文摘

细胞疗法与不明原因的卵巢功能和生育能力在某些癌症幸存者。建模这在老鼠身上的研究表明细胞移植生成donor-derived卵母细胞的放疗。本研究进行了进一步明确不同来源的细胞移植的影响对女性生殖功能使用临床化疗后小鼠模型。方法。雌性老鼠服用7.5毫克/公斤顺铂其次是细胞移植(一周后)使用GFP +女性细胞捐赠者。细胞跟踪、脂肪衍生干细胞GFP + (ADSC),女性生殖系干细胞GFP + / MVH + (FGSC),或卵巢细胞悬液GFP +小鼠移植到cisplatin-treated野生型。7、14天后动物被杀,组织学分析,IHQ GFP细胞,ELISA雌二醇进行。结果。组织学检查显示ADSC,卵巢细胞悬液,FGSC移植增加毛囊的数量明显的正常结构的细胞受体组安乐死在7天。细胞移植后跟踪显示GFP +样品7天。结论。这些数据表明,intraovarian注入ADSCs和FGSC与化疗所致小鼠卵巢衰竭减少顺铂引起的损害。

1。介绍

卵巢功能早衰是一种综合症,其特征是缺乏folliculogenesis和卵巢雌激素的生产、闭经和不孕女性40岁以下的(1]。综合症是代表在1%的绝经期女性2),0.1%的30岁以下的(3]。最灾难性的后果之一的癌症治疗的年轻女性是卵巢损伤,导致减少生育潜力(4]。不孕和年轻的成年女性更年期早期高层对病人的自尊和生活质量的影响。成体干细胞分化成几个已经引起了相当大的关注工具中胚层的血统包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、注意到,神经细胞,hematopoietic-supporting基质,因此可以部分替代受损细胞(5]。脂肪中提取干细胞的临床应用(ADSCs)治疗棘手的疾病或创伤性组织损伤引起了关注。另一种成体干细胞,命名为女性生殖系干细胞(音译),产生卵母细胞在体外和fertilization-competent鸡蛋在活的有机体内已被确认和孤立从成年小鼠卵巢和被测试在几个研究[6,7]。因此,本研究的目的是探讨intraovarian细胞注射的治疗效力卵巢功能和结构卵巢衰竭的动物模型。我们也调查ADSC的恢复效果,FGSC或卵巢功能的卵巢细胞悬液。

2。方法

2.1。动物模型

健康的C57Bl / 6雌性老鼠提供了从FEPPS(南里奥格兰德基金会的生产和健康研究)和研究中使用。动物之间7和8周。C57Bl / 6野生型被用作接受者和C57Bl / 6 GFP +老鼠作为供体细胞。卵巢衰竭引起的八周大C57Bl / 6作为接受者的腹腔内注射顺铂(7.5毫克/公斤在磷酸缓冲盐(PBS))。控制注入了PBS。所有程序涉及动物机构批准的动物保健和使用委员会医院丹尼·德·阿雷格里港和按照指南进行护理和使用实验动物(8]。

2.2。制备卵巢组织进行分析

卵巢缓冲福尔马林固定在10%和加工准备石蜡块,和串行部分得到了5毫米和染色)。免疫组织化学染色GFP细胞跟踪执行。

2.3。隔离和表征的脂肪干细胞(ADSCs)

ADSCs被隔绝C57Bl / 6 GFP +小鼠腹部脂肪组织。脂肪组织收集在胶原酶降解酶解决方案(1毫克/毫升)和获得的细胞悬液离心和resuspended胎牛血清DMEM antibiotic-antimycotic为1%和20%。细胞被镀在文化和维护37°C公司为5%2。孤立的细胞发达可见系统的殖民地纤维母细胞附着在初始镀后大约7 - 10天9]。ADSC分化能力使用特定的协议进行诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞(10和流式细胞术检测进行CD29, CD11b, CD34标记。

2.4。隔离的女性生殖系干细胞(音译)

12到16个卵巢收集每个实验。再被孤立使用先前描述的两步酶消化法(7,11]。简要分析卵巢被安置在PBS溶液没有钙或镁和含胶原酶(1毫克/毫升,IV型;Gibco Aukland,新西兰),然后在37°C的环境与温和搅拌15分钟。卵巢组织在PBS洗2到4次,放置在0.05%胰蛋白酶EDTA,孵化在37°C 10分钟。当大部分的细胞被分散,胰蛋白酶中和通过添加细胞培养基补充10%胎牛血清的边后卫。暂停在300 g离心5分钟,上层清液小心地从颗粒中删除。颗粒resuspended,经过70年μm细胞尼龙过滤器。这些细胞丰富再被immunomagnetic隔离MVH +细胞的准备6,7]。的山羊anti-rabbit免疫球蛋白微(Miltenyi研究)与兔多克隆抗体MVH预镀(Abcam)。MVH +细胞被磁选选,根据制造商的指示。

