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研究文章|开放获取
南希,Abhijeet德斯穆克Swathi SundarRaj Priya,维迪雅Krishnan, Murali Cherat西班牙森Majumdar, ”开发的系统和方法,自动隔离间质血管从脂肪组织Lipoaspirate分数”,干细胞国际, 卷。2015年, 文章的ID109353年, 11 页面, 2015年。 https://doi.org/10.1155/2015/109353
开发的系统和方法,自动隔离间质血管从脂肪组织Lipoaspirate分数
文摘
自体脂肪移植对软组织重建受到不可预测的长期移植物的生存挑战。脂肪提取间质血管分数(SVF)是流行在组织重建SVF-enriched脂肪移植演示改善移植。SVF也有潜在再生医学在缺血组织的重构通过促进血管生成。因为SVF细胞不需要文化扩张,正尝试开发自动化设备隔离SVF的护理。我们报告一个封闭的发展,自动化系统处理多达500毫升lipoaspirate使用细胞尺度依赖的过滤技术。自动获得的收益率SVF组织消化和过滤(1.17±0.5×105获得的细胞/克)相当于手动隔离(1.15±0.3×105;p= 0.8),细胞分离的可行性,这两种方法都大于90%。CD34 +细胞成分包括CD31−脂肪基质细胞,CD34 + CD31 +内皮祖细胞,和CD34−CD31 +内皮细胞,和它们的相对比例相当于SVF孤立的手工方法。CFU-F容量和血管生成因子的表达也比得上手动方法,建立完全自动化的概念验证SVF隔离,适用于整形手术和再生医学应用。
1。介绍
脂肪组织代表一个细胞源与自体干细胞治疗和银行的明显的优势。脂肪组织可以通过抽脂和lipoaspirate容易收获一个废弃的副产品整容手术,可以通过酶或机械加工分离获得组件细胞分数。间质血管分数(SVF)通过这个过程是一个丰富的不同类型的干细胞和祖细胞,已成为越来越数组的应用于再生医学中心(1]。SVF包含多功能基质细胞称为脂肪间充质基质细胞(ASC),内皮细胞(EC),内皮祖细胞(EPC), preadipocytes,造血细胞周围的周2,3]。这鸡尾酒SVF的祖细胞,特别是ASC和EPC多是有据可查的血管生成和neovasculogenic属性(4)被剥削的几个临床试验带来治疗性血管生成(1]。SVF还港口成熟细胞如成纤维细胞、血管平滑mucle细胞,内皮细胞,淋巴细胞,单核细胞,红细胞(RBC)和脂肪细胞的一小部分2,3]。许多临床试验证明安全(5- - - - - -7和有效性的自体SVF使用再生细胞治疗伤口愈合,骨再生,心血管和外周血管疾病,和组织工程1,8]。
此外,SVF展现了巨大的潜力在整形外科软组织修复,重建和增强治疗或审美的目的(9,10]。临床使用SVF在这个领域发展飞速发展在过去的几年中由于易于进入皮下脂肪组织的整形外科医生。常见的程序乳癌术后乳房重建(SVF已经应用在哪里11,12],整容隆胸[11,13),面部重组(11,14,15),瘢痕畸形矫正,脂肪萎缩治疗(16]。SVF-enriched脂肪移植进行这样的过程已经证明改善移植自体脂肪移植导致几个临床宗师都采用这种治疗的首选方法大量软——组织缺陷。ASC和EPC的活动人群SVF一直假设带来快速的血管生成,促进缺血性脂肪移植物的生存,而preadipocyte人口被认为有助于脂肪细胞营业额和维护长期移植物体积(17]。
的条目的一个主要挑战SVF基础治疗的诊所是一代临床可接受的等级SVF细胞以最小的操作。重要的是识别和控制所有可能的因素可能会影响SVF细胞制备的安全和质量,应依照执行现行良好生产规范(cGMP)的指导方针。隔离SVF需要收获脂肪通过抽脂和运输cGMP-compliant实验室作进一步处理。各个步骤SVF隔离大致包括脂肪组织的洗涤去除血液和肿起的体液,酶消化,离心细胞恢复。手动处理因此需要昂贵的基础设施和熟练的技术人员不可以与大多数诊所。许多诊所获得SVF将脂肪转移到外部设施的细胞分离,进而需要存储、处理和运输的脂肪和细胞,和多个病人。一致性处理的组织样本和安全台过程在一个开放的系统也是一个问题。在很大程度上克服这些挑战的尝试完全自动化的发展,现阶段的设备可以单独SVF从脂肪在一个高度质量控制和一致的方式。
