文摘

间充质基质细胞(MSC)细胞疗法,因为他们有很大的潜力可以定向分化成特定血统或在受伤的网站发挥旁分泌作用。基质细胞衍生因子(SDF)之间的交互1及其受体CXCR4和CXCR7扮演关键角色在MSC受伤组织的迁移。我们评估是否一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸(VPA)调节脐带血的迁移(CB)派生MSC对SDF-1及其增殖和分化。我们发现,在MSC, VPA增加(i)基因和蛋白质表达的趋化因子受体CXCR4和CXCR7向低梯度的SDF-1和启动迁移,(ii)的基因表达MMP-2 proMMP-2分泌和激活,(3)扩散和多能性基因表达标记SOX2 Oct-4,和接触低浓度的VPA(≤5毫米)没有影响骨细胞和软骨细胞分化。因此,我们的研究表明,VPA增强了CB MSC对SDF-1迁移趋化因子受体CXCR4的表达增加,CXCR7, MMP-2。VPA在低浓度可用于体外治疗受伤的MSC增加招聘网站在不影响其增殖或分化的能力。

1。介绍

间充质基质细胞(MSC)已被证明促进造血干细胞移植,减轻移植物抗宿主病,治疗疾病的骨骼、软骨、肌肉、提供治疗基因。临床应用MSC的成功依赖于有效的招聘和保留这些细胞内适当的组织。尽管定点或当地政府的MSC可以导致成功的移植,系统注入MSC仍然是首选微创的管理模式在多数的400多个临床试验目前上市的美国国立卫生研究院的网站(1]。因此,调查机制,规范移民和归航的MSC治疗利用MSC的成功是至关重要的。介质和受体识别提供迁徙线索在MSC贩卖,趋化因子基质细胞衍生因子(SDF) 1(也称为CXCL12)及其受体CXCR4收到了相当多的关注,我们已经表明,MSC移植到一个SDF-1梯度体外(2]。

SDF-1是调节在网站受伤和被认为是一个关键的中介招聘和迁移循环CXCR4-expressing MSC,然后能够刺激在许多器官结构和功能修复。例如,它已被证明,SDF-1蛋白高表达的骨膜骨受伤在一个小鼠模型,促进骨修复通过招募静脉注射移植MSC受伤的网站(3]。SDF-1也是调节小鼠肾脏的肾缺血/再灌注损伤,和MSC改善这种情况4]。然而,当管理系统,只有一小部分注入MSC缺血性组织,大多数都滞留在肺的(5]。因此,为了最大化MSC-based疗法的有效性是非常重要的雇佣策略可以提高注入MSC的招聘和保留他们的目标组织。

对于大多数移植协议,体外扩大MSC是必要的,以达到治疗剂量。然而,我们和其他人已经表明,趋化因子受体CXCR4基因表达减少,细胞培养通道(2,6),在细胞表面趋化因子受体CXCR4表达的MSC是低7- - - - - -9]。以前,我们报道了一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDI)丙戊酸(VPA)增加趋化因子受体CXCR4 CD34的表达⁺造血干/祖细胞(公司)来自脐带血(CB)和他们的迁移对SDF-1梯度(10,11]。

hdi值都是潜在的抗癌药物,因为他们的能力改变基因的表达,诱导生长逮捕和细胞凋亡的肿瘤细胞,并刺激分化(12]。VPA (2-propylpentanoic酸)是一种抗惊厥的食品和药物管理局批准的和心境稳定药物治疗癫痫和躁狂的障碍(13]。它已经表明,趋化因子受体CXCR4 promoter-associated VPA升高大鼠MSC(乙酰化histone-H3水平14]。CXCR7已被确认为另一个7-transmembrane G protein-coupled受体识别SDF-1作为配体与一个更大的亲和力比趋化因子受体CXCR4 (15]。人类骨骨髓来源MSC的mRNA表达CXCR7及其击倒减少MSC移植(16]。我们目前的研究目的是探讨VPA增强趋化因子受体CXCR4的表达和CXCR7是否在人类对SDF-1 CB MSC和迁移。VPA已经证明可以提高正常增殖和自我更新公司(17和减少人类MSC multilineage分化的潜力18]。也在这里,我们调查的影响VPA CB MSC的自我更新和分化成成骨的chondrogenic,肌原性的血统。

2。材料和方法

2.1。细胞和文化

CB收集与母亲的知情同意按照指南的阿尔伯塔大学健康研究伦理委员会。单核细胞光密度(跨国公司)分离使用Percoll(通用电气医疗集团生命科学、湾'Urfe, QC,加拿大)密度梯度离心法和培养Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM;表达载体,伯灵顿,加拿大)补充10%胎牛血清(的边后卫,英杰公司)如前所述,我们(2]。在这项研究中,3×10⁶跨国公司/厘米²是镀在T-25组织培养瓶和孵化37°C和5%的公司₂,24小时后,不依从细胞(包括造血祖细胞和成熟血细胞)被移除和完全培养基更换。一个附着层的形成是密切监测和媒体变化进行了每5天。有人口异质性的细胞形成附着层从各种CB样本,只有文化包含了一个均匀的细胞显示成形态使用(见补充图1 (a)在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/610495)。细胞通过confluency当他们到达约60%。数整除的通道3 MSC是低温贮藏和后解冻和扩展。避免与人口相关的高可变性MSC获得不同的捐赠者,MSC源自一个CB单元在段落4到6都是用于实验。MSC治疗有或没有(控制)VPA(1、5或10毫米)3或6 h和用于后续实验。

