人类脂肪Tissue-Derived干细胞的神经分化涉及激活Wnt5a /物的信号

文摘

干细胞是一种强大的资源,为细胞移植疗法,但在分子水平上对干细胞分化的理解还不清楚。我们假设Wnt通路控制干细胞的维护和神经分化。我们有特点的转录表达Wnt在hADSCs的神经分化。神经诱导后,Wnt2的表情,Wnt4,和Wnt11减少,但Wnt5a的表达增加与主要hADSCs rt - pcr分析。此外,大多数Fzds和LRP5/6配体的表达水平下降,但不是Fzd3 Fzd5。此外,在NI-hADSCs Dvl1和RYK表达水平下调。没有表情的变化ß-catenin GSK3ß。有趣的是,Wnt5a表达高度的NI-hADSCs增加了实时rt - pcr和免疫印迹分析。神经分化和Wnt3 Wnt5a水平调节后,Dvl2, Naked1水平表达下调。最后,我们发现物后增加神经诱导和ERK表达水平降低。 Thus, this study shows for the first time how a single Wnt5a ligand can activate the neural differentiation pathway through the activation of Wnt5a/JNK pathway by binding Fzd3 and Fzd5 and directing Axin/GSK-3ß in hADSCs.

1。背景

间充质干细胞(msc)存在于骨髓、外周血、脂肪组织和有治疗潜在疾病,如多发性硬化症(1)、糖尿病(2)、中风(3,4),和神经退行性疾病5]。msc自我更新和分化成骨头、脂肪组织、软骨、肌肉、骨髓基质,肌腱和韧带在活的有机体内和在体外适当的培养条件下,(6,7]。理解区别很重要,因为以下几个原因。首先,分化是基于获得特定功能的过程,干细胞研究可能会专注于提高指导分化和控制他们的生存和增殖8,9]。其次,理解分化可能会提供一个合适的策略,干细胞在神经系统疾病的临床治疗。干细胞治疗的应用msc、如何从增殖,分化和持续维持自己的能力是非常重要的。最近,Wnt信号与MSC分化的控制(10,11),包括成骨的(12,13脂肪形成的),chondrogenic,肌原性的分化(14]。

实际上wnt糖蛋白家族,可以通过不同的细胞内信号通路,调节许多脊椎动物和哺乳动物发育事件(13,15]。多达19个哺乳动物Wnt同系物是已知的所有实际上Wnt和共享的特性包括一个信号序列的分泌,几个高度带电氨基酸残基,和许多糖基化网站(16]。Wnt蛋白质信号通过两个不同的途径与卷曲的绑定(Fzd)受体,这是seven-pass跨膜蛋白,发现第一个受体转导Wnt信号(17]。在胞质侧,Fzd可能直接与散乱的交互(Dvl)蛋白,一个已知的中介Wnt信号(16]。在规范的途径,Wnt / Fzd复杂信号通过激活Dvl抑制退化β连环蛋白的糖原合成酶激酶3β(GSK3β)。稳定的积累β连环蛋白在细胞质中增加,进入细胞核,导致目标基因表达的转录。不在经典里的途径,这是独立的β连环蛋白介导几个细胞过程,通过单体的gtpaseρ的家庭,增殖蛋白激酶像小君n端激酶(物)和细胞内钙含量的变化10,11,16- - - - - -20.]。

Wnt信号通路中起着重要的作用在中枢神经系统的发展和调节神经回路的形成和功能通过控制神经元分化(21]。几组报道,Wnt3a Wnt5a增加神经分化的人类或鼠标神经祖细胞(15)和Wnt3a促进了老鼠的神经分化的upregulation mscβ连环蛋白表达(11]。实际上wnt也刺激神经分化从胚胎、体细胞和神经干细胞22,23]。然而,Wnt通路在人类脂肪tissue-derived神经分化的干细胞(hADSCs)还没有研究。在目前的研究中,我们建立了神经induced-hADSCs (NI-hADSCs)在我们之前的研究9),发现Wnt信号及相关通路NI-hADSCs主hADSCs相比。