在这个报告中,我们描述了设计和开发一个自动化系统,用于处理lipoaspirate获得SVF细胞,用于即时使用。向自动化,我们已经开发出一种新的过程供分区隔离SVF SVF进入水相膜过滤的消化和随后的复苏。这个过程首先是标准化的手动处理。原型设备当时发达的按照流程的要求。原型的方法后来自动化设备和SVF获得确定的特点。SVF孤立使用系统验证了产量、可行性、组成、克隆扩张能力,相比和血管生成生长因子的表达,对使用离心手动过程。本文提供的数据表明,SVF孤立的自动化过程满足预期的潜在的治疗应用标准。
2。材料和方法
2.1。人类脂肪组织样本
这项研究是根据伦理委员会进行干细胞研究委员会和印度麦利普医院的治疗,印度班加罗尔(研究MIRM数量/ 002/08)。人类脂肪组织样本获得的书面知情同意个人择期整形手术的整形手术,印度麦利普医院。Lipoaspirate组织从腹部、大腿或臀部地区男性和女性捐赠者()。捐赠者的平均年龄为30.86岁(范围17-47年),和平均身体质量指数(BMI) 29.4(从26 - 35周不等)。捐赠者都是印度血统。每个组织样本同时处理所有的手动和自动方法比较研究的产量、生存能力,细胞成分和功能参数。
2.2。手动隔离SVF离心的整个组织消化
SVF分离酶从lipoaspirate组织通过与胶原酶消化18]。短暂,送气音和乳酸林格液洗了三到四次的解决方案和胶原酶消化NB-4(美国赛瓦电泳GmbH)乳酸林格液的解决方案在标准组织培养瓶(BD猎鹰)。消化了37°C和5%湿润有限公司2和连续搅拌60分钟。摘要当时在400×g离心20分钟。包含脂肪细胞被丢弃的上层清液和颗粒包含SVF洗两次,透过100μm细胞过滤器(BD猎鹰)。SVF细胞数手动使用纽鲍尔室。生存能力是由染色7-aminoactinomycin D (7-AAD) (BD生物科学)和流式细胞术分析(BD LSR II, BD生物科学)。计算和可行性分析每个样本在两个复制。
人工计数的准确性的验证SVF是由人工计数方法的直接比较使用基于自动化图像获得对计数细胞计数器(斜面形象血细胞计数器,生活技术)。区别这两种方法被发现不显著(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/109353)。
2.3。手动隔离SVF相分离和过滤
Lipoaspirate组织与乳酸林格液洗了三到四次的解决方案和胶原酶消化NB-4(美国赛瓦电泳GmbH)如上所述连续搅拌。年底组织消化消化被允许休息一段10分钟在室温下通过组织培养瓶在垂直位置,以便明确分离的脂肪和低含水阶段。当时较低的水相转移到新鲜的管和离心获得SVF细胞颗粒在最初的实验中,标准化相分离过程。在随后的实验中,相分离的时间减少到2分钟的脂肪和水阶段被发现分区在这段时间内有效。标准化的过滤过程中,水相的消化是连续通过膜过滤不同的孔隙度。尼龙过滤器(微孔)的100年μm和35μm孔隙大小被用于粗滤,聚碳酸酯跟踪腐蚀(PCTE Sterlitech公司)过滤器的孔隙大小10μ米,8μ5米,μ米,3μ米,或2μ米被用于决赛SVF保留和恢复。过滤器滞留物恢复,SVF细胞数手动使用纽鲍尔室。可行性的SVF滞留物是由染色7-AAD (BD生物科学)和流式细胞术分析(BD LSR II, BD生物科学)。计算和可行性分析每个样本在两个复制。SVF的组成是由immunophenotyping和流式细胞术分析。
2.4。自动隔离SVF
的主要业务模块自动化系统(专利申请中)组成的一个组织消化室、加热和搅拌机理、和三级过滤系统。组织消化室设计提供最大的表面积与体积比,使最大脂肪和酶层之间的联系。建筑元素在室以及一个轨道风潮机制旨在使高效混合脂肪的酶。搅拌机制装备提升消化腔垂直位置允许相分离。消化腔的几何形状也理想提供最大高度有效的分区,分离,和排水水和脂肪阶段的内容。过滤系统由多个过滤单元,每个过滤容量为100毫升。一个过滤单元组成的一个系列100年安排三个过滤膜μ米,35μ5米,μ孔隙度。过滤装置是配备了一个振动机制来促进过滤。整个系统是通过一个数字程序控制的用户界面。组织和液体流动控制使用蠕动泵和压力阀。
lipoaspirate组织样本被转移到组织消化室,和各种洗涤步骤,消化,过滤以自动化的方式进行。过滤室的收集SVF恢复使用注射器。SVF细胞数手动使用纽鲍尔室。SVF决心通过染色的可行性7-AAD (BD生物科学)和流式细胞术分析(BD LSR II, BD生物科学)。计算和可行性分析每个样本在两个复制。SVF的组成是由immunophenotyping和流式细胞术分析。
