文摘

本研究调查了鼠标的交互骨髓间充质干细胞(MSC)与心脏HL-1细胞在coculture荧光染料标记流式细胞术。MSC被分层到支流HL-1细胞培养在1:4比例。MSC获得缝隙连接浸透的钙黄绿素HL-1细胞后4小时部分降低油酸酰胺。20小时后,MSC获得钙黄绿素99%,油酸酰胺的影响。双标记HL-1细胞钙黄绿素和膜染料戴奥导致钙黄绿素和戴奥MSC。当HL-1细胞是用钙黄绿素标记和MSC与戴奥,MSC获得钙黄绿素而HL-1细胞获得戴奥。很少观察融合自90%以上本来就积极MSC获得HL-1戴奥细胞虽然不到9%获得缝隙连接impermeant CMFDA 20小时后没有本来就转移到HL-1细胞。与时间有关的转移膜做的是观察从HL-1细胞MSC(100%),反之亦然(50%)与有限转让CMFDA 20小时后。这些结果说明MSC和HL-1细胞交换膜组件可能会占一些MSC的有益作用在心肌梗死后的心脏。

1。介绍

我们曾表明,注入小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)防止发生的损失函数,在老鼠心脏冠状动脉阻塞(1]。这种保护作用的机制尚不清楚,因为没有减少心室疤痕或心肌细胞分化的证据综合MSC。我们最近发现,MSC分泌各种细胞因子对血管生成有重要影响,细胞凋亡,细胞迁移2)支持的假设MSC保护心脏,至少在某种程度上,通过分泌分泌因素(3]。

心室细胞表现出广泛的缝隙连接形成(4)提供电耦合和小分子细胞之间的转移(< 1 kD) [5,6]。MSC表达连接素和能够形成与心脏心室细胞缝隙连接(7)和HL-1心脏细胞(8]。因此,缝隙连接可能会提供一个管道的心血管效应MSC在心脏8,9]。

此外,细胞能够交流的交换细胞质和膜组件通过隧道的形成纳米管(10)或细胞外囊泡(11]。纳米管是50 - 200 nm直径膜通道包含f -肌动蛋白形成胞质细胞之间的连接(12]。细胞外囊泡是异构的,包括液、微泡,外皮层和细胞大小不等的起源(13,14]。除了细胞因子的分泌,纳米管和囊泡可能发挥重要作用在MSC的心脏保护作用[15- - - - - -19]。

在目前的研究中,我们研究了MSC的交互与心脏coculture HL-1细胞系统。虽然我们正在寻找小细胞质的转移通过缝隙连接组件,我们发现重要的转移膜组件。

2。方法

2.1。MSC和HL-1细胞培养

小鼠骨髓间充质干细胞(MSC);段落20 - 25)在10厘米培养板1.0×106细胞/板如前所述[1在完成鼠标Mesencult媒体(基底媒体+刺激补充;干细胞技术)直到汇合的。细胞荧光标记和随后解除与0.25% trypsin-EDTA coculture HL-1细胞。

心脏HL-1细胞被厕所Claycomb慷慨地提供和培养根据以前公布的规范(20.]。细胞培养在6-well盘子涂以0.02%明胶+ 0.05%纤连蛋白0.8×106在完整细胞/ Claycomb媒体(Claycomb媒体(σ)+ 10%的边后卫+ 0.1毫米去甲肾上腺素+ 2毫米谷氨酰胺+ 100 U /毫升青霉素+ 100μg / mL链霉素),直到细胞汇合的。细胞荧光标记后coculture MSC。

MSC或HL-1层coculture之前被贴上不同的荧光染料。在PBS去除血清细胞被洗了2次,然后孵化与染料在DMEM (MSC)或Claycomb基础媒体(HL-1)不含血清或其他添加剂。在PBS染料标记后,细胞被洗。2.5细胞随后被贴上μ的细胞质缝隙连接浸透的钙黄绿素红橙色点(细胞跟踪;分子探针/表达载体,C34851) 1小时,5μ的细胞质缝隙连接impermeant chloromethyl荧光素二乙酸(细胞追踪绿色CMFDA;分子探针/表达载体,C7025) 1小时(30分钟后与媒体替代),或5μ膜的M标签carbocyanine染料戴奥还是(充满活力的细胞标签解决方案;分子探针/表达载体,v - 22886, - 22887) 1小时。此外,在一些实验MSC在悬挂标签与anti-mouse-Sca1-PEcy5 (eBiosciences, 15 - 5981) 1小时和洗PBS + 0.25% BSA + 2毫米EDTA之前使用。控制孵化用鼠标控制同形像。

