文摘

没有信息的命运了间充质干细胞(msc)和辐射暴露后长期副作用。我们解决这些问题用人类msc (hMSCs)静脉注入nonobese糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠(NOD / SCID)提交给全身照射(TBI)或局部照射(腹部或腿照射)。动物们牺牲了3到120天后辐照和hMSCs的量化和空间分布研究了聚合酶链反应(PCR)。未照射动物注入后,hMSCs居住的地方不同的组织。移植取决于剂量的辐照和暴露面积。全身辐照诱导增加hMSC移植水平与未照射的小鼠相比,而当地射线增加hMSC嫁接在照射的面积。长期移植系统管理hMSCs NOD / SCID小鼠显著增加以应对组织损伤产生的局部或全身辐照直到两周然后慢慢减少取决于器官和辐照的配置。在所有情况下,没有观察到组织异常或异常hMSCs扩散辐照后120天。这个工作支持安全、高效使用msc的注入作为一种替代方法的短期和长期治疗放疗后严重的并发症病人耐火材料常规治疗。

1。介绍

多功能基质细胞,也叫间充质基质细胞或间充质干细胞(msc),已确定在骨髓多能祖细胞分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞(1,2]。在人类,使用msc被检测组织改造包括心血管修复,治疗肺纤维化,脊髓损伤和骨和软骨修复;审查[3,4]。关于radio-induced病变研究显示移植msc在受伤的网站(5- - - - - -7)和修复受损组织(8- - - - - -11),但没有一个评估长期MSC移植。msc biodistribution研究动物(12];然而,只有一个报告描述人类MSC (hMSC)移植。msc在大多数组织中发现的数量非常低,暂时的。低水平的msc供体DNA被发现在一些患者的骨髓(13,14]。•冯•巴尔等人研究了MSC输液患者尸体解剖和组织样本评估MSC移植并检查肿瘤的风险和/或异位组织的形成。15个病人中可用于PCR分析,长期移植msc似乎低由于接受者的免疫系统排斥或一个msc无法生存和嫁接后静脉输液。MSC注射不产生副作用(15]。最后,尽管成功的临床试验使用MSC,有一些数据关于长期移植MSC系统性注射后和副作用;移植的干细胞不能形成畸胎瘤或进行转换和他们不能促进肿瘤复发。

临床试验中使用msc意外照射(16),后期严重损害的辐照17,18),或放射治疗19,20.乳腺癌的允许组织再生当其他治疗失败21]。还有更多要考虑比辐射诱导细胞DNA损伤和长期的增长抑制暴露由P53和其他途径。P53激活细胞生长停止足够长的时间来修复DNA损伤。MSC治疗允许细胞继续修复组织在短期内(22]。这个“修复”的长期后果是未知的。允许细胞通过细胞周期进展与受损的DNA模板将导致严重的长期后果包括癌症诱导。在这份报告中,我们调查了hMSCs注入辐照后的长期影响。我们描述一个异种的实验移植模型,我们建立了评估的全部长期潜力hMSC移植静脉注射后,检查肿瘤的风险辐照组织和异位组织的形成。我们已经测试了在长期内照射后(120天)msc移植的配置取决于辐照和能否诱导任何异常,肿瘤组织,或不受控制的细胞增殖。

我们使用NOD / SCID小鼠在辐照组织评估hMSCs的移植。我们的结果表明,局部照射增加移植与直接相关的剂量辐照和修改hMSCs biodistribution的组织。我们观察到一个长期的移植的一些器官和没有副作用hMSCs在长期内辐照组织。我们相信,这些观察相关等临床情况全身辐照作为移植前调节方案,放疗治疗癌症,和意外照射,在促进使用MSC输液作为治疗方案的一部分辐射放射治疗后的副作用的治疗在短期和长期。

