修改人的皮下ADMSC PPAR之后γ激活和冷博览会

文摘

间充质干细胞是不同类型的细胞广泛的潜在的治疗应用。特别是,从脂肪组织细胞有方便的区别和含有大量的干细胞。ADMSCs可以诱导成熟脂肪细胞,激活能量消耗总PPAR在治疗γ受体激动剂。另外这些细胞可能通过激活产应对寒冷。在目前的研究中,我们确定的影响部分PPAR激动γ和温度降低的表型和代谢活动ADMSCs从人类脂肪皮下组织。我们发现,脂肪细胞分化PPAR的全部和部分受体激动剂γ和暴露于31°C能够应对寒冷显著增加产热的蛋白质的表达,比如UCP1 PGC1αCITED1,米色表型的标志。此外,我们发现,脂肪细胞的细胞受到寒冷降低甘油三酯和增加脂联素的水平。这些数据证实的承诺作用ADMSCs用于治疗代谢紊乱,因为它可以诱导他们成熟的脂肪细胞和调节细胞表型向高能量消耗和代谢有益的影响。

1。介绍

干细胞来源于成人组织获得了一个重要的角色在再生医学和一个模型来确定慢性nontransmissible疾病的起源(1]。间充质细胞来源于脂肪组织有一个特殊的内涵,因为他们很容易获得和有一个伟大的功能变换(2,3]。由于这种能力autorenewal和分化的细胞类型,如成骨细胞,细胞,软骨细胞,脂肪细胞,ADMSCs(脂肪间充质干细胞)被引入组织再生的治疗(4,5]。ADMSCs可能治疗的应用是一个表型调制治疗肥胖,与多个代谢和心血管疾病被认为是大流行的影响(6]。自治疗治疗肥胖是稀缺的资源,使用ADMSCs肥胖的治疗已成为一个似是而非的替代模型(7- - - - - -9]。ADMSCs收购决定表型的能力取决于特定的转录因子。激活PPARγ核受体,可以激活特定的配体,可以区分ADMSCs向脂肪细胞。我们曾观察到日全食和月全食PPARγ激动与罗格列酮和部分激动与替米沙坦可以区分单能性的老鼠细胞3 t3-l1向脂肪细胞(10]。然而,对部分PPAR的激活γ在脂肪细胞分化ADMSCs [11]。最近被观察到,它可以获得更积极的从成人发生热量的脂肪细胞,事实上只有在新生儿和低等哺乳动物,有棕色脂肪细胞(12]。在这个比赛中成年人脂肪细胞可能是白色,棕色,米色。棕色脂肪细胞的起源与肌肉细胞更接近,而米色脂肪细胞可能部分来自于白色脂肪细胞或间充质来源有自己的(12- - - - - -14]。事实上,PPAR的连续刺激γ受体的激活的米色表型ADMSCs获得人体组织。即使在老鼠,总PPAR激动剂γ有必要引起米色表型(15,16]。此外,脂肪细胞可以更积极的生产热量后温度下降。暴露在冷激活交感神经系统对去甲肾上腺素的解放,行为β肾上腺素能受体,并触发一个信号通路激活基因转录的生热作用和能量消耗17,18]。然而,慢性冷博览会可能诱发生热作用和布朗宁窟脂肪,通过交替途径可能包括激活巨噬细胞,激活腺苷受体负责19,20.]。从代谢角度、冷产生减重和提高甘油三酯的代谢增加棕色脂肪细胞组织中脂质吸收和调节一些adipocytokines脂联素的表达21]。

我们使用ADMSCs从皮下人体组织调查药理刺激是否全部和部分的PPAR激动剂γ可以激活米色脂肪细胞的特征以及应对冷激活产热的项目。此外,我们研究了代谢影响甘油三酯的水平和脂联素在上述情况下的激活。

2。材料和方法

皮下脂肪样本取自5女性患者,平均年龄(20至40年,他接受了腹壁整形术。病人呈现之间的BMI(身体质量指数)23和25公斤/米²。此外,捐赠者没有在任何药物治疗3个月之前的样本,因此不提供任何形式的疾病。