2。材料和方法

2.1。准备hADSCs hADSCs和神经感应的

在这项研究中,我们使用人类ADSCs,已经分离和特征在我们之前的研究9]。总之,脂肪组织的人类耳垂从十个健康的捐赠者获得4岁根据伦理委员会的指导方针Chonnam国立大学医学院(IRB:我- 2009 - 03 - 016)。孤立hADSCs保持在杜尔贝科修改鹰的介质(美国UT DMEM Hyclone,洛根)补充10%胎牛血清(penicillin-streptomycin的边后卫,Hyclone)和1% (Hyclone) 37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。本研究中使用的hADSCs来自段落2到5。诱导神经分化,hADSCs是生长在DMEM含有1%的边后卫和补充100 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF,英杰公司有限公司,卡尔斯巴德、钙、美国)七天,然后被孵化的10μM forskolin(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)在接下来的七天。之后,这些细胞受到rt - pcr分析,实时rt - pcr分析,免疫印迹的研究。

2.2。反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)

分析的相对表达不同的mrna,互补的数量是基于信号的归一化广泛表达GAPDH [9,24]。从培养细胞总RNA提取利用三试剂(分子研究中心Inc .,辛辛那提,哦,美国)和reverse-transcribed cDNA使用逆转录系统(豆类生物有限公司、志贺、日本)。PCR引物(Bioneer有限公司、大田、韩国)对人类选择区分cDNA和基因组DNA通过使用单个引物特定于不同的外显子,如果可能的话。在94°C放大进行了2分钟,其次是35周期为1分钟在94°C,在适当的退火温度对于每个引物1分钟,在72°C和1分钟(9]。正向和反向PCR寡核苷酸引物选择放大cDNA表中列出1和rt - pcr产品分离electrophoretically 2%琼脂糖凝胶(西格玛化工有限公司)。

2.3。实时rt - pcr

对实时rt - pcr分析,cDNA总RNA合成使用它之前准备使用试剂盒从初级hADSCs和NI-hADSCs协议。实时rt - pcr进行SYBR绿色预混料Taq交货(豆类生物Inc .)和热循环骰子实时系统(豆类生物Inc .)。每个样本分析四个复制反应20μl

2.4。西方墨点法

细胞培养和Wnt信号通路被免疫印迹分析观察。简而言之,这些细胞被洗两次磷酸盐(AMRESCO,梭伦,梭伦,哦,美国)和细胞溶解裂解缓冲包括蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。蛋白质浓度在细胞溶解产物是由Quant-iT分析工具包(分子探针,尤金,或者美国)。等量(15毫克)每个样本的蛋白质决定10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到硝化纤维素膜(Amersham淀粉微球的生物技术,白金汉郡,英国)。阻塞后1%脱脂牛奶PBS-T(西格玛化工有限公司),与特定的抗体膜被孵化Wnt3a(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,妈,美国1:1000),Wnt5a / b(细胞信号技术,1:4000),Dvl2(细胞信号技术,1:1000),Naked1(细胞信号技术,1:1000),轴蛋白1(细胞信号技术,1:2000),phosphor-JNK(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国,1:4000)、物(圣克鲁斯生物技术,1:4000),phosphor-ERK1/2(圣克鲁斯生物技术,1:1000),ERK1/2(圣克鲁斯生物技术,1:4000),phosphor-PKC(圣克鲁斯生物技术,1:4000),PKC(圣克鲁斯生物技术,1:1000),phosphor-GSK3β(细胞信号技术,1:3000),GSK3β(细胞信号技术,1:3000),β连环蛋白(细胞信号技术,1:4000),或GAPDH(圣克鲁斯生物技术,1:4000)。几个洗后,膜随后被孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体(细胞信号技术)。被检测到的信号增强化学发光试剂(圣克鲁斯生物技术)和密度是量化使用ImageJ软件(24]。

2.5。统计数据

蛋白质和mRNA水平量化通过测量每个波段的光密度使用计算机辅助微(NIH图像分析程序,1.61版本)。所有的值被表示为均值±SEM。单向方差分析测试(Bonferroni事后比较)被用来分析组,差异被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。在NI-hADSCs Wnt Signal-Related基因的分析