2.5。Immunophenotyping
下面的荧光染料结合用于标记细胞表面抗原的抗体:CD34 PE-Cy7, CD31 APC, CD73 PE、CD146 PE、CD45 PE、HLA FITC博士,血型糖蛋白PE (BD Pharmingen)。有关老鼠同形像(BD Pharmingen)被用作控制。细胞染色标记抗体在黑暗中在4°C 45分钟。至少30 000事件是收购了BD LSR二流式细胞分析仪使用BD FACSDiva软件结果进行了分析。
2.6。CFU-F化验
新孤立SVF细胞被播种在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;英杰公司)补充10%胎牛血清(的边后卫;Hyclone)、2毫米谷氨酰胺和抗生素(表达载体)six-well组织培养板(BD猎鹰)电镀密度的2000年,1000年,500个细胞/厘米2。SVF镀在重复每个电镀密度。经过9天的孵化,PBS的细胞被洗,在1%多聚甲醛固定20分钟,0.1%甲苯胺蓝染色(1%甲醛溶液)瓶1 h,然后用水冲洗。克隆形成的数量unit-fibroblasts 50 (CFU-F)被计算总量被定义为CFU-Fs细胞或更多。
2.7。rt - pcr验证
总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒),DNA处理自由DNase我(Ambion),使用上标三世第一链反向转录工具包(表达载体),和用于PCR的互补。18 s核糖体RNA表达用于所有样本集的互补脱氧核糖核酸浓度正常化。使用的引物序列和扩增子尺寸表中列出1。基因表达分析每个样本进行复制集。
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| 助教:退火温度;英国石油公司:碱基对。 |
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2.8。统计分析
相应的对数据集之间的差异SVF孤立的手动和自动的方法进行使用成对的学生的统计学意义以及;被认为是显著的。
3所示。结果
刚获得lipoaspirate组织被分成两部分进行进一步处理。在材料和方法部分,所述一个一半的组织是手动清洗和消化后的水相分离消化是获得SVF离心机。并行,另一半的组织是由传统的手工处理方法在整个组织消化包括脂肪和水组件是离心获得SVF细胞颗粒。
3.1。复苏SVF进入水相的消化和扩大
观察之间的收益率没有明显的统计学差异SVF从水相分离,获得比离心整个组织的消化(表2)。恢复SVF水相测试是有效的卷从50到500毫升的组织处理。意味着SVF产量获得的水相消化范围从0.89到2.00×105细胞每克的脂肪组织的脂肪加工,这产量范围87至117%的伴随整个组织消化离心获得的收益率。SVF通过两个方法也是评估CFU-F集落形成祖细胞的数量的测定(表3)。CFU-F的数量仅来源于SVF隔绝水相(平均每100个细胞CFU-F = 0.45)被发现比得上离心获得的整个组织的消化(平均每100个细胞CFU-F = 0.41)(表3)。结果清楚地表明,克隆扩张产能SVF孤立使用这两种方法是等效的。因此,复苏的SVF沉积的水相消化下定决心要成为一个有效的方法进一步自动化和可伸缩的体积500毫升lipoaspirate 50毫升。
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| 细胞产量表现为平均每克脂肪组织细胞数量从3到7捐赠者为每个卷样品加工。百分数表示恢复水相分离的比例相对于整个组织的离心消化。数据被表示为平均数±标准差。 |
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| 数据表示的意思是CFU-F获得的镀层密度从三个个人捐赠者,每个重复化验。错误代表SD从三个个人捐赠样本。 |
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3.2。恢复SVF保留在膜过滤器