标签后,MSC和HL-1细胞cocultured 4到20个小时。MSC在完成resuspended Claycomb媒体和0.25×106MSC被分层到支流HL-1文化(1.0 - -1.5×106HL-1细胞/)6-well盘子。在PBS coculture后,细胞被洗,解除与0.25% trypsin-EDTA,离心机,resuspended 3毫升PBS / BSA / EDTA,通过100μ100年M过滤、离心和resuspendedμL PBS / BSA / EDTA通过流式细胞术分析。流式细胞术在UIC执行研究资源中心,流式细胞术服务,使用BD LSRFortessa细胞分析仪。数据分析使用峰会4.3软件。所有coculture实验复制至少4倍和标记细胞的百分比决定意味着±s.e.m。意义是利用学生的评估 以及。

2.2。H9c2细胞刮加载

心脏成肌细胞H9c2(写明ATCC号码crl - 1446)培养细胞纤连蛋白/明胶涂层6-well盘子0.3×106细胞在DMEM / + 10%的边后卫72小时50的存在与否μ油酸酰胺。融合性的文化被刮满载着路西法黄色或dextran-Rhodamine B (6]。具体来说,井与calcium-free PBS洗两次,然后0.05%路西法黄色二钾盐(σ)或0.1% dextran-Rhodamine B(10000兆瓦;英杰公司)calcium-free PBS是补充道。后刮一行29日计针和孵化7分钟,文化洗了三次在PBS + 1.5毫米Ca+ +并使用一个倒置荧光显微镜观察。

3所示。结果

3.1。检测缝隙连接

为了研究MSC和HL-1细胞间的缝隙连接的形成,支流文化HL-1细胞双标记的胞质缝隙连接impermeant染料CMFDA和缝隙连接浸透的染料钙黄绿素红橙色(图1)。无标号MSC被分层的融合性的标记HL-1细胞1:4模拟低数量的比例比使用时内源性细胞移植MSC在活的有机体内。流式细胞术分析后4小时coculture证明 %的MSC获得钙黄绿素虽然没有CMFDA转移(数字1(一)- - - - - -1 (c))。治疗与50 MSCμ油酸酰胺,缝隙连接阻断剂(21,22),10分钟coculture期间及之前的数量明显减少钙黄绿素转移 %,这表明至少有一部分钙黄绿素的转移是由于缝隙连接的形成。Coculture 20小时导致钙黄绿素的转移 %的MSC(数字1 (d)- - - - - -1 (f));有趣的是,油酸酰胺治疗20小时后没有效果,表明缝隙连接没有参与钙黄绿素20小时后转移。

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图1
流式细胞术的标记MSC和CMFDA /钙黄绿素标记HL-1细胞coculture 4和20个小时后。coculture (a - c)四个小时。(d-f) coculture 20小时。(a)和(d)无标号MSC coculture之前(M)。(b)和(e) HL-1细胞(H)双coculture之前用CMFDA和钙黄绿素标记。(c)和(f)标记MSC和CMFDA /钙黄绿素标记coculture后HL-1细胞。

由于油酸酰胺没有完全阻止钙黄绿素转移,我们想确认50μM油酸酰胺足以阻止缝隙连接。心脏H9c2细胞,形成功能缝隙连接(23的存在与否),培养50μM油酸酰胺,然后刮满载着路西法黄色融合。在缺乏油酸酰胺,路西法黄色被远离刮(图10 - 30个细胞层2(一个))。在油酸酰胺,路西法黄色只是转移从刮(图1 - 2细胞层2 (b))。刮加载与缝隙连接impermeant dextran-Rhodamine B展示了缺乏染料转移到任何细胞层远离刮(图2 (c))。这些结果表明,50μM油酸酰胺足以阻止缝隙连接。

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图2
刮加载H9c2细胞。(一)刮加载与路西法黄色没有油酸酰胺。(b)刮加载与路西法黄色油酸酰胺的存在。(c)刮加载dextran-Rhodamine B没有油酸酰胺。箭头:边缘刮伤。

在不同的实验中,支流文化HL-1细胞双贴上膜染料戴奥和钙黄绿素,然后标记MSC被上面一层1:之前和cocultured 4比4小时。流式细胞术之后,一个完全不同的观察(图模式3)。不仅有荧光的MSC人口的转变表示之前获得的钙黄绿素还MSC人口似乎获得戴奥暗示转移膜。

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图3
流式细胞术的标记MSC和戴奥/钙黄绿素标记HL-1细胞coculture 4小时后。(一)无标号MSC coculture之前(M)。(b) HL-1细胞(H)双coculture之前用戴奥和钙黄绿素标记。(c)标记MSC和戴奥/钙黄绿素标记HL-1细胞coculture 4小时后。