识别Wnt通路基因在分子水平上,我们进行rt - pcr分析Wnt通路组件包括4 Wnt家庭,Wnt coreceptors 5 Wnt受体,2。按照我们先前的研究[9hADSCs],已经从人类脂肪组织分离和特征msc、被分化成NI-hADSCs。Wnt2、Wnt4 Wnt11基因表达减少而只有Wnt5a基因的表达增加在NI-hADSCs(图1(一))。Wnt受体(Fzd2 Fzd4和Fzd6)和coreceptors (LRP5和LRP6)都在NI-hADSCs表达下调,除了Fzd3 Fzd5,并不用hADSCs表示(图1 (b))。此外,RYK的表情,这是一个Wnt可以绑定到Wnt配体的配体受体,和Dvl1 NI-hADSCs下降。然而,GSK3β和β连环蛋白,Wnt信号的目标基因,神经分化(图后含量没有改变1 (c))。

确认Wnt-related基因的表达,我们测试和分析Wnt基因和受体相关基因的实时rt - pcr。有趣的是,大多数Wnt-related基因表达下降但Wnt5a高度的表达在hADSCs神经分化后,增加显著(图2)。

3.2。在NI-hADSCs Wnt通路

我们检查是否实际上wnt可能参与促进神经分化。Wnt信号通路的分析,我们研究了Wnt-related通路使用免疫印迹分析。图3表明Wnt3表达减少NI-hADSCs主hADSCs相比。重要的是,Wnt5a / b蛋白高表达NI-hADSCs和那些与rt - pcr的结果相一致。之一,所以,我们专注于Wnt5a已知的经典之中Wnt分子表达在分化增殖细胞和增加(15,25]。不在经典里的路径不一定绑定LRP5/6复杂,所以我们没有研究含表达式。Dvl2 Naked1蛋白质水平表达下调后神经分化的数字3(一)和3(b))。轴蛋白1的表达主要hADSCs和NI-hADSCs没有改变。

3.3。信号通路在NI-hADSCs

不在经典里的Wnt信号已被证明在两种不同的方式,如增加细胞内钙^{2 +}和蛋白激酶C (PKC)的级别和激活c-Jun n端激酶(物)。调查Wnt5a影响神经分化的信号通路,我们使用phosphor-specific抗体识别信号效应器在NI-hADSCs Wnt5a激活。西方墨点法进行了展示物的表达和phosphor-JNK,经典之中Wnt信号通路的关键分子。phosphor-JNK表达水平的调节与控制GAPDH NI-hADSCs而主要hADSCs(图3(c))。此外,细胞外signal-related激酶(ERK1/2)蛋白水平在初级hADSCs和表达下调观察NI-hADSCs phosphor-EKR1/2水平并没有改变后神经分化。然而,GSK3β和phosphor-GSK3β蛋白质含量没有改变主hADSCs和NI-hADSCs。phosphor-ERK1/2 phosphor-JNK的量化数据显示,与total-JNK和phosphor-PKC水平增加,total-ERK1/2,分别和total-PKC NI-hADSCs(数字3(d) -3(g))。这些数据表明,物表达式是重要的调制器在hADSC神经分化(图4)。

4所示。讨论

在过去的几年里已经有广泛兴趣Wnt信号,它的作用也被认为发挥关键作用在控制干细胞的命运。因此,理解的机制调节Wnt信号是至关重要的,特别是在干细胞分化。特别是,Wnt5a /受体酪氨酸kinase-like孤儿受体2通路interleukin-1监管β或抗肿瘤坏死因子-α人类的msc诱导分化为成骨细胞(12,13]。此外,已知Wnt5a中介发展中交感神经元轴突分支和增长的26)和一个启动子在海马神经元突触后密度的物信号(17]。我们旨在研究Wnt5a的表达,这是一个经典之中实际上Wnt之一,在神经干细胞分化,进一步调查Wnt信号和物通路的作用。我们发现Wnt5a基因主要表达在NI-hADSCs和调节Fzd3 Fzd5。Inestrosa集团报道,通常Wnt5a表达早期发展和刺激树突棘形态发生在海马体中,它发挥了营养作用在突触活动的神经元分化和调制29日]。

我们观察到Wnt5a调节Fzd3 Fzd5表达式和提拔的神经分化hADSCs(图1),显示持续的高水平实时rt - pcr(图紧随其后2)。这个表达式模式表明,配体在神经分化过程中可能有一个角色。玉等人报道,Wnt3a Wnt5a增加神经元分化的神经祖细胞(15]。有趣的是,我们的研究结果显示,只有Wnt5a后调节神经分化和Wnt3表达水平明显下降(数字1和2)。这意味着经典之中Wnt通路,特别是Wnt5a ADSCs促进神经分化。此外,我们已经评估GSK3的蛋白质含量β和β连环蛋白后,发现蛋白质含量没有改变神经hADSCs的感应。这些结果描述这一事实Wnt /的激活β连环蛋白信号通路,规范化Wnt通路,没有参与神经分化在我们的研究中。