血脂、碳水化合物代谢和甲状腺功能在正常水平。患者接受详细的信息关于研究的目的和签署了知情同意。大学的伦理委员会批准的项目是de La Sabana。

2.1。细胞培养

ADMSCs 30 g的腹部皮下脂肪组织中分离的过程中收集手术。脂肪样本洗用PBS和所有的纤维材料和可见的血管被移除。样本后胶原酶消化与250 U /毫升I型,20毫克/毫升BSA, 60μg / mL庆大霉素在PBS 90分钟37°C风潮。消化后的样品在200 g离心10分钟和颗粒悬浮在红细胞溶解的溶液组成的154毫米氯化铵(NH)₄Cl), 5.7毫米单碱的磷酸钾(K₂HPO₄),0.1毫米EDTA pH值7.3 10分钟。这个混合物是根据150尼龙网过滤μ在200 g m孔隙,紧随其后的是离心10分钟。然后细胞颗粒悬浮在生长介质组成的DMEM / F12 + 10%胎牛血清和庆大霉素50μg / mL的密度10000细胞/厘米²。24小时后的细胞被洗和诱导扩散介质PM4(2.5%胎牛血清的DMEM / F12,基本成纤维细胞生长因子1 ng / mL, 10 ng / mL表皮生长因子,和胰岛素8.7μ米)高达100%的融合和分化为成熟脂肪细胞。细胞识别与CD34标记流式细胞术。

2.2。分化和甘油三酸酯的量化

人类间充质干细胞分化成脂肪细胞胰岛素使用66 nM的混合物,1 nM triiodo-L-thyronine, 10μg / mL转铁蛋白、0.5毫米isobutylmethylxanthine地塞米松100海里,1μM罗格列酮或50μM PPAR的替米沙坦γ受体激动剂在DMEM / F12为72小时。随后,媒介是改变基底preadipocytes介质含有相同浓度的胰岛素,triiodo-L-thyronine,和转铁蛋白10天,改变中每3天。脂肪细胞的分化与油红O染色观察到,先前10%甲醛固定成熟细胞在PBS 15米37°C;然后奥罗在异丙醇溶液在室温下2小时。它随后删除并用水洗去除残余染料。量化甘油三酸酯,1毫升的异丙醇增加了5分钟,鄙视脂肪堆积。吸光度测量在510 nm波长和甘油三酸酯的相对价值确定。

2.3。冷诱导

ADMSCs在6-well培养箱、诱导脂肪形成的分化,维持10天在基底分化培养基37°C。18小时前冷诱导,成熟脂肪细胞被洗与PBS和基底分化中被改变。随后,细胞受到31°C在4小时孵化器有限公司为5%₂。这一次后,脂肪细胞被沾染了奥罗量化的总蛋白提取甘油三酸酯和其他溶解产物。各自的控制细胞的分化在类似条件下维持在37°C。

2.4。免疫印迹分析

总蛋白从皮下脂肪分化脂肪细胞获得通过使用缓冲区里帕(Abcam,剑桥,妈,ab156034)和1μg蛋白酶抑制剂(罗氏诊断,曼海姆,德国)。他们然后使用布拉德福德量化方法与50浓度μ克蛋白质。随后变性在95°C,进行主题提取在聚丙烯酰胺凝胶电泳。随后的产物电泳被转移到PVDF膜用100%甲醇预处理2分钟。

阻塞的膜进行PBS-T (1 x PBS和渐变20 0.1%)和脱脂奶为5%。然后是与相应的抗体来检测蛋白质产热的孵化:兔子anti-PGC-1α(过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α),1:1000稀释(Abcam,剑桥,妈,ab54481),兔子anti-UCP-1(解偶联蛋白1),稀释1:1000 (Abcam,剑桥,妈,ab155117),和鼠标anti-CITED1 (Cbp / p300-interacting反式激活因子与Glu / Asp-rich carboxy-terminal域)(Abcam,剑桥,妈,ab87978)。二次抗体兔子IgG-HRP UCP1, PGC-1α和稀释1:2000和1:分别为3000 (Abcam,剑桥,妈,ab6721)。此外,老鼠IgG-HRP (Abcam,剑桥,妈,ab6728)是用于CITED1的稀释1:2000。此外,的表达adipocytokines FABP4(脂肪酸结合蛋白4)检测使用一只兔子抗体anti-FABP4 (Abcam,剑桥,妈,ab92501)的稀释1:2000和脂联素(Abcam,剑桥,妈,ab75989)的稀释1:3000年,当二次抗体兔子IgG-HRP使用在1:5000。检测是由化学发光的指令Luminata高潮工具包(EMD微孔,达姆施塔特,德国)。图像捕获和分析使用myECL成像仪(热电电子,沃尔瑟姆,MA)。定量分析是由微使用我的图像分析程序在三个独立的实验。的测试结果进行方差分析(方差分析)和差异被认为是统计学意义时的值均与标准误差。

2.5。治疗与IL4脂肪细胞

为了了解IL4在生热作用的影响,ADMSCs获得3女患者生长在6-well框和分化如上所述。成熟脂肪细胞被洗PBS和对待IL4 10 ng / mL (PeproTech落基山,新泽西)0.1% BSA。细胞被立即受到31°C或37°C为4个小时。各自的控制细胞BSA治疗。总蛋白进行免疫印迹分析,得到相应的抗体孵育脂联素和PGC-1α。实验进行了一式三份。定量分析了如上所述。