相对差异在细胞大小不同的细胞类型之间发现SVF流式细胞仪通过测量它们的光散射特性。的主要细胞类型已知存在于SVF进一步的表面标记概要如下:ASC (CD31−CD34+)、EPC (CD31+CD34+),电子商务(CD31+CD34−)。从光散射配置文件(图1)ASC、EPC和EC人口有高向前散射(),可以被区分开来的碎片显示低向前和侧散射属性(和)。一些EPC也被发现区域表明EPC小于ASC和电子商务。这些结果表明,再生细胞群SVF,即ASC, EPC和EC分开细胞碎片通过保留膜过滤器。
(一)
(b)
(c)
为了恢复SVF细胞不离心,分离水相的消化是通过各种生物相容性材料和孔隙度选择的过滤器过滤器规格从SVF保留所需的细胞群。水分数是100年的第一顺序预滤器通过编织尼龙过滤器μm和35μ米孔隙大小去除粗糙的材料如未消化的组织、胶原纤维和细胞聚集。滤液被加载到聚碳酸酯跟踪腐蚀不同孔隙大小的过滤器(PCTE)从10μ米2μm。不同的分馏SVF细胞组件之间的滞留物(收集过滤器)和渗透(材料)然后通过流式细胞仪检测。大于60%的SVF细胞恢复PCTE过滤器的滞留物孔隙大小5μ米及以下(图2(一个)),观察细胞在10的巨大损失μ米和8μ使用过滤器。5的规范μm因此选为最佳的孔隙大小的最大恢复SVF细胞过滤的水相组织消化。保留的细胞在5μm过滤器被染色和蓝色Toluidene可视化。代表图像的彩色过滤器图1中提供了补充。
(一)
(b)
SVF恢复了水相的复合过滤通过5μm PCTE膜比较反对SVF恢复了离心整个组织的消化,结果被发现(图非常相似2 (b))。的平均比例不同SVF组件从离心和过滤方法确定22±7%,26±3%,CD31的分别−CD34+ASC, 36±10%, 31±10%, CD31的分别+CD34+EPC和3和3±1%±2%,CD31的分别+CD34−电子商务人群。这些结果让我们得出这样的结论:分离的水相含有SVF脂肪分数,其次是复苏细胞的膜过滤器是可行的,需要进一步向自动化发展。
3.3。过程自动化
组织消化室、加热和搅拌机制,开发和多级过滤单元对自动化涉及的各个步骤SVF隔离,即(图3)、洗涤和消化lipoaspirate组织,水相分离、细胞浓度连续过滤通过尼龙100的过滤器μm和35μm孔隙大小,最终复苏的SVF 5μm PCTE过滤器。设备编程处理500毫升lipoaspirate组织。蠕动泵最初的影响研究,确保泵的操作不会导致机械损伤组织和细胞。SVF孤立的产量和可行性lipoaspirate组织之前和之后通过蠕动泵被发现具有可比性(补充表2,通过配对以及,)。
个人独立子系统开发组织消化和过滤的测试来确定自动化流程的效率通过离心与手工SVF隔离治疗。每个流程步骤所花费的时间陪同表如图所示3。总流程时间从开始运行到复苏的SVF被发现是133分钟。的平均体积SVF恢复从一个单一的过滤装置被发现10.8毫升(范围4毫升)。的产量和可行性SVF细胞通过自动组织消化和过滤使用设备被发现等效(,,配对以及)手动过程(数据获得的4(一)和4 (b);表4)。自动隔离的平均收益率被发现94±28%的消化和98±21%的过滤系统,分别与基线相比,用手动过程;(100%)细胞分离的方法的可行性一直大于90%。SVF的组成细胞恢复自动化过程是由流仪结果和被发现与传统的手动过程(表5)。特别是,CD31的平均百分比−CD34+细胞从自动化流程25±9%,相比20±5%手动过程,和CD31的百分比+CD34+细胞获得24±6%和30±10%,分别为自动和手动的方法。脂肪组织也包含人口CD31的周−CD146+(19]。周检测,CD31−ve细胞SVF封闭(图5(一个),上下左面板)和分析CD34的表达和CD146(图5(一个),上下面板)。如图5(一个),CD34−CD146 +细胞的比例中CD31−ve SVF人口被发现与细胞之间孤立的手动和自动的方法。的百分比CD31−CD146 +细胞总SVF也发现等价之间的手动过程(1.9±1.2%)和自动化流程(2.0±1.4%)。这些观察确认SVF孤立使用自动化设备包含相关比例的ASC, EPC和周皮细胞的数量。
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| 数据被表示为均数±5个人样本测试。SVF产量表现为细胞数量×105/克脂肪组织。百分比收益率表明比例恢复到自动处理相对于收益率从手工处理作为基线比较器。不同细胞之间的收益率手动离心方法和自动过滤不显著(,配对以及)。 |