2。材料和方法

分离、纯化和hMSCs的扩张。骨髓细胞从髂骨吸入物获得健康志愿者知情同意后,按照批准的程序被用于人体实验和圣安东尼如前所述[医院伦理委员会6,7]。

注入hMSC点头/ SCID小鼠模型。所有实验和程序依法进行的实验动物保健和使用指南发布的美国国立卫生研究院(NIH出版物数字85 - 23,1996年修订),与欧洲指令(86/609 / CEE),符合法国农业部规定动物实验(参考87 - 847年,1987年10月19日,修改2001年5月),并经当地伦理委员会批准(P04-07)。NOD-LtSz-scid / scid小鼠(NOD / scid)从育种对最初购买杰克逊实验室(美国我巴尔港)在我们的无菌培育和维护单位在无菌microisolator的笼子里。134八周大雄性老鼠,分为4组,被用于这项研究。组1没有辐照之前收到2.5数百万hMSC静脉注射小鼠(10)。组2收到当地辐照后右边的腿从15到25灰色老鼠(28)。组3收到当地辐照剂量的腹部8.5灰色老鼠(36)。组4接受创伤性脑损伤的亚致死的剂量的3.5灰色老鼠(50)。射线进行如前所述[6]。组2、3、4收到hMSC静脉滴入,辐照后24小时。动物是牺牲了3到120天后辐照的定量和空间分布hMSC通过PCR和immunohistological分析进行了研究。外周血、骨髓(股骨)、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾、胃、肠、脑、右腿、四头肌、胫骨,皮肤被收集。收集第2通道hMSCs注入;可行性蓝色锥虫的利率是98%。

道的检测和定量分析hMSCs, DNA提取、PCR分析。人类细胞(hMSCs)在小鼠组织中检测到由弗朗索瓦等。如前所述的生物样本提交DNA提取、PCR分析来检测人类细胞在小鼠接受者的存在。从组织基因组DNA进行PCR分析准备使用QIAamp DNA迷你工具,试剂盒。放大的人类β球蛋白基因被用来量化人类DNA的数量在每个样本的老鼠组织DNA提取。内源性鼠标RAPSYN基因(Receptor-Associated突触蛋白)也放大,作为内部控制。绝对标准曲线生成的人类β球蛋白和鼠标RAPSYN基因。评价人类人类β球蛋白特异性扩增演示了使用10倍稀释100 ng和0.05 ng hMSC之间的DNA与老鼠的DNA,没有大,量化人类细胞在小鼠组织。一百毫微克的纯化的DNA来自各种组织放大使用TaqMan普遍PCR反应混合液(应用Biosytems)。引物和探针对人类β球蛋白正向引物5′GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA3′和反向引物5′CCTTGATACCAACCTGCCCAGG3′;探针进行荧光示踪记者和冷却器是5′FAM-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-TAMRA-3′。 The primers and probe for mouse RAPSYN gene were forward primer 5′ACCCACCCATCCTGCAAAT3′ and reverse primer 5′ACCTGTCCGTGCTGCAGAA3′; the probe labelled with fluorescent reporter and quencher was 5′FAM-CGGTGCCAGTGATGAGGTTGGTC-TAMRA-3′.

2.1。免疫组织化学

评估暴露于电离辐射引起的组织架构更改,我们进行了组织学研究PCR的所有器官收集和分析。

在每个取样之前,NOD / SCID小鼠的腹腔内注射麻醉350 Imlagen / Rompun解决方案(350μL)。直接由心脏内的血液被收集punction和灌注动物生理盐水去除血液的器官。每个器官分为两个部分:一个将孵化12小时在4%多聚甲醛溶液(组织学研究),另一部分将被存储在−1毫升RNAlater缓冲20°C (PCR分析)。

一半的每个组织用于PCR和免疫组织学。组织学研究样本在4%多聚甲醛固定为12个小时。

多聚甲醛固定后,器官与蒸馏水冲洗和脱水。组织切片在5μ米在一个旋转切片机(莱卡)。免疫组织化学染色的石蜡包埋标本,切片机部分deparaffinized在二甲苯和患者尽管乙醇浴和PBS 1 x。部分是动用PBS-triton (0.1 x)为了增加组织渗透。与蒸馏水冲洗后,部分与2%胰蛋白酶消化30分钟导致内源性生物素被屏蔽。多克隆抗体anti-beta-2-microglobulin(产品NCL-B2Mp Novocastra)添加的稀释1:50。负控制孵化与兔免疫球蛋白稀释1:100。绑定主要抗体进行了检测与生物素化的二次抗体。的生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白二级抗体稀释1:200年在PBS 1 x和孵化8分钟。免疫反应性都使用碱性磷酸酶反应表现基质检测设备30分钟。抗体检测我们使用Ventana工具包,然后通过对比染色hemalun 4分钟。 This procedure was performed using NexES special staining automation system to ensure reproducibility. On successive sections we carried out a hematoxylin-eosin-saffron (HES) staining of paraffined slides that was performed on all tissues collected at 3 and 15 days after TBI. For a global vision of morphology and tissue damage, the observation of HES-stained section (5 μ米)的脾活检已经意识到通过使用正常brightfield显微镜。每25μ米,一个部分是由他的染色。一般来说,5或7部分为每个动物的组织进行了分析。每个部分由显微镜观察到的全部用客观×20。电池损耗是由蓝色紫色染色质强度的降低。颜色的强度可以通过Histolab量化软件。每组脾脏(10)被显微镜收集和分析。所有HES-stained部分同时执行,以避免看到颜色强度的差异。染色质强度测量5随机领域/组织切片。

