间充质干细胞移植治疗食管腐蚀性损伤的实验研究

摘要

介绍。摄取腐蚀性物质可导致食管狭窄形成，作为一种晚期并发症。全层损伤可杀灭食管组织干细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)可以分化为特定的细胞谱系，并具有在损伤部位归巢的能力。目的和方法。本研究旨在探讨间充质干细胞移植预防大鼠腐蚀性食管损伤后食管损伤及狭窄形成的作用。54只大鼠分为4组;处死4只大鼠进行MSC生产。第1组，未经治疗的对照组(：10）。第2组，膜标记为MSCs治疗的大鼠（: 20)。第3组，氟脱氧葡萄糖标记间充质干细胞的正电子发射断层显像(PET)生物分布(：10）。第4组，假手术（：10）。产生标准的苛性碱食管烧伤，并在24小时后移植MSC。所有大鼠在第21天处死。结果。PET扫描显示MSCs向损伤部位的归巢行为。组织病理学损伤评分与对照组无显著差异。然而，我们发现Dil标记的上皮细胞和肌肉细胞来源于移植的间充质干细胞。结论。食管损伤后骨髓间充质干细胞移植可能是一种有益的治疗方法;然而，可能需要反复注射。

1.介绍

大多数在发展中国家，腐蚀性摄入仍然是不同年龄群体中的一个重要的医学问题，是儿科人群中发病率和死亡率的主要原因[1］．摄入是作为成年人的故意暴露而发生的，而孩子的暴露是偶然的。受苛性烧伤的组织的基本病理物理学反应是细胞外基质的沉积，合成和重塑，并且在食管壁上造成全厚度损伤后，正常食管组织被连接组织所取代[2，3.］．

目前，治疗腐蚀性食管烧伤损伤的目的是防止纤维化、狭窄形成和穿孔[4］．使用若干类型的非本地管理，例如类固醇注射，抗生素，食管扩张，支架应用和手术治疗方案进行治疗[2，4- - - - - -6];但是目前的治疗方法对于严重的腐蚀性烧伤是非常无效的。在实验模型中，发现维生素E、C、肝素、丝裂霉素、青霉胺、咖啡酸、表皮生长因子、干扰素g、鞘氨酰磷胆碱、苯乙酯、孕酮、雌二醇等药物均有不同程度的作用[7- - - - - -13.］．然而，它们尚未被应用于目前腐蚀性食管灼伤损伤的标准治疗方案。

间充质干细胞(MSCs)是多能干细胞的另一种来源。它们具有向中胚层细胞分化的能力，并且具有更广泛的分化潜能。类似性质的细胞存在于各种其他组织中，包括脂肪组织、外周血和脐带血、胎盘、羊水、胎儿组织、滑膜和乳牙，但骨髓间充质干细胞是迄今为止最具特征的[14.- - - - - -16.］．间充质干细胞也有能力在受伤部位安家[17.］．最近的研究表明，骨髓衍生的MSCs可能在受伤组织的修复过程中发挥重要作用[18.，19.］．Okamoto等人。据报道，骨髓衍生的细胞可以在人类中重新预期食道上皮细胞[20.］．他们还表明，骨髓来源的细胞是重新填充食管上皮的潜在来源，特别是在炎症和再生期间，提高了临床治疗以骨髓细胞再生人类食管上皮的可能性[20.］．ringdén等。据报道，MSC移植在同种异体造血干细胞移植后具有并发症的患者中的治疗组织毒性作用[21.］．此外，几组已经证明了MSCs分泌血管生成因子，例如血管内皮生长因子，肝细胞生长因子和白细胞介素-6两者的能力[22.，23.和在体内[24.］．

没有证据表明间充质干细胞对改善任何形式的食管损伤有任何作用。本实验研究的目的是探讨异体间充质干细胞静脉移植到腐蚀性食管炎大鼠模型的疗效。在此背景下，我们旨在评估它们对食管损伤部位的归巢行为，并提高粘膜愈合能力和逆转狭窄形成。