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| 表与标准错误代表的意思是阳性细胞百分比,从四个不同的数据集。ASC:脂肪衍生干细胞/基质细胞;EPC:内皮祖细胞;加拿大皇家银行:红细胞。 |
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(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
半定量rt - pcr的基因表达分析显示,血管内皮生长因子的表达水平(VEGF-A),肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)、CD31、CD34、血管性血友病因子(vWF)和血管内皮钙粘蛋白(SVF VE-Cadherin)细胞分离的自动化过程类似的手动隔离SVF(图5 (b))。虽然细微的差别在某些基因的表达水平,例如,HGF,观察不同捐赠者之间,没有显著差异SVF孤立使用手动或自动的方法。CFU-F来自SVF孤立的数量由自动化系统也发现类似SVF通过手动处理(图5 (c))。
综上所述,这些数据表明,产量和SVF细胞的生存能力,以及他们的表型组成、CFU-F潜力和血管生成基因表达谱之间是等价的手动和自动的过程。
4所示。讨论
SVF港口潜力巨大的治疗多种再生和重建应用程序。然而,它的使用可以获得临床相关的许多挑战限制级SVF细胞。这些包括缺乏c-GMP兼容的基础设施,医生技术和熟练的技术人员,隔离,所花费的时间和后勤障碍,所有这些可以影响不育,生存能力,功能,和细胞制备的一致性。这些挑战可以通过一个自动化的可用性,克服细胞隔离封闭系统,可以使用在诊所提供SVF细胞在一个高度质量控制和一致的方式。
脂肪组织的酶消化后,离心的消化是最传统和最广泛使用的SVF复苏过程,通过手动处理(18),在现有的自动化系统11,20.]。我们旨在开发一个系统和过程分离临床级SVF细胞没有离心机的使用以减少设备业务,发展出温柔细胞隔离的过程。朝着这一目标,我们已经开发出一种新的SVF隔离过程中消化脂肪组织的水相分离消化脂肪和SVF细胞被保留在恢复从水相膜过滤器。设备开发是由设计和原型的主要操作模块包括组织消化室、加热和搅拌机理、和三级过滤装置。整个系统是通过一个数字程序控制的用户界面。这个系统被用来消化和恢复从输入lipoaspirate SVF组织。SVF孤立使用系统验证了产量、可行性、组成、克隆扩张能力,和血管生成生长因子的表达,使用离心相比,手动过程。
分区SVF进入水相的组织消化被发现效率,产量,生存能力,细胞成分,CFU-F SVF能力恢复了这种分离是观察到相当于传统的离心分离方法。每克脂肪组织的收益率SVF从我们的过程(1 - 2×105)也比较与那些报道Celution (2 - 2.5×105)和多站(1×105)系统(20.)和远优于收益率Cha-station报道(< 2.5×104)和Lipokit (< 5×104)[20.),所有的系统开发SVF医疗点隔离。
注脂术软组织重建程序可能需要一系列卷的脂肪组织移植取决于缺陷的体积或所需增加的程度。虽然可以解决面部脂肪萎缩嫁接低至10 - 20毫升的脂肪组织,隆胸手术可能需要多达200 - 300毫升的脂肪移植一个乳腺癌[11- - - - - -13]。尽管SVF的比例补充一定数量的脂肪移植仍未系统地研究人类,补充相应体积的SVF恢复脂肪组织被广泛报道是安全的,并提供良好的临床结果(11- - - - - -16]。目前自动化系统SVF隔离是脂肪的体积限制,可以使用。全自动Celution[的最大处理能力20.)和组织起源细胞隔离系统(11)已报告360毫升和60毫升脂肪组织,分别。虽然多站更高的容量为400毫升的脂肪,这是一个手动系统。平均处理时间报告Celution、多站Cha-station, Lipokit范围从88到115分钟(20.),而组织起源细胞隔离系统据报道有一个较短的处理时间为65分钟;它的处理能力也低很多(11]。基于上面所提到的文献,本研究报告的设备可以处理更大的体积的脂肪比其他隔离系统的合理的时间框架内133分钟。这些因素,加上完整的自动化的优点,使设备非常可行的用于手术室和潜在的解决广泛的临床应用。