3所示。结果

hMSCs植入老鼠对人类组织的PCR检测β珠蛋白基因。人类DNA占移植。结果表示为老鼠的数量(或百分比)与一个hMSC植入的器官(PCR阳性人类的基因β球蛋白)的总数相比老鼠注射hMSCs。天0 hMSC biodistribution动力学对应于辐照的日子。hMSCs静脉注射后24小时内照射。控制(名为骗局)在于未照射小鼠注射hMSCs。

注入hMSCs存在的短时期内未照射NOD / SCID小鼠组织(表1)。进行了初步的实验来确定未照射动物器官hMSCs回家。人类细胞的植入率是决定在一系列未照射小鼠注射hMSCs(虚假的动物)。百分比代表积极的老鼠的比率为人类存在的一个器官β球蛋白在老鼠的数量分析。人类DNA (PCR分析)占hMSCs移植后未照射动物各组织注入。MSC移植的定性研究假老鼠表所示1。注射三天后,没有辐射,hMSCs从人类分离小鼠骨髓移植到小鼠骨髓(10 PCR阳性人类的基因β老鼠,10日球蛋白100%)。没有辐照、肺、脑、肝脏和脾脏似乎是优惠网站注入人体细胞的迁移。人类细胞被发现只有20%的动物的外周血进行了分析。

hMSC移植与辐照剂量(表2)。biodistribution调查在函数的局部照射剂量的辐照6周后的权利后在15到25 Gy腿。

hMSCs迁移优先出现在辐照区域的器官;他们的植入率似乎在这些器官剂量依赖性。例如,在骨的比例hMSC嫁接不同从15岁Gy的12.5% 38%,20 Gy最后100%的注射小鼠25 Gy。

这些人类细胞迁移在辐照区域以外的器官如肾脏。的网站和频率植入似乎存在剂量依赖的相关性。

配置的辐照修改长期Biodistribution hMSCs器官(表3,图1)。表3总结了水平hMSC移植后腹部照射。老鼠接受了局部照射腹部。腹部照射后60天,很少有老鼠人类DNA阳性。Biodistribution人类细胞的最大是15天。hMSC移植从辐照后3天可检测到至少60天。hMSC移植器官的变化从12%第三天(D3), 54% D15 D30 51%, 17%在60天。人类细胞的归航似乎增加每天15或30根据器官,然后随时间减少。腹部照射后,hMSCs似乎优先迁移进入肺部,肝脏,肾脏和脾脏。对于这些器官,50%以上的动物是阳性的存在人类基因在2和4周后辐照。注入人体细胞也征服了腹部肌肉,心脏、肝脏、胃、空肠,股四头肌、骨(股骨)和骨髓,但更温和。 For these organs, 35 to 50% of animals were positive for the presence of hMSCs. However very few hMSCs were engrafted in other parts of the intestine and the skin; for these organs less than 20% of the animals were positive for the presence of hMSCs.

腹部照射相比全身照射(TBI)修改hMSC嫁接在接触区域,即biodistribution。腹部照射hMSC移植来说从3增加到60天胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠和结肠中减少移植。相反,局部照射和创伤性脑损伤的修改hMSC在肺移植。

hMSC植入增加在第一个两周后全身照射(TBI)和持续一段长期在肺和肝脏(表4,图1)。hMSC植入(人类DNA)在肺部静脉注射后24小时检测人体细胞的肺。

第三天after-TBI, hMSCs本地化在心脏、肺、肝脏、肌肉(腹部),胃和小肠(十二指肠、空肠、结肠远端)。他们没有检测到骨髓,直到第七天。hMSCs隔绝骨髓似乎并没有优先殖民的组织起源在异基因的小鼠模型。

天7 after-TBI hMSCs似乎优先在肺(100%),脾、胃和心脏(75%)。hMSCs仍存在于肌肉(50%)和远端结肠(25%)。HMSCs开始灌输骨(25%)和骨髓(12.5%)。

