文摘

研究旨在识别不同人类成体干细胞的表型标记表达式派生,即骨髓,皮下脂肪,和网膜脂肪,培养在不同的媒体,即DMEM-Low葡萄糖,Alpha-MEM, DMEM-F12 DMEM-KO和长期的文化条件下(> P20)。我们通过使用各种造血immunophenotype特征,间叶细胞,内皮标记,细胞粘附分子在长期文化(Passages-P1 P3, P5、P9 P12, P15,和P20)。有趣的是,数据显示类似的标记表达谱不管来源,基底媒体,和广泛的培养。这表明本研究中提到的所有成年干细胞来源相似表型标记和所有媒体似乎适合培养这些来源。然而,观察差异的标记,如CD49d CD54, CD117、CD29,和CD106,从而需要进一步研究这些标记。除了上述目标,据悉immunophenotyping的研究作为一个有价值的工具来识别每个细胞的固有财产,从而导致一个有价值的基于细胞治疗。

1。介绍

无处不在的多功能间充质干细胞的存在附件是一个强大的再生工具为其在细胞疗法使用渲染更换磨损细胞(1,2]。尽管近期发展,干细胞治疗仍处于起步阶段,由于在再生适用性与几个障碍。这可能是由于缺乏理想的干细胞来源占病变的功能改进。隔离和适用性的干细胞来自史前来源,人类骨髓,当代的人类脂肪组织来源的再生医学领域发生了革命性变化(3- - - - - -5]。虽然这些来源超过一定的不确定性,干细胞疗法在很多情况下是不成功的6,7]。这个失败的理由就干细胞的生存而言,扩散,再生仍不清楚。

虽然同样的原因并不完全理解,研究者战斗对克服认识障碍,如高血糖、缺氧和炎症的有利影响最大化MSC在细胞疗法8,9]。然而,然而另一个潜在的原因这种失败可能是由于缺乏了解单个组件天生的能力形成的基础组织维护、修复、再生。这是归因于这样一个事实:脂肪组织和骨髓的干细胞存在于一个更异构混合原油和其他成分如疏松结缔组织基质、内皮细胞、血管平滑肌细胞,白细胞,周围的周肥大细胞、间充质干细胞和造血祖细胞和巨噬细胞等免疫细胞居民(10- - - - - -12]。这些异构的体外表征和维护组织干细胞/祖细胞是至关重要的方面在评估他们的临床应用潜力。这是一个众所周知的事实,干细胞使用他们的受体绑定其他信号分子的沟通进行自我更新和分化的功能。尽管几次努力揭示它们的生物学特性的研究[10,13),这些干细胞的表型和功能特性,迄今为止,仍然模糊。

这种模棱两可的原理依赖于假设的影响,不同的媒体和媒体组合可能导致标记表达式的差异(14]。此外,它还报道说,这些标记可能是也可能不是在原始阶段明显与扩张或迷失在体外或体内15),从而为治疗干预固有的身份人口变成了一个艰苦的任务。这些差异基于msc的表型特征使其适用性不定,从而要求寻求识别潜在的标记资料msc在体外。在再生医学治疗退化性疾病的时代,重要的是要解决这个不确定的苦难。因此,识别潜在的标记使用最广泛的来源,如脂肪组织和骨髓解决以下原因是至关重要的。首先,要理解每个细胞群的先天能力根据其表面表达模式,其次,推进我们对基本的生物过程的理解干细胞的自我更新和分化,也就是说,他们的体内功能和最后,基于划分和发展价值的细胞疗法。

代替上述情况,本研究旨在确定表型标记表达谱等不同来源的骨髓和皮下脂肪在不同媒体(DMEM-Low葡萄糖,Alpha-MEM、DMEM-F12 DMEM-KO)和长期(> P20)文化条件。网膜脂肪也包括在研究其巨大的力量也开始(16- - - - - -19]。

2。材料和方法

2.1。抽样

所有样品的协议后被医院审查委员会进行审核和批准,生命线Multispecialty医院的伦理委员会,钦奈,印度。样本收集内部和研究追求向病人解释紧随其后获得书面知情同意之前收集的样本。

网膜脂肪收集从接受开腹探查术的患者。批准g的网膜脂肪活检获得4科目(),年龄从28 - 50和BMI的意思公斤/米²。收集到的组织在4小时内处理去除脂肪的病人。

肥胖病人的皮下脂肪收集在腹壁整形术的形式接受减肥手术。皮下脂肪得到25 - 50 g的4科目()年龄与身体质量指数从- 55公斤/米²完成后的手术。组织量化,并在4小时内处理的集合。