3所示。结果与讨论

干细胞来源于脂肪组织(ADMSCs)是一个有用的工具研究不同类型的疾病。我们获得ADMSCs皮下脂肪组织的健康女性作为模型来评估不同PPAR脂肪细胞分化的影响γ受体激动剂并观察温度对产热的的发展的影响和代谢标记。建立差异化的条件和文化后,我们发现获得ADMSCs使用CD34标记流式细胞术(22,23]。

PPAR的影响γ受体激动剂最初研究,无论是部分或全部,ADMSCs诱导分化为脂肪细胞。经过10天的分化是观察到的细胞能够存储甘油三酯使用这两种受体激动剂(图1)。这种观察使得这个核受体的重要作用过程中脂肪细胞的分化明显。在目前的研究和部分PPARγ受体激动剂诱导甘油三酯积累和ADMSCs成熟脂肪细胞的分化。我们已经考虑了评价部分的PPAR激动剂γ因为它已经表明,过量脂肪积累和保留液体总PPAR的一些不良影响γ受体激动剂。正是因为这一原因,选择性受体激动剂可能有更好的治疗效果24,25]。当细胞受到温度下降,在这两种情况下减少甘油三酯观察(数据的积累1(一)和1 (b))。先前的研究在动物模型表明,冷对脂肪细胞可能有分解脂肪的作用,增加脂肪酸的转运蛋白和脂肪酶等特定酶脂蛋白(26]。最近观察到温度的降低可以稳步增加更高的热产生基因的表达(17]。本研究的一个重要事件观察标记的能量消耗的增加引发的两种类型的受体激动剂。尽管它曾观察到,罗格列酮可能会增加PGC-1α和UCP1水平(27),这是第一个PPAR的影响的证据γ部分调制器在这些标记(图的激活2)。这是另外观察到温度下降可能会增加能量消耗的生产的标记,更明显的罗格列酮相比,替米沙坦。

温度的降低已被证明产生生理影响激活脂肪细胞的产热的标记。在一些动物研究发现冷可以增加产热标记,可能还有脂肪细胞功能改变(28]。在人类脂肪细胞细胞接受了这项工作,减少温度从37°C到31°C,保持在4小时。31°C,在此期间,细胞的表达产热增加标记UCP1和PGC-1α(图2)。刺激交感神经系统的活动β肾上腺素能受体可能是重要的产热激活,以应对寒冷。我们的数据表明,部分和PPAR总额γ受体激动剂可能修改的表达蛋白参与能量消耗和惊人的细胞可以应对寒冷增加生热作用(17]。因此有可能,除了交感神经系统中介,一些额外的因素引起的表型可能是重要的冷。它最近表明,激活腺苷受体或IL4生产是可能的因素调节功能变化在低温下。然而,冷的机制可以改变脂肪细胞的活动仍然是阐明(20.]。

相比,温度对能量消耗的影响,在寒冷的后果adipocytokines表达一直缺乏研究。在目前的研究中,我们观察到的增加脂联素表达在细胞分化的PPARγ受体激动剂(图3(一个))。这个观察与甘油三酯的数量的减少以及增加脂肪细胞的产热的标记指引我们相信窟细胞ADMSCs褐变过程对米色脂肪细胞。重要的是要强调第一次,减少温度有一个有益的变化由脂肪细胞脂联素生产来源于ADMSCs,基线和治疗PPAR之后γ受体激动剂(图3(一个)和3 (b))。

最近一群新的监管细胞,调节冷反应是观察小鼠或者激活的巨噬细胞(2型/ M2)。嗜酸性粒细胞通过IL4激活和使用IL13信号时,M2巨噬细胞被雇来皮下窟和分泌儿茶酚胺激活窟布朗宁(20.,29日,30.]。我们对待分化脂肪细胞从ADMSCs IL4期间4小时37°C和31°C。IL4增加脂联素的表达和PGC-1α和温度降低了协同效应与IL4(数字4(一)和4 (b))。这导致我们做出的假设IL4布朗宁的过程是一个重要的因素从ADMSCs scWAT。

4所示。结论

在目前的研究中我们证明部分PPAR核受体的激活γ脂肪细胞可能决定改变ADMSCs血统。此外,观察到温度的降低和IL4可能有一个保护从肥胖代谢的影响。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢阿德里亚娜Parra和埃斯特万Jacome样本集合和Jeison加西亚,吉娜·罗德里格斯和实验室的其他成员提供有帮助的建议。这项工作是由Colciencias批准号123065740713从2014年开始,由医学院和DIN从大学de La Sabana(研究部门)。

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