15天是短期的biodistribution hMSCs最大(图2)。组织中人类的基因的数量β球蛋白出现在前两周,增加从14% 3天,7天,28% 15天的47%。肝脏的100%,75%,和50%的肾脏(参见数据本地化2 (c),2 (d),2 (e),2 (f))是人类DNA, PCR阳性。hMSCs植入所有器官除了远端结肠和回肠。观察一个hMSC循环在外周血(如图2 (c),2 (d),2 (e)),与组织的移植是最大的时候。hMSCs在外周血的存在可能是由于细胞的多种组织的传播。在15天,hMSCs植入到肌肉中检测出88%的股四头肌。在小肠,观察移植在十二指肠(33%),空肠(25%),和近端结肠(38%)。十二指肠和近端结肠肠hMSCs最殖民地的一部分。很少有皮肤和骨骼(股骨)分析被PCR阳性,分别为38%和12.5%,15天,。道组织本地化人类细胞中,我们使用一个人进行免疫实验beta-2-microglobulin特异性抗体。hMSC移植后14天,我们通过显微镜观察人类细胞被集成到功能组织结构如血管内皮系统(大)的不同器官(尤其是肝脏(图3(c)),大脑(图3(d))、肾(数字3(f)和3(g)))和组织功能单元,如肾小球(图3(e))。

与未照射的小鼠相比,我们发现优惠殖民的hMSCs似乎被辐射。图4表明定量移植辐照后15天。创伤性脑损伤前hMSC注入大脑移植的水平增加,炉,肝脏(图4(一)),但并不是所有的与未照射的小鼠相比,空肠(骗局,图4 (b))。照射在当地网站(腹部)增加hMSCs植入不仅在当地辐照(图4 (b)),但也在当地辐照领域以外的遥远的器官(脑、心脏、图4(一))。这表明动员诱导细胞因子和趋化因子引起的潜在的特定导航,所有发布的炎症。

在30天after-TBI hMSCs被发现在所有类型的组织除了十二指肠,回肠和皮肤。然而,hMSC biodistribution更重要比D30 D15 (47%) (34%)。D30之后,biodistribution hMSCs注入的减少。积极的血液分析PCR数量的增加在D30(57%),表明人类细胞移植后器官的再循环。hMSCs出席在小肠,在25%的空肠、回肠的25%,盲肠的38%,近端冒号的43%,和20%的远端冒号分析。hMSCs没有发现十二指肠和回肠分析。在长时间内,十二指肠不是最殖民的部分小肠msc。虽然肠组织的快速更新,msc似乎包含几个月注射后肠的所有其他部分。

hMSCs的植入是最佳的时间不同的器官从一个到另一个(图1)。的运动hMSCs外周血中最大的30天。对胃、十二指肠和脾脏,最高hMSC植入7天。对骨髓、肌肉、大脑、肾脏、肝脏、肺、心脏、空肠和盲肠,创伤性脑损伤后,最多hMSC移植小鼠对应于15天。对骨骼和皮肤,出现的最大hMSCs移植后60天到90年,分别。随时间减小的植入人体细胞似乎D30和D90之间。

hMSCs后被检测到至少120天注入人体细胞的器官。长期的创伤性脑损伤后,hMSCs优先留在肺(100%)、心(67%)、肾(67%)、肌肉(33%)、盲肠和结肠远端(33%),胃和骨髓(17%)。

hMSCs不要在辐照诱导组织异常组织长期注射后(表5)。三色染色他进行组织放疗后3天之间120年拍摄的。组织学研究D15凸显了辐照诱导细胞耗竭在脾(数字1(一)和1 (b))。120天后全身辐照、组织学观察的组织。没有观察到小鼠注射hMSCs异常。hMSCs似乎没有无政府主义的扩散或任何其他副作用在组织结构内移植后长期辐照小鼠(见表5)。hMSC注射后,移植的干细胞没有形成畸胎瘤或进行转换和没有促进肿瘤生长。组织学分析各种辐射诱导组织损伤进行收集的所有器官(心、肺、肝、肾、脾、胃、肠,肌肉和皮肤后股骨的右腿,和大脑)。长期执行组织学分析的不同部分小肠(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、近端、远端结肠)辐照后3天120显示肠道组织保留其完整性全身辐照后的早期。没有发现肿瘤组织(定义为肿瘤组织或不受控制的细胞增殖)。组织样本没有中断,组织所定义的不连续面(如断裂在肠上皮屏障)。我们没有观察到任何异常(如炎症病灶或细胞增殖异常)。此外,肠道绒毛的大小没有改变。没有组织损伤或结构变化被观察到其他器官,创伤性脑损伤后120天。当地的辐照后被观察到了类似的结果(数据没有显示)。

