标记表达式是局部集群的特定区域(图S1和S2)。因此,采用免疫分析从分离单个细胞集群。特异性的抗体染色证实了适当控制(图S3)。量化的比率骨骼肌肉和心脏肌肉的细胞表达标记肌间线蛋白cTnT, Pax7, Nkx2.5 ISH0确认收购流仪分析结果(数据3和S4)。进一步分析了肌原性的监管因素3和4 (Myf3和Myf4),心脏具体α辅肌动蛋白2 (ACTN2),心脏特定转录因子GATA4和显示率> 35% Myf3 Myf4阳性细胞和肌间线蛋白阳性细胞> 80% ISH0和文化这三个条件在12天(数字3和S4-S7)。细胞的比率表达Pax7显著下降,直到一天12对所有文化条件除了S12,虽然比率表示心脏的细胞标记ACTN2 cTnT, Nkx2.5 ISH0所有条件后显著增加。ISH0相比,在I12 GATA4是相似的表达和S12但在H12显著增加(数据3和S4-S7)。

联接蛋白43的表达(Cx43),α肌凝蛋白重链6 (MYH6)、cTnT ACTN2,分析了Nkx2.5 qPCR在转录水平上。纯化ESC派生CMs和MBs被用作控制。CMs和MBs相比,ISH0 MYH6显示一个中间表达水平,cTnT,和Nkx2.5, ISH0 Cx43表达水平的类似于MBs(数字4和S8)。比较细胞从每天4和12 ISH0细胞的三个不同的文化条件,MYH6的表达式和cTnT已经增长超过5倍在第四天细胞(预告S4和ISH0:;H4与ISH0:),进一步增加I12(13.6倍;对ISH0)和H12细胞(55.2倍;对ISH0)。cTnT的表达水平高出三倍以上的细胞相比,在所有细胞培养条件的第四天ISH0(预告和H4与ISH0:;S4与ISH0:)。最高水平的cTnT表达式中检测出H12细胞(17.5倍;对ISH0)。在所有三个12天的培养文化条件,Cx43 ACTN2显示,只有轻微的表达水平的变化,从0.5 - 2倍(数字4和S8)。Nkx2.5显示表达增加的趋势,特别是对于条件H (H4: 27 x, H12: 182 x),但是没有达到意义,大概,因为整体表达水平很低(1000倍小于内源控制)。

3.4。功能特征的MDSCs培养下动态的支持在体外

细胞集群的观察,MDSCs培养下的动态支持心脏特定蛋白质表达和记录,促使我们进一步探索其功能属性。为此进行自发电生理膜片钳测量跳动单个细胞获得ISH0集群和天12样本应用不同的条件。细胞的自发收缩ISH0发生不规则,经常停止后密封。的51 patch-clamped细胞,3细胞(5.9%)可以成功地进行了分析,这些都表现出不规则的跳动,burst-like活动的特点是短片段。12天的培养后,细胞自发收缩更稳定和定期在每种文化条件:I12组77分析,8例(10.4%)细胞活动规则和7(9.1%)不规则的跳动和S12组,37个细胞修补和8例(21.6%)显示规则和4(10.8%)不规则的跳动,而在H12集团89测量细胞,9例(10.1%)表现出规则和5(5.6%)细胞不规则的活动。代表的痕迹不定期和经常殴打MDSCs显示在图S9。

自发动作电位的频率(APs)类似于ISH0(360.6±81.6次/分钟)和H12细胞(444.4±39.3次/分钟),而细胞I12和S12显示超过2 x更高频率(表1)。美联社分析参数显示I12细胞表现出更多的去极化的潜在最大舒张压(MDP),美联社(adp),持续时间短,降低最大美联社的一击速度()比ISH0 S12, H12细胞(图5 (b))。然而,APs的形态从细胞培养在不同条件下相似,表现为慢去极化之前每个AP,快速的一击,美联社和短时间,没有高原期后,美联社的一击(图5(一个))。此外,APs(图5 (b),左面板),电流(图5 (b),右面板)记录相同的细胞从current-clamping转向voltage-clamping如前所述[27]。我们检查的功能表达在I12自发ISH10下跳动的细胞生成,S12, H12。典型的代表当前的痕迹(图5 (b)nonbeating,右)记录(上),打(较低的)ISH10细胞进行描述。几个跳动的细胞显示的存在当前而大多数nonbeating细胞的缺失的特征目前,确认的重要作用生成和调制的自发活动的细胞。