人类骨髓样本取自髂嵴的患者()进行实验性干细胞治疗脊髓损伤的平均年龄和身体质量指数(BMI)。所有的样品都在2小时内处理的集合。

2.2。细胞隔离

2.2.1。骨髓

单核细胞是由密度梯度离心法分离骨髓吸入使用聚蔗糖Paque。吸入物与两倍稀释的PBS(表达载体)和分层聚蔗糖Paque离心管(干细胞技术)的解决方案。分层样本进一步离心机和巴菲外套层包含单核细胞收集。孤立的单核细胞悬液洗了PBS去除残余聚蔗糖含量和其他污染物。红细胞内容在孤立的颗粒细胞溶解使用NH 0.7%₄Cl和裂解反应了冰冷的生理盐水为0.9%。暂停是单核细胞离心获得分数。孤立的细胞进一步resuspended PBS及其细胞总数和生存能力被台盼蓝排斥法确定。

2.2.2。脂肪组织

手术样本获得皮下脂肪和网膜脂肪在洗水洗三次缓冲区1 x磷酸缓冲盐(PBS) (Hi-Media)含1% antibiotic-antimycotic解决方案(表达载体),剁碎成2 - 3毫米直径。这些碎件进一步消化0.075%胶原酶1型(Hi-Media)解决方案。10%胎牛血清(的边后卫)(英杰公司)被用来抑制胶原酶的活性。消化细胞在600 g离心10分钟20°C。间质血管分数被进一步获得的颗粒和受到使用0.7% NH红细胞溶解₄Cl溶液在室温下5分钟。细胞受到进一步的离心和颗粒在PBS resuspended中恢复过来。单个细胞悬液过滤后得到的细胞生存能力评估用台盼蓝染色法。

2.3。细胞培养

从这些上述来源细胞分离板的密度/ 25厘米²瓶(Nunc)和培养在四个不同的过滤消毒媒体:DMEM-LG(英杰公司),αmem(表达载体),DMEM-F12(表达载体),和DMEM-KO(表达载体),其中每个补充10%的边后卫(antibiotic-antimycotic英杰公司)和1%的解决方案。这些细胞被保持为2 - 4天前第一媒体的变化。37°C, 5%的标准培养条件有限公司₂,95%的湿度是维护和confluency 70 - 80%。主文化亚文化直到20与媒体的变化通过每周两次。

2.4。流式细胞仪分析

Flowcytometric描述了使用正欲,迪金森流式细胞仪咏叹调(BD流式细胞仪Aria)。约细胞染色饱和浓度的荧光染料结合抗体,CD34 PE (BD生物科学)、CD45 APC CY7 (BD生物科学),CD133 APC (e-Biosciences)、CD31 FITC (BD生物科学),HLADR PERCP (BD生物科学),CD44 FITC (BD生物科学),CD73 PE (BD生物科学)、CD13 APC (BD生物科学)、CD29 PE (BD生物科学),CD90 PERCP (e-Biosciences)、CD105 APC (e-Biosciences) SSEA4 ALEXAFLOUR (e-Biosciences), CD117 APC (e-Biosciences), ABCG2 PE (e-Biosciences) CD166 PE (BD生物科学)、CD106 FITC (BD生物科学),CD54 PERCP (BD生物科学),CD 49 d PE (e-Biosciences)和ALDH。黑暗中的细胞孵化20分钟37°C。孵化细胞被洗了三次洗流缓冲区组成的磷酸缓冲补充2% (v / v)的边后卫(西格玛奥德里奇)和0.1% (w / v)的叠氮化钠,NaN₃(西格玛奥德里奇)和500年resuspendedμL (BD流式细胞仪流和涡流。BD FACS-DIVA软件被用于样本数据采集和分析。创建第一个情节与FSC和SSC在各实验。随后的情节都使用各自的flourochrome创建的(轴)连同SSC (轴)。FSC和SSC创建辨认不同的细胞群,避免碎片。同形像控制被用来设置盖茨和分析区域。每个抗体的读数鸡尾酒在各自管运行、分析和记录。所有样本的特点和用最少的10000事件。

2.5。ALDH分析

ALDH分析使用醛脱氢酶工具包(干细胞技术)。干ALDEFLUOR试剂被激活与DMSO其次是孵化,孵化2 N在室温下盐酸。孵化混合物进一步添加ALDEFLUOR分析缓冲区和储存在−20°C。简单地说,细胞被离心分离和回收resuspended分析缓冲区(细胞每毫升)。暂停样本处理5μL(激活ALDH衬底在水浴37°C。孵化样本进一步离心机和获得的颗粒是在寒冷的ALDEFLUOR resuspended分析缓冲区。染色细胞分析与FITC flowcytometer通道。样品管包含DEAB (ALDH Diethylaminobenzaldehyde-a特定抑制剂)和控制运行。