4所示。讨论

我们解决这个问题的潜在MSC输液治疗的影响及其潜在的副作用在辐照损伤的组织。我们调查了短期和长期biodistribution msc当注入静脉注射(IV)各种组织与辐照后的剂量。要回答这个问题,我们构建了一个临床前模型hMSCs注入NOD / SCID小鼠,没有以前的辐照和辐照后。辐照由当地辐射暴露在腿(15到25灰色)或腹部(8.5灰色)或全身照射(3.5灰色)。这些配置引起的损害暴露组织之前报道(6,7]。腹部照射引起的瞬态肠道损伤(9- - - - - -11)和腿部辐照诱导强烈的溃疡的皮肤和肌肉8]。评估局部照射诱导局部损伤的影响,一组受到照射的权利后腿和另一组受到照射的腹部。

在描述实验中辐照和hMSC输液后,大部分的植入人体细胞被发现在弱受损区域和移植的频率hMSCs辐照的剂量成正比。这个剂量依赖性的本地化hMSCs全身局部照射后建议hMSCs无限制的殖民和全球机构的存在辐射暴露后的反应增加移植相关剂量的照射。

MSC移植报道与先前的报道是一致的在辐射诱导multiorgan失败,缺血性脑损伤,心肌梗死和急性肾功能衰竭(12]。在一组不同的实验中,我们进行了在非人类灵长类动物模型提交给混合中子辐照和充满绿色荧光蛋白(GFP)标记非人灵长类动物msc,我们观察到msc道优先在再生组织(5]。NOD / SCID小鼠,如前所说,两周后照射相结合,hMSCs迁移到受损区域(6,7]。这些结果表明,msc可能参与目标组织的保存在辐照组织无副作用。我们以前公布的MSC移植在辐照组织改善他们的功能恢复7- - - - - -11]。

据我们所知,没有研究报道的发行量hMSCs外周血。我们检测到循环hMSCs穿过内皮细胞在外周血和墙壁在辐照后15 - 30天。的在活的有机体内归航的潜力hMSCs循环血液中受伤的网站/炎症可以由粘附hMSCs内皮。穿越内皮屏障的是另一个关键的步骤,组织循环迁移细胞(23]。

放射疗法用于治疗癌症的50%;5%至10%的患者发展为晚期并发症,改变生活质量(17]。传统的姑息疗法,不容忍,昂贵,缺乏有效性。细胞疗法的好处注射间充质干细胞治疗的盆腔疾病已经记录(17]。4日进行概念证明病人在放疗后不小心被过量辐射治疗患有慢性前列腺癌和fistulising结肠炎(18]。MSC注射可能会提供一个高效、安全、和耐受替代方法治疗盆腔放疗后严重的并发症对患者耐火材料常规治疗。然而理解机制成年体细胞干细胞调节肿瘤生长和msc辐照后的长期影响是至关重要的安全开发细胞疗法作为治疗手段治疗辐射伤害。我们报告没有hMSCs在辐照组织的长期副作用。自1995年首次报道试验,培养的msc已经使用125年注册(注册临床试验http://www.clinicaltrial.gov/)没有任何副作用报道细胞疗法治疗。临床数据支持msc的长期安全。此外细胞疗法治疗后病人的后续放疗后乳房(24)、膀胱或前列腺癌(25]从未透露在长期期间的副作用。有条不紊的临床试验研究msc的安全利用MEDLINE、EMBASE,和Cochrane中央登记的对照试验(2011年6月)。系统分析考试相关不良事件使用msc没有确定任何重大安全信号瞬态热。这份报告进一步支持安全的细胞疗法治疗辐射暴露的结果在健康组织(26]。

5。结论

这项工作,以及我们以前公布的研究msc、支持更大的使用hMSC输液意外照射后患者修复受损组织和治疗病人放疗的副作用的耐火材料常规治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Sabine弗朗索瓦、Benoit Usunier和阿兰教堂参与研究设计,进行了实验,进行数据分析,写论文。吕克·杜埃和马克Benderitter写道。

确认

作者感谢布鲁诺和Magali Leroy他们对外声称的有益的贡献。