我们进一步确定ISH0、I12 S12, H12细胞反应心脏通道特定的化学或药物刺激(代表痕迹显示在图S9)。0.5毫米CdCl中的应用₂有选择地块心脏美联社的一代,但对骨胳肌管没有影响(21),废除了自发的跳动的细胞组(ISH0:I12:S12:H12:)。暴露的细胞β1-adrenergic受体激动剂异丙肾上腺素(1μ米)美联社频率增加细胞培养条件(ISH0:I12:S12:H12:)。都被冲刷影响是可逆的。

4所示。讨论

在这项研究中,我们试图探讨骨骼肌细胞分离是否可以更改nontransgenic方式收购CM-like属性,最终允许功能集成到受损的心肌,改善心脏功能。为了实现骨胳肌源性细胞的过渡CM-like细胞已有多种方法被执行。因为骨骼肌细胞一般有一个收缩和电激表型,变化所需采用的心脏表型可能那么极端,例如,转基因转换成纤维细胞的CMs (28]。新生儿骨骼肌细胞的隔离与CM-like特性或心原性的潜在(之前被描述21关于特定文化的影响),但信息条件是罕见的。新生儿的选择骨骼肌组织的潜在心脏发生的细胞群已被证明是工具,因为成人骨骼肌组织收益率只边际量的细胞在细胞培养中可行的。

最初的不依从的细胞群(ISH0)获得后骨骼肌离解preplating表型异构,通过流量仪结果如图所示。绝大多数的细胞表达了pan-muscle标记肌间线蛋白和干细胞标记本来是积极的为30%,表明MDSCs [20.]。心脏结构蛋白cTnT表达在相似的水平,表明已经在最初的细胞群ISH0心原性的潜力。

支持集群的细胞的方法,像悬滴法(29日和悬挂质量文化30.描述了),增加心脏血统多能干细胞分化和代cardiospheres [31日]。我们试图探索这些文化方法是否可以增加MDSCs的心原性的潜力,如果可以接受细胞数据后续分析和应用程序可以生成。正如所料,12天的细胞培养后,获得集群应用动态条件(S和H)明显大于那些被发现在传统的静态条件下(我),而细胞集群的总数还是类似的在所有的三个条件。然而,连续观察细胞和只有22%的初始ISH0细胞群仍经过12天。MDSCs增长滞后是前面描述的,因此不是一个惊喜32]。显然,然而,动态文化并不促进细胞增殖在标准孵化器文化。因此,根据细胞的必要扩张实现临床相关的细胞数量,需要进一步优化培养条件,例如,通过补充适当的生长因子,小分子或细胞外基质成分计数细胞的观察到的损失或改善扩散(33]。

分析心脏特异性标记证实,细胞与CM-like表达式模式已经出现在初始ISH0细胞群,表明这些细胞可以浓缩后12天的扩张,应用集群促进条件,显著增加比率反映的细胞表达心脏标记ACTN2 cTnT, Nkx2.5。值得注意的是,骨骼肌标记的表达水平Myf3和Myf4保持不变条件下应用。这一发现与最近的一份报告是一致的,表明这些标记物的表达是独立于集群大小和他们的持续表达并不影响细胞心原性的潜力在活的有机体内(34),期间与骨骼肌的一般存在标记MDSC隔离(32]。重要的是要注意,Pax7的表达被定义为骨骼肌的祖细胞,也理解为一个标记的骨胳肌原性的潜力,但主要是反映了人口具备干细胞和增殖潜力(35),这显然是目前在某种程度上在动态的支持和赞同克隆研究集群大小的相关性(36]。