有两个经典之中Wnt信号通路,Wnt / Ca^{2 +},表达下调PKC或钙/ calmodulin-dependent激酶二世,或Wnt /物途径刺激Wnt5a配体(17,30.]。张等人报道,Wnt5a诱导PKC激活和促进轴突分化培养的海马神经元(31日]。这些证据表明Wnt通路参与最初的神经分化(21]。有趣的是,我们还观察到Wnt5a和磷酸化/激活PKC的表达后神经分化。在我们的研究中,我们已经表明,Wnt5a-mediated物激活神经分化的hADSCs(图是很重要的3)。这Wnt5a-mediated物激活调控的控制下不仅Fzds ERK1/2信号(图4)。

在这项研究中,我们专注于干细胞分化,尤其是神经分化,通过经典之中Wnt通路。我们已经证明Wnt5a的表达,这是经典之中,实际上wnt基因水平提高后神经元分化hADSCs和蛋白质水平的下游phosphor-JNK也以同样的方式增加。综上所述,这些数据表明,经典之中Wnt信号能激活神经分化在hADSCs Wnt5a的规定和激活/物的磷酸化途径。

5。结论

Wnt5a促进经典之中Wnt信号随后Fzd3和Fzd5表情当主hADSCs分化成神经hADSCs在体外。未来的研究将有助于了解神经分化的控制使用Wnt信号。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Sujeong Jang执行主要实验工作,收集和汇编的数据,数据分析和解释,和论文写作。Jong-Seong公园做了讨论和评论的数据和纸。Han-Seong Jeong导致财政支持,概念和设计,论文写作和最终批准纸。

确认

本研究支持基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部科技(2010 - 0025501),资助(CRI10068-1) Chonnam国立大学医院生物医学研究所和Chonnam国立大学(2012 - 2894)。