2。材料和方法

这项研究得到了土耳其安卡拉Gulhane军事医学院实验伦理委员会的批准。

２.１.学习小组

为了有90%的功率和5%的I型误差水平，以检测最小的临床显著差异50%，治疗组20只大鼠，每左组(假手术组、对照组等)10只大鼠加入研究。

该研究采用54种白果，男性，2个月大的Sprague-Dawley（SD）大鼠称重在250到300克之间。所有的大鼠都是从我们的动物研究中心获得的。将大鼠保存在实验动物生产笼中，在底部和侧面和顶部用塑料封闭，带有钢丝栅栏。室温保持在22℃。为了模拟昼夜节律，进行了12小时光和黑暗时期。通过专门用于实验动物生产的颗粒型制造饲料进给大鼠。处死四只大鼠，切除它们的胫骨和股骨。他们的骨髓被培养以获得MSCs。将剩余的50只动物随机分配到4组中。第1组（对照组），其中创造了腐蚀性食管烧伤但没有治疗（10只大鼠）。 Group 2 (MSCs-treated group), in which animals with caustic esophageal burns were transplanted, and membrane labelled allogeneic bone marrow derived 1 × 10⁶骨髓间充质干细胞。第21天处死，对20只大鼠食管标本进行组织病理学分析。第3组(PET成像跟踪MSCs)，干细胞用氟- d -葡萄糖(FDG)标记，移植后，通过正电子发射断层扫描跟踪MSCs 4小时，观察其早期归巢行为(10只大鼠)。4组(假手术组)，开腹，食道未损伤，未处理(10只)。

２.２.实验模型

在禁食12小时后，每只大鼠用盐酸甲苯嗪（15mg / kg）和氯胺酮（100mg / kg）麻醉地麻醉。使用Gehanno和Guedon描述的方法产生标准化的食管苛性烧伤损伤[25.］．涂抹无菌手术技术，制备中线剖腹手术术，并分离2厘米的腹部食管区段，并与位于2/0丝缝线的侧面和近侧捆扎。通过胃穿刺将24-F插管置于隔离的区段中。通过将20％NaOH溶液灌输3分钟，直至注意到食管壁的轻微半透明和血管的分支，然后吸出溶液。随后，使用蒸馏水来灌溉损伤的段60秒。在假手术组中，远端食管段仅滴加0.09％的NaCl溶液。剖腹术切口闭合，在每只动物中皮下给予10ml盐水。未来24小时不允许大鼠饲喂。在研究期间，所有动物都保存在相同的笼中，在研究期间提供食物和水。在21世纪术后一天，大鼠被斩首，收获远端1.5厘米食管段，用于组织病理学研究。 Specimens were placed in 10% buffered formaldehyde solution.

２.３.骨髓(BM)的制备和骨髓来源的大鼠间充质干细胞的生成

简而言之，通过斩波和骨髓（BM）用L-DMEM（Gibco Lab，Grand Island，NY）用来自股骨和胫骨的乳渣（Gibco Lab，Grand Island，Ny）进行了4种SD大鼠。然后通过以1000rpm离心15分钟通过离心沉淀BM细胞。使用18号针轻轻重新悬浮BM细胞并通过无菌尼龙网过滤。通过台盼蓝排除确定的可行性始终如一的> 95％。对于MSC生成，BM细胞以25厘米镀²聚苯乙烯瓶，L-DMEM中添加10%胎牛血清(FBS)， 37°C, 5% CO²条件(Gibco实验室，Grand Island, NY)。让细胞粘附72 h，然后去除非粘附细胞，每3至4天更换一次培养基。用胰蛋白酶-EDTA溶液- b (EDTA 0.05%， Trypsin 0.25%， Phenol Red, Biol)分离贴壁细胞。将MSCs扩增3-4倍，以达到体外和体内实验所需的细胞数量。MSCs在DMEM中重悬，最终浓度为1 × 10⁶细胞/ 1毫升。

２.４.msc的Dil标记

为了揭示受伤组织中移植的MSCs的信念，对于跟踪程序，细胞由1,1-二烯至二乙二醇-3,3,3,3,3,3,3,3-四甲基吲哚碳键（DII）标记;vybrant cm-dii细胞标记溶液（分子探针公司）。MSCs暂停在DMEM中，1×10⁶根据制造商的建议，用荧光DiI标记细胞[26.］．简单地说,5μ每毫升细胞悬浮液加入电池标记溶液。通过轻轻移液混合良好，将细胞在37°温育20分钟。然后将标记的悬浮管以1500rpm离心5分钟并除去上清液。在标记后，将MSC与培养基中的β-TCP一起温育。确认正DII染色，以及每个受体大鼠，1×10⁶将1ml血清中的细胞经受体大鼠尾静脉注射。