为了进一步评估增加的现象在戴奥,支流文化HL-1细胞用钙黄绿素标记而MSC与戴奥标记。MSC被分层到HL-1细胞1:4比和cocultured(图4和20个小时4)。4小时后的一些从HL-1 MSC获得钙黄绿素细胞(图4(c - 4))。然而,20小时后(图4(c-20)),所有的MSC获得从HL-1细胞胞质钙黄绿素,虽然有些HL-1细胞也获得膜戴奥MSC。

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图4
流式细胞术的戴奥标记MSC和钙黄绿素标记HL-1细胞coculture 4和20个小时后。(一)HL-1细胞(H) coculture之前用钙黄绿素标记。(b) MSC (M)贴上coculture之前戴奥。(c - 4)戴奥贴上MSC和钙黄绿素标记HL-1细胞coculture 4小时后。(c-20)戴奥贴上MSC和钙黄绿素标记HL-1 coculture 20小时后细胞。

我们从这些实验得出结论,缝隙连接可以解释一些钙黄绿素的转移。然而,数据表明,另一个机制也负责因为油酸酰胺无法完全阻止钙黄绿素转移后4小时,20小时后是无效的。此外,膜组件(戴奥)4和20小时后被转移。

3.2。测试与HL-1细胞融合MSC

我们推断MSC与HL-1融合细胞,造成膜组件之间的转移MSC和HL-1细胞。为了测试这一假说,MSC与干细胞膜贴上标记使用anti-Sca1-PEcy5 Sca1。HL-1细胞被贴上膜戴奥或细胞质CMFDA。MSC被分层HL-1文化融合上1:4比,cocultured 20小时,通过流式细胞仪分析(图5)。我们推断,如果发生融合,然后戴奥和CMFDA将被转移到MSC与Sca1标记。然而,如果没有发生融合,胞质CMFDA仍将局限于HL-1细胞。如图5(一个),76%的MSC Sca1是积极的。Coculture与戴奥HL-1标记细胞 %的转移膜戴奥Sca1积极的MSC(图5 (b)戴奥;图5 (c)戴奥)。Coculture CMFDA贴上HL-1细胞只显示 % Sca1积极MSC的细胞质CMFDA(图5 (b)CMFDA;图5 (c)CMFDA)。没有明显的转移Sca1 HL-1细胞。

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图5
流式细胞术Sca1-PEcy5贴上MSC和戴奥或CMFDA标记HL-1 coculture 20小时后细胞。(一)MSC (M)贴上Sca1-PEcy5 coculture之前。(b)戴奥:HL-1细胞(H)贴上coculture之前戴奥。(c)戴奥:Sca1-PEcy5贴上MSC和戴奥标记HL-1 coculture 20小时后细胞。(b) CMFDA: HL-1细胞(H)贴上CMFDA coculture之前。(c) CMFDA: Sca1-PEcy5贴上MSC和CMFDA标记HL-1 coculture 20小时后细胞。

这些结果表明,可能会有少量的融合MSC HL-1细胞由于细胞质的有限的转移;然而,有一个大的转移膜组件HL-1细胞MSC。

3.3。测试膜MSC和HL-1细胞之间的转移

确定课程的时间和数量的膜转移,MSC被分层到支流文化HL-1细胞1:4比标签后的不同组合膜和细胞质CMFDA所做的那样。在一组MSC双贴上膜和细胞质CMFDA HL-1细胞被标记了。在第二组,HL-1细胞双标记而MSC标记(图6)。因为我们的目标是监控膜转移,CMFDA用于标签细胞质是因为细胞质钙黄绿素容易转移细胞之间。细胞被cocultured 4和20个小时。

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图6
流式细胞术的/ CMFDA贴上MSC和无标号HL-1细胞或标记MSC和做/ CMFDA标记HL-1 coculture 20小时后细胞。(一)MSC (M)贴上和CMFDA coculture之前所做的那样。(b)无标号HL-1细胞coculture之前(H)。(c) / CMFDA贴上MSC和无标号HL-1 coculture 20小时后细胞。(d)无标号MSC coculture之前(M)。(e) HL-1细胞(H)贴上了CMFDA coculture之前。(f)无标号MSC, / CMFDA HL-1 coculture 20小时后细胞。

当MSC双标记,与无标号HL-1细胞coculture 20小时(数字6(一)- - - - - -6 (c),图7)表明, % HL-1细胞的膜MSC的;没有检测到的细胞质CMFDA MSC转移到HL-1细胞。4小时后(图7)只 %标记HL-1获得膜做双重标记MSC;同样,这些细胞没有接任何细胞质CMFDA。

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图7
细胞百分比获得膜或4和20小时后细胞质coculture MSC和HL-1细胞。MSC和HL-1细胞标记、培养和分析如图6。数据计算平均百分比±s.e.m.获得的细胞细胞质膜(标签)或(CMFDA标签)在coculture由流式细胞术。MSC→HL-1 =从MSC HL-1细胞转移(开放酒吧)。HL-1→MSC = HL-1细胞转移到MSC(固体酒吧)。