2.5。卵巢细胞悬液

在8 - 12卵巢收集每个实验。卵巢组织分解使用先前描述的两步酶消化法(7,11]。暂停在300 g离心5分钟,上层清液小心地从颗粒中删除。颗粒是resuspended和细胞团是避免通过70年通过暂停μm细胞尼龙过滤器。

2.6。麻醉和手术

与异氟烷麻醉诱导和维持蒸发氧气由一个面具。盐酸曲马多的镇痛与术前用药法进行单剂量(10 mg·公斤−1)肌内(IM)。动物被放置在左侧侧卧位。三分法和防腐(葡萄糖酸氯已定2%)进行的右翼最后一根肋骨到骨盆。我们开始皮肤切口大约0.5厘米尾最后一根肋骨。腹部的方法是由飞机直到腹腔。右卵巢位于,并使用微妙的手术材料相接触。曝光后,卵巢被暂停其胶囊,包含1×10的单个细胞悬液4细胞注射(5μL)。使用30 G牙龈细胞注射了针连接到显微镜下注射装置(见图1在手术显微镜。我们重新定位后卵巢,然后关闭肌肉组织。之后,程序动物一直在观察孵化器与氧气供应从麻醉和加热,直到完全恢复。


图1
示意图:显微镜下注射装置。
2.7。雌二醇水平

血液样本收集从retroorbital丛在安乐死的过程。血清是由离心分离和储存在−80°C。血清雌二醇(E2)水平测定,酶联免疫吸附试验(ELISA) (Uscn生命科学公司,休斯顿,德克萨斯州,欧洲大学协会)。

2.8。实验设计

48雌性小鼠C57Bl / 6野生型被分成8组( )和执行安乐死在7或细胞移植后14天:ADSC 7、14天(A7,阿),FGSC 7、14天(F7, F14),卵巢暂停7、14天(O7 O14)和控制7、14天(C7、C14)。一周后卵巢衰竭引起的腹腔内注射顺铂(7.5毫克/公斤)动物intraovarian注射5μ包含1×10 L体积4ADSC, FGSC、卵巢细胞悬液或PBS(对照组)。

2.9。统计分析

我们进行逻辑回归得出的概率的估计可行的卵巢的卵泡在这些部分。

3所示。结果

3.1。动物模型

为了验证卵巢的卵泡损耗我们进行组织学分析。H&E-stained部分卵巢显示较低的可行的毛囊数量放疗卵巢(图4(一))

3.2。隔离和表征细胞

ADSC的细胞群的文化特点是其粘性和成形状和显示能力在体外分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞(图2)。细胞被评估为表达CD29, CD34, CB11b流式细胞分析仪。大多数的细胞为阴性CD34和CD11b CD29阳性(图3)。

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图2
(一)显微数字化显微照片ADSC GFP +阳性细胞文化40 x。(b)脂肪细胞的分化油红染色20 x。(c)骨细胞分化茜素红染色40 x。(d)软骨细胞分化阿尔新蓝染色40 x。
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图3
流式细胞术测定细胞染色,msc细胞表面抗原标记:(a) CD29 + (b), CD11b−,和(c) CD34−。
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(a)的概率可行的细胞组织安乐死在7天。(b)的概率在14天可行的细胞组织实施安乐死。
3.3。组织学分析

FGSC ADSC,卵巢细胞悬液组安乐死在移植后7天来控制相比有一个显著的改善。有更高的概率毛囊FGSC组可行的细胞(71%)紧随其后的是操作系统(48%)和ADSC(43%)(数据4和5)。我们还观察到一个更好的复苏趋势组FGSC相比其他组移植后14天,尽管这种差异没有统计学意义(数字4和6)。没有所有组之间血清雌二醇水平的差异(数据没有显示)。

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图5
显微照片)从组织学染色卵巢部分:实验在7天组安乐死。(一)控制40 x, (b)卵巢暂停移植100 x, (c) ADSC移植100 x,和(d) FGSC移植40 x。
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显微照片)从组织学染色卵巢部分:实验在14天组安乐死。(一)控制40 x, (b)卵巢暂停移植200 x, (c) ADSC移植200 x,和(d) FGSC移植100 x。

4所示。讨论

干细胞卵巢再生策略和卵母细胞生产已经被提议作为未来临床疗法治疗女性不孕7,12]。msc对自己兴趣可能使用细胞和基因疗法,因为他们的自我更新能力和分化[multipotentiality13]。

我们的研究结果表明,移植的干细胞可以促进更好的复苏的可行的卵母细胞在组织接受ADSC和操作系统与对照组相比。我们认为,这两种细胞类型,ADSC和操作系统,也有类似的结果基础上的理论假定达席尔瓦梅里莱等人于2006年(14]声称间充质干细胞存在于产后的所有器官和组织血管周的利基。因此我们认为卵巢悬浮细胞有相同的凋亡,免疫调节,chemoattraction,血管生成特征ADSC具有相关血管周的位置被Meirelles et al。15]。