2．5．PET成像

用氟-d-葡萄糖（FDG）标记干细胞，其如前面描述的那些类似的方案[27.］．使用标准剂量校准仪(Capintec CRC 10, Capintec Inc.， Ramsey, NJ, USA)测量细胞样品中FDG的活性。细胞在温和的条件下在0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA (Biochrom, Berlin, Germany)中分离5分钟。细胞悬液800 g离心5分钟，取上清。细胞颗粒用磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬，800 g重离心5分钟。用于细胞计数，将洗过的颗粒用1ml PBS重悬;用显微镜观察10μl部分悬架。标签，1×10⁶将细胞与2-脱氧-2-(18F)氟-d -葡萄糖(FDG)以0.5 mCi/0.5 mL剂量混合在塑料γ管中，在37℃下本玛利培养45分钟。在孵育期结束时，去除含fdg的培养基，用PBS清洗MSCs两次，用0.3 mL生理盐水重悬。

用氯胺酮（15mg / kg）麻醉的动物（至少4小时禁食），和37-47mbq（1.0-1.3mci）和标记干细胞的FDG（1×10⁶细胞标记16×10⁶MBQ FDG / 300 μl）通过静脉内静脉注射。经过60分钟的分布后，大鼠经历了全身成像采集，包括3分钟的3分钟发射扫描，宠物CT摄像机中的传输扫描（GE Discovery 690，Wi，USA）的传输扫描少于10秒。用优化的参数重建图像。重复动物的FDG PET CT成像，以在口腔对比（2mL硫酸钡悬浮液）给药后1小时证明胃食管结。通过斩波方法处死动物;通过PET扫描仪切除胃食管切片并重新分析。

2.6。组织病理学评估

所有样本均由盲胃肠系统病理学家检测。10%福尔马林固定后，将食管切除标本交叉包埋石蜡块。5μm厚切片，然后用苏木精和伊红(HE)染色以进行一般组织学评估，用Masson三色染色以检测胶原沉积以评估纤维化。首先，采用自动显微镜成像系统(OlympusMicro DP-BSW Ver. 3.3, Olympus Co.， Japan)测量食管壁厚度(WT)和管腔直径(LD)，计算狭窄指数(SI)评价狭窄程度(SI = WT/LD)。其次，根据Guven等人描述的3个不同类别对组织损伤进行评分(见表)1）[28.］．

还通过Y-2EC滤波器（波长：540-580dm 595 BA 600-660），通过尼康Eclipse 80i显微镜检查标本，以便可视化差异化的DII标记的MCS。

2.7。统计分析

所有统计分析使用SPSS 15 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA) Windows统计软件进行。所有数据均以均数±标准差表示。三组间测量参数的差异采用Kruskal-Wallis检验。具有显著价值的组之间的双重比较用曼-惠特尼评估测试。差异被认为是显着的值小于0.05。

结果

对所有存活21天的大鼠进行评估。44只大鼠存活(6只死亡;MSC治疗组4例，对照组2例)。假手术组的所有动物在研究期间都存活了下来，而2只对照组和4只MSCs治疗的大鼠在随访期间发生食管烧伤后死亡。

3.1。宠物成像：FDG标记为MSC跟踪

当单独的FDG注入大鼠的尾静脉时（: 2)，中枢神经系统、四肢肌肉、肝脏、脾脏FDG摄取明显。由于FDG的生理排泄，在泌尿系统中也有显著的活性积累(图)1(一)）。另一方面，将标记的干细胞注射到大鼠的尾静脉后1小时（: 8)，在肺中检测到标记干细胞引起的显著活性(图1 (b)和1（c））。实际上，这种发现可以预期当静脉注射用TC-99M HMPAO的白色血细胞如白细胞如白细胞的标记细胞进行预期;肺中标记细胞的归巢是在第一小时获取的扫描上的通常发现[29.］．在受损食管的下部也有明显的活动(图)2(一)-2（C））。由于未结合的FDG，还注意到泌尿系统和中枢神经系统中的一点活动。单独使用FDG和FDG之间标记的干细胞之间的生物分布改变了揭示了标记过程的成功。

３．２．形态学和组织病理学评价

在研究结束时，假手术组大鼠的食道标本宏观上正常，没有粘附（：10）。相反，治疗MSCs的那些（：16）和对照动物'（: 10)显示相当大或完全的食管阻塞，严重粘连(可能由于穿孔)，食管腔内残留食物。MSC治疗组的SI值与对照组比较，差异无统计学意义。这一发现得到了组织病理学评价的支持。治疗组和对照组的SI明显高于假手术组(）。