当MSC标记和HL-1细胞双标记,coculture 20小时(数字6 (d)- - - - - -6 (f),图7)表明,100%的MSC获得膜从HL-1细胞。此外, %的MSC获得细胞质CMFDA HL-1细胞。4小时后(图7), %标记MSC获得双膜做标记HL-1细胞; %的MSC细胞质CMFDA。

4所示。讨论

这项研究首次清楚地显示,MSC和HL-1细胞交换膜组件cocultured时时间的方式。我们发现100%的MSC获得膜HL-1细胞20小时后,48%的HL-1细胞获得MSC的膜。这个小数量的膜组件转移到HL-1细胞是符合我们的实验设计,因为减少了80% MSC比HL-1细胞导致较低的概率MSC与HL-1交换膜细胞。有趣的是,尽管膜脂质染料戴奥和细胞间转移,Sca1膜蛋白不转移从MSC HL-1细胞。一个合理的解释这个发现是一个选择性的转移膜组件(13MSC和HL-1细胞之间)。很可能由于交换膜是MSC和HL-1细胞之间的密切接触期间coculture MSC以来之上支流HL-1细胞。可能的细胞机制可以解释这个交换包括隧道纳米管之间看到MSC和心肌细胞24液的交换或微泡,与MSC的以前的报告一致,细胞核pulposis细胞coculture [25]。

本研究也表明MSC和HL-1细胞间的缝隙连接的形成在coculture的早期阶段。4小时后的一些钙黄绿素染料转移油酸酰胺敏感。这是符合Mureli和同事的工作8)发现,MSC开始形成缝隙连接在20分钟内cocultured HL-1细胞时,46%形成连接后4小时和24小时后的60%。在我们的研究中100%的MSC被发现从HL-1获得钙黄绿素细胞20小时后,转会油酸酰胺不敏感。这表明,钙黄绿素转移最初是由于,在某种程度上,缝隙连接,但后来通过备用手段发生最有可能与观察到的膜转移。

我们发现大约有10%的MSC获得了缝隙连接impermeant染料CMFDA HL-1细胞表明低水平的MSC和HL-1细胞之间的融合。虽然我们没有检测CMFDA MSC HL-1细胞转移,这最有可能是由于低数量的MSC相比HL-1细胞。是否MSC与居民的融合细胞占观察MSC分化转化为心肌细胞是一个持久的问题(26,27]。我们的结果,再加上那些心肌细胞(28),神经细胞(29日),细胞核pulposis [25)表明,融合事件,如果发生,是相当罕见的。

现在看来,MSC的保护作用可能是多方面的。尽管有证据表明,MSC能分化成心肌细胞表型(30.- - - - - -32],许多有益的影响可能是由于替代机制33]。首先,在我们的实验室工作2)和其他(3,15)清楚地表明,MSC分泌多种细胞因子,能够影响迁移、血管生成、细胞凋亡和免疫反应。第二,当前的研究以及与Mureli et al。8]证明coculture后缝隙连接的快速形成。缝隙连接不仅提供MSC和心肌细胞之间的电耦合7,8),但也可能功能交换其他分子中重要的MSC分化成心肌细胞谱系(34]。第三,旁分泌沟通MSC通过细胞外囊泡(液和微泡)现在正在建立(11从MSC,液产生有益的影响后对心脏缺血再灌注损伤(16]。这些囊泡可以运输等各种各样的分子膜组件,信使rna, microrna的,各种类型的细胞间信号分子(13,14]。这exosomal转移可能是心肌细胞产生以来双向液含有多种影响成纤维细胞基因mRNA转录(35]。第四,越来越清楚的是,细胞能够通过通信隧道的形成碳纳米管(12]。纳米管允许电耦合和细胞间的转移膜和胞质成分(10,36]。纳米管MSC和心肌细胞之间的连接24)允许线粒体的转移(17),恢复心肌细胞的分化状态向祖状态(18),在MSC(改变旁分泌因子的分泌和19]。膜转移中观察到我们的研究可能是由于细胞外囊泡的交换或隧道之间的纳米管的形成MSC和HL-1细胞。

5。结论

这项研究表明MSC可以交换膜组件与HL-1心脏细胞。这种性质的交换可能占的一些有益影响我们观察到当MSC注入小鼠手术诱导永久冠状动脉闭塞(1]除了之前报道的分泌细胞因子通过MSC (2]。未来的研究将集中在传输和交换的具体分子机制之间的这些细胞和他们的势函数。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

罗伯特·Boomsma收到休假三位一体的基督教大学的支持,帕洛斯的高度,在这个项目上工作时,在芝加哥伊利诺伊大学。作者要感谢b . Ganesh j·陈,j .坟墓专家技术援助与流式细胞仪测量UIC研究资源中心。