2.6。统计分析

所有数据来自网膜脂肪、皮下脂肪和骨髓样本在不同的媒体被表示为平均值±标准错误意味着(SEM)。用单向方差分析对数据进行分析(方差分析)和邓肯多个范围测试使用SPSS 15.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。值计算确定统计上显著的差异。结果被认为是显著时和。

3所示。结果

3.1。比较比较表面抗原的表达谱

早期和后来的msc段网膜脂肪、皮下脂肪和骨髓培养广泛(直到P20)在四个不同的媒体如(图所示1)的表型特征不同面板的细胞表面标记资料包括间充质干细胞,CD90、CD73,和CD105作为国际社会提出的细胞疗法(ISCT)造血干细胞,CD34、CD45、和CD133细胞粘附分子,CD29、CD44, CD49d, CD166 CD106, CD54,和CD31和某些独特的标记如CD13、CD117, HLADR, ABCG2, CD140b, SSEA4,并使用flowcytometry ALDH。

这些多样化的dotplots flowcytometric分析为网膜脂肪(数字标记2和3举例说明)。表面抗原表达谱的比较培养的msc在早期,后来这些上述段落在DMEM-LG(图源4),Alpha-MEM(图5),DMEM-F12(图6),和DMEM-KO(图7)理解图形的形式意味着±SEM的统计学意义。尽管大部分的相似之处标记在所有媒体,有些不一致的表达式中确定标记如CD117、CD54, CD49d。

为便于比较表达分析,标记表达式的清晰度是根据先前指定的范围和类别(表1)如:(90 - 100%),显著高表达(75 - 89%),中度表达(40 - 74%),低表达式(11 - 39%)和稀疏表达式(1 - 10%)20.]。

3.2。比较分类表面抗原的表达谱

3.2.1之上。造血干细胞标记

造血干细胞标记物如CD34、CD133 CD45及HLADR的表达进行了研究。很明显从分析这些标记是稀疏表示在早期和后来文章来源的所有媒体除了CD45的略微高表达在早期通过网膜脂肪msc在DMEM-F12培养。

3.2.2。间充质干细胞标记

研究显示类似的表达这些标记CD90、CD105,和CD73长期文化条件的所有媒体来源,所定义的ISCT [21]。SSEA4显示稀疏表达式所有媒体的所有来源。然而,增加表达被确认在DMEM-LG的来源。

3.2.3。细胞粘附分子表面酶/人口

msc transendothelial迁移和归航的先天属性亏欠细胞粘附分子的存在。目前的研究包括以下细胞粘附分子:CD29、CD44, CD166 CD106, CD31, CD49d, CD54,表面酶:CD13和ALDH一边人口:ABCG2和CD117。CD106稀疏表达式和CD31在所有被发现的所有媒体来源。同样,ALDH表达式被发现低所有来源的媒体除了其温和的表达在早期和后来的DMEM-F12段落。与MSC的表达特定的标记,标记的研究显示不同表达式如CD54 CD49d,和CD117在早期和后来段落的所有媒体来源,除了其类似CD54的表达在科幻小说的早期文章和BM, CD 49月初d通道和CD117在早期和后来的章节所有媒体如(表所示的科幻小说1)。另一方面,标记如CD29、CD44、CD166 CD13表现出非凡的表达式在长期文化条件除了轻微下降,其在早期通过表达CD13 Alpha-MEM DMEM-KO。

4所示。讨论

过去6年,有几个报告变化在细胞表面标记的特征在不同阶段的MSC文化从骨髓和脂肪组织(3,10,13,20.,22- - - - - -26],进一步使细胞表面标记表达式研究一个艰巨的任务。表达谱是确定变化作为时间的函数在通道和塑料依从性(27,28]。因此,缺乏全面了解干细胞更新机制及其功能的分化。虽然,维护等具备干细胞性质的细胞增殖和细胞分化在长期文化不同的媒体进行了研究[9,19,29日,30.),识别潜在的标记特定于msc现有的现代治疗成人产后如骨髓和脂肪组织来源仍然是难以捉摸的。进一步,它还没有被研究过这些标记在长期的文化用不同的媒体。这形成了我们现在研究的基础。