选择过滤器规格进行优化得到一个SVF产量、可行性,成分相当于使用传统的离心方法获得。三级连续过滤系统配备了一个机械搅拌装置的发展,其中的水相预滤器是到100年μm和35μ米尼龙过滤器和SVF最终恢复5μm PCTE过滤器。未消化的组织、细胞和组织总量和胶原纤维分离SVF在第一和第二阶段过滤。我们的研究结果表明,细胞碎片也分开SVF保留在第三滤波器。离心分离,另一方面,会导致沉积致密材料包括聚合物和纤维组织连同SVF细胞。因此,我们得出这样的结论:过滤系统采用有优势centrifugation-based方法获得SVF细胞从组织聚集和胶原纤维是免费的,这可能会带来并发症在注入SVF手术。
组成SVF自动化过程获得的发现包括CD34 + CD31−ASC, CD34 + CD31 +内皮祖细胞,CD34−CD31 +成熟的内皮细胞,和CD31−CD146 + pericytic细胞。不同细胞类型的相对百分比与手工centrifugation-based SVF孤立的方法。SVF孤立的功能的自动化过程证明了形成集落形成单位的能力(CFU-F)代表ASC SVF中包含的自我更新能力。基因表达分析证实存在内皮祖细胞CD31表达的,CD34, VE-cadherin和血管性血友病因子。生产的血管生成和凋亡生长因子也证实了VEGF的表达和IGF SVF。
5。结论
总之,我们已经成功地证明概念的自动隔离SVF使用原型设备和xeno-free隔离的过程。我们正在致力于开发一个β单位将进行有效性验证,不育,飞行员人体试验之前和安全要求。浓度的临床级SVF细胞没有使用离心机将提供一个紧凑的系统占用空间小,可以很容易地适应在临床设置。在像印度这样的国家和其他发展中国家缺乏基础设施和医生意识构成的巨大障碍SVF为基础的干预措施的采用和渗透在诊所,这样一个医疗点SVF设备可以提供相当大的效益和访问。
缩写
| 7-AAD: | 7-Aminoactinomycin D |
| ASC: | 脂肪提取干细胞/基质细胞 |
| 体重指数: | 身体质量指数 |
| CFU-F: | 克隆形成unit-fibroblasts |
| cGMP: | 现行良好生产规范 |
| DMEM: | 杜尔贝科修改鹰的媒介 |
| 电子商务: | 内皮细胞 |
| EPC: | 内皮祖细胞 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| FSC: | 向前散射 |
| HGF: | 肝细胞生长因子 |
| IGF: | 胰岛素样生长因子 |
| PCTE: | 聚碳酸酯跟踪腐蚀 |
| 加拿大皇家银行: | 红细胞 |
| rt - pcr: | 逆转录酶聚合酶链反应 |
| SSC: | 边撒 |
| SVF: | 间质血管分数 |
| VE-cadherin: | 血管内皮钙粘蛋白 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子 |
| vWF: | 血管性血友病因子。 |
利益冲突
所有作者声明没有潜在的利益冲突。
作者的贡献
Abhijeet德斯穆克和南希Priya贡献了同样的工作。
确认
作者衷心感谢y . n . Anantheshwar博士,b . c . Ashok博士博士Gunasekar Vuppalapati,博士Prashantha Kesari专家意见和咨询公司。作者承认并感谢马纳博士Gopal贡献装置设计,以及希先生Bylappa,先生Prajode Thiruvambattil,和Vasanth Kumar先生背后的工程团队设备。作者承认,谢谢Nutan博士和Sudip Biswas先生在研究过程中提供宝贵的援助。这个研究是完全由Stempeutics研究之中。
补充材料
补充表1:人工计数的准确性的验证SVF是由直接人工计数方法的比较与计算得到一个自动图像基于细胞计数器。两种方法之间的区别并不重要(p= 0.19,配对t检验)。
补充表2:蠕动泵的影响进行了研究,以确保泵的操作不会导致机械损伤组织和细胞。的产量和可行性SVF隔绝lipoaspirate组织通过蠕动泵的之前和之后被发现类似的(补充表2)。
补充图1:保留5μm过滤器上的细胞被染色和蓝色Toluidene可视化。代表图像的彩色过滤器图1中提供了补充。
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