这背后的机制之一是旁分泌介质由MSC分泌可能参与修复通过阻止细胞凋亡和促进功能恢复(16]。然而,目前信息几乎没有关于MSC对化疗所致卵巢损伤的治疗潜力。在这项研究中我们已经证明了ADSC intraovarian移植改善卵巢功能,表明这个过程可能在卵巢衰竭患者是有用的。这些结果符合Abbasy et al。(2010)17和Abd-Allah et al . (2013)12因为他们认为MSC移植可以改善卵巢功能激素卵泡发展能力在大鼠卵巢衰竭。

傅et al . 200818),用骨髓衍生干细胞,证明了MSC分泌细胞因子在体外,包括VEGF、igf - 1和HGF,抑制化疗所致的细胞凋亡GC在体外通过上调bcl - 2蛋白和细胞因子,在化疗所致卵巢损伤的大鼠模型,MSC移植减少细胞凋亡,改善卵巢功能。

Takehara et al . 201319调查恢复对卵巢功能的影响和脂肪中提取干细胞的安全性(ADSCs)。ADSCs被证明能够诱导血管再生和恢复卵巢的卵泡和语料库lutea数量。此外,Y染色体的本地化使用荧光原位杂交的方法,研究了注入雄性ADSC卵巢;因此,Y染色体在毛囊局部不但是在膜的层。相同的方式Takehara et al ., 2013免疫组织化学测定GFP细胞跟踪,在我们的研究中,发现了GFP阳性细胞分布在膜的层区域(图7(一)),这表明ADSC移植到卵巢可能不会直接分化成卵母细胞和颗粒细胞但可能在间质中生存,发挥重要的附属角色在卵巢卵母细胞周围的微环境。

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图7
IHQ GFP细胞跟踪。(一)GFP细胞在卵巢移植后7天。(b)消极的控制。(c)积极控制。

这些发现表明,msc在恢复受损的卵巢功能可能有作用,可以用作再生医学。尽管ADSC移植已显示出改善可行的毛囊,在这项研究中,FGSC移植显示更好的结果在7和14天的安乐死。尽管有限的概念和不可再生的生殖细胞被认为是一个基本前提的生殖生理学150多年(19],Johnson et al . 2004 [6,20.]提出的证据提出修订这个范例,显示的迹象卵子发生和folliculogenesis产后时期,由于干细胞特征,生成细胞的其他组织的能力。

这种潜在的干细胞可塑性似乎倾向于假设neo-oogenesis / folliculogenesis制定Johnson et al。6]。这些作者展示了特定蛋白质的减数分裂的存在在成年小鼠卵巢,这只会发生在胎儿阶段,根据当前的概念。在相同的研究中,作者提到闭锁的毛囊的减少表明女性性腺活动明显的血流动力学,提出一个更动态的移动交通卵巢。这些发现和结论的对比先前的领域概念导致了相当大的怀疑科学和医学社区的一些成员(2,21- - - - - -23]。尽管如此,随后迅速越来越多的研究证实,成年小鼠的卵巢包含一个罕见的人口mitotically活跃的生殖细胞,可以分离和传播文化数月,产生卵母细胞在体外和移植受体小鼠的卵巢在活的有机体内(24- - - - - -26]。在我们的研究中我们也孤立生殖细胞,immunomagnetic分离,移植卵巢。我们的结果是一致的几个研究使用这些干细胞类型和显示,folliculogenesis更好的结果(26,27]。虽然我们的分析集中在卵泡可行性的评估,我们可以推测,MVH治疗组细胞表现出更好的结果相比,团体ADSC的能力和操作系统,因为folliculogenesis MVH在上面提到的研究证明。而不是Abd-Allah et al . 201312我们发现血清雌二醇水平无统计学差异。我们认为这种差异的使用不同的动物模型和不同的分析时间。

除了在人类生殖生物学开设一个新的研究领域,这是不可思议的不到十年前,明确证据存在的这些细胞在女性可能会提供新的机会来提高目前的生育率保护策略。例如,辅助生殖技术涉及低温贮藏的卵巢皮质组织已经发展为女性癌症患者(28,29日]隔离和扩张FGSC从这个组织,低温贮藏,之前或之后可能会对新的生育能力的应用程序很有用。此外,一个详细的协议的可用性净化这些新发现的细胞从人类卵巢组织为我们提供了一个更加生理有关在体外模型系统研究人类女性生殖细胞发展而不是胚胎干细胞目前用作人类雌配子发育模型(30.,31日]。

5。结论

我们的发现在这个研究表明卵巢机能障碍的潜在疗效intraovarian注入adc和FGSC。和这些细胞的移植可能在恢复受损的卵巢组织由顺铂诱导。

此外,获得的结果与FGSC专门治疗建议卵巢干细胞是一个候选人对未来卵巢修复失败,因为它提供了一个更好的临床结果,可能考虑一个承诺与卵巢干细胞微环境提供一个更高的能力,特别是增强卵巢组织修复。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢FIPE / HCPA, FAPERGS, Pronex支持这项工作。