不同的文化媒体的影响(DMEM-LG, Alpha-MEM DMEM-F12, DMEM-KO)长期暴露于msc获得的文化条件,科幻小说,并详细分析了BM多样化的表面抗原,直到P20骨髓样本,直到P25脂肪组织样本。四个样品从每个源处理,与网膜脂肪和皮下脂肪,只有一个骨髓样本能超出P20和休息失去P15之外的增长潜力。然而,另一方面,不同文化传媒的影响并没有导致标记表达变化在早期和后来的段落的来源除了某些展出标记变化CD49d, CD54, CD117。

这些标记的变化在我们的结果在所有媒体是类似于某些以前公布的结果3,10,13,23,24,26]。然而,进一步深入研究是至关重要的细胞粘附分子与细胞骨架的MSC。这可能提高MSC治疗治疗的工具的理解参与的应用neovascularisations,血管生成,其他血管疾病的治疗。这是由于这样的事实,CD117作为一个重要的生长因子,起着至关重要的作用在细胞生存、增殖和分化(31日]。CD54内皮和leukocyte-associated跨膜蛋白是一个长而闻名的重要性在稳定和信息交互和促进白细胞内皮轮回。由于这些绑定特性,CD54经典被分配的功能细胞间粘附[32]。同样,CD49d连同对应的高表达,CD29,一起形成VLA4应该扮演一个角色在动员和导航20.,23,33,34]。

然而,我们发现了一个相反的表达模式标记如CD49d和CD106相比以前发表的报告。文献报道,脂肪组织msc表达CD49d而不是CD106,而骨髓msc表达CD106但不是CD 49 d。这种互惠的表达模式是有趣的因为CD106 CD49d同源受体,这两个分子代表一对receptor-ligand的一部分,有一个重要的造血干细胞归巢作用和从骨髓动员(35- - - - - -37]。然而,我们的研究揭示了不同表达模式的CD49d所有来源包括骨髓和类似的稀疏表达CD106获得来源,包括脂肪组织。进一步研究有关CD49差异,CD29、CD106可能解释这些分子发挥重要的互动作用。此外,CD13也确定是一个强有力的标志,起着至关重要的作用在血管生成和迁移20.,38]。

此外,细胞表面标记的类似的显著表达模式如CD90、CD105, CD73, CD29、CD44, CD166和CD13、否定表达CD34、CD45、CD133, CD31, HLADR获得在我们的研究中已发现与msc表面高度一致的表达模式,不同的文献3,22,24,39,40]。这种一致性在负表达式支持这些标记表达式与通道丢失;和随后的扩张将选择一个相对均匀的细胞群与整个细胞群(3,10,22,26,39- - - - - -41]。知识的财富对这些标记对自己至关重要的迁移和归巢唤起这些标记扮演一个执行这些上述函数凸轮在MSC。虽然某些MSC特定标记的存在和功能,还有其他几个标记的特异性和功能之间的不确定性MSC,从而要求更广泛的研究。

此外,本研究还分析了ALDH的表达和ABCG2在所有组织和不同基底介质的来源。这是由于这一事实ALDH同功酶参与耐药性和视黄酸生成将是至关重要的保护干细胞免受有毒endogeneuos和外源性醛和分化的能力42];它是一个关键的标志msc的预测治疗效果。同样,ABCG2在保护过程中发挥作用的干细胞通过增加他们的生存能力和增殖潜能,干细胞的基础维护和更新过程(43]。寻找一种新型标记为未来的孤立的组织特定的MSC,破解MSC多能性的概念是由帮派等人SSEA-4和同事。在一致性和他的报告,我们的研究也显示SSEA4的表达式。更确认了其表达在网膜脂肪msc和DMEM-LG媒介相比其他来源和媒体,分别为(44]。

5。结论

这是证明了msc的表型特征保持不变不管组织的来源,基底媒体,和广泛的培养。然而,进一步关注标记,如CD49d CD54, CD117、CD29、CD106每个源。除此之外,我们的数据清楚地表明,任何基底媒体可以用于培养这些来源。

虽然该研究解决的谜循环所有在组织特定的细胞表面标记的身份,还有很多在所有方面的探索干细胞的表型特征生成特定的基于msc特定条件细胞疗法。

缩写

Alpha-MEM:	α最小essentialmedia
体重指数:	身体质量指数
CD:	集群的区别
DEAB:	Diethylaminobenzaldehyde
DMEM:	杜尔贝科修改鹰的媒介
DMSO溶液:	二甲亚砜
的边后卫:	胎牛血清
柯:	敲除
格林:	低葡萄糖
硕士:	间充质干细胞
PBS:	磷酸缓冲盐。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Neha Kantawala,胃肠病学家,生命线严格的医院,和她的手术团队,为他们提供样品。作者还要感谢Nandhini女士为她的帮助最终校对。作者还要感谢捐赠者,自愿参加这项研究。