引用

1. e . Zappia s Casazza大肠Pedemonte et al .,“间充质干细胞改善实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导t细胞无力,“血,卷106,不。5,1755 - 1761年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 城市,v . s . j .吻,j·科瓦奇et al .,“间充质干细胞与骨髓细胞在糖尿病的治疗,”干细胞,26卷,不。1,第253 - 244页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j·j·s . Lee m .香港g . j .月亮,p h·李,y . h·安和o . y .爆炸”的长期随访研究静脉注射自体间充质干细胞移植患者的缺血性中风,”干细胞,28卷,不。6,1099 - 1106年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. o . y .爆炸,j·s·李,p . h . Lee和g·李,“在中风患者自体间充质干细胞移植神经病学年鉴卷,57号6,874 - 882年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. o .萨旦、大肠Melamed和d·奥芬”从骨髓间充质干细胞治疗神经退行性疾病,”生物治疗专家意见,9卷,不。12日,第1497 - 1487页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 江y, b . n . Jahagirdar r·l·莱因哈特et al .,”来自成人骨髓间充质干细胞的多能性,”自然,卷418,不。6893年,41-49,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. d . g . Phinney和d . j . Prockop”,简洁的评论:间充质干/多功能基质细胞:分化转移的状态和组织模式repair-current视图”干细胞,25卷,不。11日,第2902 - 2896页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. S.-M。安,k . Byun d . Kim et al .,“Olig2-induced神经干细胞分化Dickkopf-1 Wnt信号和归纳的差别是对这些基因的表达,”《公共科学图书馆•综合》,3卷,不。12篇文章ID e3917 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 张成泽,h。曹,Y.-B。曹,js。公园,H.-S。宋”,功能神经干细胞分化的人类脂肪tissue-derived使用bFGF和forskolin,”BMC细胞生物学第二十五条,卷。11日,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. l .凌诉Nurcombe, s m .酷”Wnt信号控制间充质干细胞的命运,”基因,卷433,不。1 - 2、1 - 7,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 问:Yu l . Liu Wnt / y段et al。。β连环蛋白信号调节神经元分化的间充质干细胞,”生物化学和生物物理研究通信,卷439,不。2、297 - 302年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. k . Sonomoto k .山冈Interleukin-1 Oshita et al。。β人类间充质干细胞诱导分化为成骨细胞通过wnt-5a /受体酪氨酸kinase-like孤儿受体2通道,”关节炎和风湿病,卷64,不。10日,3355 - 3363年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. a . Briolay p . Lencel l . Bessueille j . Caverzasio r . Buchet d·玛格尼,“自分泌刺激成骨细胞活动Wnt5a tnf在人类间充质干细胞,”生物化学和生物物理研究通信,卷430,不。3、1072 - 1077年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. l·a·戴维斯和n i Zur Nieden“中胚层干细胞命运决定:Wnt开关,“细胞和分子生命科学,卷65,不。17日,第2674 - 2658页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. g·s·j·h·j·m·Yu Kim的歌,和j·s·荣格,“增加神经祖细胞的增殖和分化孤立从产后和成年鼠大脑Wnt-3a Wnt-5a,”分子和细胞生物化学,卷288,不。1 - 2,17-28,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. r . Nusse“Wnt信号和干细胞控制,”细胞研究,18卷,不。5,523 - 527年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. g·g·法瑞斯,即居多,w . Cerpa et al .,“Wnt-5a /物信号促进集群的psd - 95在海马神经元,”《生物化学》杂志上,卷284,不。23日,第15866 - 15857页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. s . l . Etheridge g·j·斯宾塞,d·j·希斯和p·g .日内瓦”表达分析和功能分析Wnt信号机制的间充质干细胞,”干细胞,22卷,不。5,849 - 860年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 和m . w .秋l . Chen卡塞姆,“非规范Wnt /物通路的激活Wnt3a与分化命运的决心的人类骨髓间质干细胞(间质),“生物化学和生物物理研究通信,卷413,不。1,第104 - 98页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. l .Čajanek d·里贝罗Liste, c . l .教区诉Bryja Wnt /和大肠领域。β连环蛋白信号封锁神经诱导和促进多巴胺在胚胎干细胞分化,“干细胞,27卷,不。12日,第2927 - 2917页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. b .罗索和n . c . Inestrosa“WNT信号在神经细胞成熟和突触发生,”细胞神经科学前沿第103条,卷。7日,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. t . m . Michaelidis和d . c .撒谎,”Wnt信号和神经干细胞:夹在Wnt网络,”细胞和组织的研究,卷331,不。1,第210 - 193页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. r·大A.-C。Schmole, a . Liedmann m·j·弗雷希a .罗尔文和j·罗,“人类神经祖细胞分化受Wnt-3a,”生物化学和生物物理研究通信,卷400,不。3、358 - 362年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 张成泽,H.-S。宋,js。公园et al .,“神经保护效应对喹啉(−)-epigallocatechin-3-gallate段会通过PI3K通路和没有抑制作用,”大脑研究卷。1313年,男性,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. c·兰格,大肠,k . Rateitschak, a .罗尔文”Wnt信号通路和神经干细胞分化,“神经退行性疾病,3卷,不。1 - 2、76 - 86年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. d .时任美国Levine-Wilkinson,里士满,s .赫希和r . Kuruvilla”Wnt5a介导神经生长因子依赖发展中交感神经元,轴突分支和增长”《神经科学杂志》上卷,29号23日,第7581 - 7569页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. r .男爵和m . Kneissel WNT信号在骨骼内稳态和疾病:从人类突变治疗,”自然医学,19卷,不。2、179 - 192年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. a . Sastre-Perona和p . Santisteban Wnt通路在甲状腺癌中的作用。”内分泌学前沿第三十一条,卷。3日,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. l . Varela-Nallar即居多,f . g . Serrano j . Parodi和n . c . Inestrosa”Wingless-type家庭成员5 (Wnt-5a)刺激glutamatergic突触的突触分化和功能,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷107,不。49岁,21164 - 21169年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. b·j·米切尔·波维内丽和m . j . Nemeth Wnt5a调节造血干细胞增殖和重新通过ryk受体,”干细胞,32卷,不。1,第115 - 105页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. 张x, j .朱G.-Y。杨et al .,“散乱的分化促进轴突通过调节非典型的蛋白激酶C,”自然细胞生物学,9卷,不。7,743 - 754年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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