qPCR分析显示心脏标志物表达显著降低ISH0细胞相比,ESC派生的CMs,被理解为一个典型的高心原性的潜在的干细胞群在此设置中,但表达显著高于在MBs,被用作基线控制心原性的骨骼肌细胞的潜力。比较初始ISH0细胞之间的表达水平和经过12天的细胞培养显示心脏结构蛋白的表达Myh6 cTnT显著增加在所有三个条件。有趣的是,细胞从动态培养条件(S和H)表达水平最高,虽然没有达到ESC派生CMs的表达水平。这表明全面过渡MDSCs CM-like表型在体外需要进一步优化。晚期心脏结构的表达这一事实(Myh6和cTnT)和功能标记(Cx43)与水平在ESC派生CMs在我们的眼睛比基本的表达相关sarcomeric结构标记ACTN2或心脏的早期标志物测定(Nkx2.5),使点的主要成熟细胞向心脏表型,这是动态文化条件下最为显著。增加心脏标记表达式的动态文化符合以前的报告中克隆细胞含量较高集群呈正相关,增加心脏标记表达和心脏分化潜能(34]。

时,考虑到不同组织来源,意料之中的是并不是每一个心脏标记显示了相同的相对表达水平MDSCs培养下动态的支持比专用高心原性的潜在人口ESC派生的CMs,我们的分析表明,动态支持MDSCs逐步缩小文化之间的决定性的差距对cardiac-like开发这些细胞群。

自MDSCs显示自发击败活动是与心脏有关具体当前的(37],表示CM-specific标记,特别是细胞获得的动态文化,我们分析了这些细胞的电生理特性的全细胞膜片箝测量。从细胞动作电位可以记录所有的条件,记录他们的电生理能力。跳动频率测量(440到820次/分钟,一天12)更高的小鼠ESC相比,诱导多功能干细胞衍生的CMs,介于70和160次/分钟26),因此更类似于生理成年老鼠心脏跳动频率,据报道范围450到800次/分钟(38]。在休息12天的文化潜力和自发的跳动频率的细胞培养应用所有条件增加,而他们的美联社持续时间减少,这是符合观察小鼠多能干细胞分化的CMs (26]。APs的形态分析测量细胞内的每个条件,然而,不同于成熟的成年小鼠心室厘米APs (39)和小鼠ESC派生atrial-like CMs, APs ventricular-like厘米(26]。起搏器的整体美联社形态让人联想到细胞,具有较低的MDP和振幅和频率高于心房和心室APs (40,41]。

之前已被证明MDSCs应对外部的化学刺激的方式类似于CMs,跳动频率增加的特征是一个可逆反应异丙肾上腺素和可逆的跳动频率响应CdCl下降₂,而骨骼肌细胞和肌管没有影响(21]。在我们的手中,这些测量是技术上具有挑战性,但是从所有的细胞数量,包括ISH0,当成功来衡量,显示出可逆CM-like对这些物质的反应,表明CM-like表型和功能,证实上述研究结果。

所有结果认为细胞H12人口显示最有前途的结合特性转换从骨骼对心脏表型在体外。心原性的潜在的增加之间的关系和动态支持这些细胞暴露在是我们提出的核心发现研究。

5。结论

我们表明,执行和持续的不依从,通过动态集群的形成文化,此外挂掉预处理MDSCs显著提高他们转向CM-like表型。在未来,将是令人兴奋的裁缝的动态支持文化协议向浓缩心室CM-like表型和评估移植和潜在的治疗效果在活的有机体内疾病模型。

缩写

ACTN2:	α辅肌动蛋白2
记者:	动作电位
美国:	动作电位持续时间
CM:	心肌细胞
cTnT:	心肌肌钙蛋白T
Cx43:	联接蛋白43
ESC:	胚胎干细胞
GATA4:	叫结合蛋白4
ISH0:	分数的不依从细胞preplating之后
我/ S / H:	标识符细胞培养条件(孵化器、瓶、和悬滴)
m:	骨骼肌成肌细胞
MDP:	最大舒张潜在
MDSC:	肌源性干细胞
小姐:	心肌梗死
Myf3/4:	肌原性的调节因子3/4
Nkx2.5:	NK2蛋白质同源框5
Pax7:	成对盒基因7
本来就:	干细胞抗原1
:	最大美联社的一击速度。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

克劳斯Neef和菲利普Treskes同样起到了推波助澜的作用。

承认

作者感谢Annalena亨利克先生和Meike Lauer优秀的技术援助。

补充材料

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