3.3。DiI标记的MSCs在损伤部位的组织学追踪

第二组大鼠(: 16)苛性食管炎患者，经Dil标记MSCs治疗后，于伤后第21天处死。采用尼康蚀80i显微镜，Y-2EC滤光片(波长;例如:540-580 DM 595 BA 600-660)。我们注意到一些食管上皮(图3(一个)）和肌肉细胞（图3 (b)）对于源自BM衍生的MSCs的DIL呈积极染色。我们通过PET成像证明的MSC的归位行为导致对上皮和肌肉细胞进行分化。然而，分化细胞的数量远远差不多恢复原始架构。

4.讨论

摄入腐蚀性物质是一个严重的健康问题，发病率很高[1］．对食管的广泛损害可能导致纤维化和狭窄形成等严重问题[3.］．与许多器官一样，食道也有基质增生性“干细胞”，通过对小鼠和人类样本的一些照明性研究证实了这一点。上述细胞似乎主要位于食道基底膜[30.］．特别是碱性制剂对食管壁的破坏作用是众所周知的，它可造成食管全层损伤。食道干细胞在腐蚀性损伤期间的破坏和器官再生能力的丧失可以很容易地被断言为纤维化愈合过程，而不是在这种破坏后的更新。目前还没有有效的治疗腐蚀性食管炎的方法[2，3.］．食管损伤后狭窄形成大约发生在21天，并在28至42天完成[31.］．现在普遍认为，急性炎症反应造成伤害后的第一周，而第二周是成纤维细胞增殖和胶原形成的设置，这代表了狭窄形成的病理生理途径[32.，33.］．腐蚀性损伤的成功管理涉及迅速识别和早期治疗。

间充质干细胞是一种中胚层来源的多能干细胞，主要存在于结缔组织、器官中，在骨髓中尤其丰富。由于骨髓间充质干细胞具有多向分化和自我复制的特点，因此被认为是最有效的治疗应用。在特定的诱导条件下，骨髓来源的MSCs在体内或体外可分化为多种类型的组织，如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝脏、心肌、内皮细胞等[15.，16.，34.］．即使在多个过程之后也可以很好地保守骨髓导出的MSC的多种性能[35.- - - - - -38.］．In recent years, it has been reported that allogeneic MSCs appear to suppress graft versus host disease (GvHD) and Crohn’s disease as well as induce regenerative phenomena in the case of stroke, infarct, spinal cord injury, meniscus regeneration, tendinitis, acute renal failure, and heart disease in both human and animal models of disease [39.］．

迄今为止，没有与MSCs移植对任何形式的食管疾病的影响有关的研究。在该实验研究中，我们检查了MSCs移植治疗方式是否对腐蚀性食管损伤具有有益的影响。

更容易分化到专用细胞类型的干细胞可能已被用于这种实验程序，如从不同器官分离的多能基质细胞。例如，Musina等人。来自志愿者妇女的月经血液的孤立的mscs [40］．在同样的背景下，Hida等人证明这些相同的细胞非常有能力分化为心脏前体样细胞[41.］．源自子宫内膜的相同类型的细胞，其高分化容量对肌肉细胞，似乎是恢复食道壁的好候选者，并且可以在我们的实验治疗模型中寻求它们的功效。细胞源的另一种替代方案也可以是衍生自人胎盘和胎膜的干细胞，其中在没有任何侵入性手术的情况下获得的胎膜，并且体外膨胀电位显着高于BM衍生的MSCs [42.］．但是，我们选择了BM派生MSC，其具有众所周知的功能。

在整个实验过程中，我们只注入了一次MSC。然而，食道标本的病理调查结果远远远离恢复原始食道架构。在这里，我们认为合理的方法可能正在执行MSC的多次输注，以实现持续的再生。通过直接注射MSCs移植MSCs似乎是这项研究的可行方法。然而，经过20％的NaOH损伤后，受影响的食道壁部位非常脆弱，易于穿孔。因此，MSCs的直接植入可能导致穿孔和更高的动物死亡率。

研究结果表明，单剂量间充质干细胞移植并不能改善大鼠食管损伤;然而，用动物来预测人类对治疗方式的反应显然是一个有争议的问题[43.］．由于啮齿类动物的食道与人类的食道并不精确相似，人类组织对间充质干细胞移植的反应可能更令人满意。另一方面，本实验研究证明了经静脉注射的MSCs在循环中的第一步及其随后的归巢到食道损伤组织。组织病理学结果证实了移植间充质干细胞的归巢行为和分化特性。这些结果为临床应用作为一种治疗人类食道疾病的方式提供了证据。然而，需要对不同类型的干细胞进行时间进程和剂量依赖性研究，以确定损伤后的适当时间和剂量以及对其他器官和系统的影响。

利益冲突

所有作者宣布他们没有潜在的利益冲突。

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