为了确认在所有实验中使用的MSC满足最小需求定义MSC (19),表面抗原表达是评估通过流式细胞术使用使抗体CD34-PE和CD45-FITC(造血标记;贝克曼库尔特,米西索加、加拿大)、CD73-PE CD90-FITC, CD105-PE (nonhematopoietic标记;BD生物科学,奥克维尔,加拿大),和适当的免疫球蛋白g同形像控制。MSC用于这项研究显示积极的表达式基质标记CD73 CD90、CD105和消极的表达造血CD45标记和CD34(补充图1 (B))。

进一步描述所涉及的MSC分化不同的血统。细胞生长在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)包含高葡萄糖+谷酰胺(表达载体)补充10%的边后卫和其他组件有利于成骨的chondrogenic或肌原性的分化。脂肪形成的分化并不像CB-derived MSC的开展已被证明只差分化脂肪细胞(20.]。成骨分化MSC是生长在媒体补充0.1μascorbic-2-phosphate M地塞米松,0.2毫米,10毫米glycerol-2-phosphate(奥克维尔,所有来自Sigma-Aldrich加拿大,加拿大)。chondrogenic分化MSC是生长在媒体含有丙酮酸钠1毫米,0.1μM地塞米松,0.2毫米ascorbic-2-phosphate, + 1液体媒体补充(σ),和10 ng / mL TGF -β(Peprotech落基山,新泽西,美国)。为肌原性的MSC分化生长在媒体补充5%马血清,50μ氢化可的松(σ),4 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(Peprotech)。在三周post-osteogenic post-chondrogenic感应,细胞用磷酸盐缓冲盐水洗净(PBS),固定,并与茜素红染色和阿尔新蓝(σ)检测钙沉积和蛋白聚糖,分别。细胞被可视化和图片被使用一个倒置光学显微镜和微米软件(费舍尔科学,Nepean、加拿大)。

2.2。凝胶和定量逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

总核糖核酸(RNA)使用试剂盒提取试剂(美国Gibco-BRL,马里兰州)从未经处理和VPA-treated MSC分化MSC根据制造商的指示。在20互补DNA合成μ包含2 L反应体积μg总RNA和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(表达载体)和用于rt - pcr。人类glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和18 s RNA是量化规范化反转录的RNA和效率差异的凝胶和定量rt - pcr (q),分别。引物对趋化因子受体CXCR4、CXCR7胶原X, myogenin, MyoD,骨钙素,osterix, GAPDH和获得集成DNA技术公司。(美国圣地亚哥,CA)和PCR产物的序列和尺寸表中列出1。凝胶是可视化在紫外线的照射下,光密度分析进行了使用Fluorchem成像系统(αInnotech,圣莱安德罗、钙、美国)。

中存在的其他引物获得试剂盒(成交价QuantiTect底漆测定试剂盒,CA),即18岁(QT00199367) MMP-14 / MT1-MMP (QT00001533) SOX-2 (QT00237601)和Oct-4 / POU5F1 (QT00210840)。量化了使用Quantifast SYBR绿色装备(试剂盒)48-well StepOne实时PCR系统板(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。失活在95°C的放大周期由5分钟,在95°C 10年代放大,60°C 30年代和40倍运行与每个样本一式三份分析。目标基因表达水平的决心使用比较阈值周期方法(),作为目标底漆的叠化相对于18 s RNA表达(v2.2.2 StepOne软件,应用生物系统公司)。

2.3。流仪分析CXCR4和CXCR7

表面表达的趋化因子受体CXCR4和CXCR7 CB-derived MSC是检查使用PE-conjugated反人类的CD184 (CXCR4、克隆12 g5 BD生物科学米西索加,,加拿大)和PE-conjugated反人类的CXCR7(克隆11 g8,研发系统,明尼阿波利斯,MN,美国)。短暂,细胞被洗了三次在PBS包含2%牛血清和孵化PE-labeled老鼠免疫球蛋白同型的控制或趋化因子受体CXCR4和CXCR7抗体45分钟在4°C,紧随其后的是三个洗。最后洗后,细胞被固定在1%多聚甲醛流仪分析(FACscan;美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)。

2.4。Zymography和免疫印迹

gelatinolytic活动在媒体无血清条件未经处理和VPA-treated MSC的评估使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。短暂,MSC在孵化37°C血清IMDM有或没有(控制)不同浓度的VPA(1、2.5、5或10毫米)3或6 h。孵化后,cell-conditioned媒体收集和分析nonreducing条件下使用1.5毫克/毫升的12%聚丙烯酰胺共聚凝胶(σ)。凝胶是用2.5% Triton,孵化一夜Tris-HCl缓冲区包含5毫米CaCl (pH值7.5)₂,沾0.5%考马斯亮蓝g - 250从σ(所有)。

免疫印迹,细胞颗粒被用在裂解缓冲(Triton 1%, 10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液,150毫米氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,和pH值7.3)包含1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(10μ10 g / ml亮抑酶肽,μg / mL抑肽酶,1μg / mL抑肽素,所有从σ)。细胞溶解产物被离心澄清在14000 rpm和4°C 10分钟,和使用布拉德福德的蛋白质浓度测定蛋白质测定(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。样本被解决通过sds - page和转移到硝酸纤维素,其次是堵塞与三羟甲基氨基甲烷缓冲液脱脂奶粉5% saline-Tween 20 1 h在室温下。膜与特定主要抗体所述每个探测实验。兔子反人类的趋化因子受体CXCR4和CXCR7抗体购自AbDSerotec(美国罗利数控)和GeneTex(欧文、钙、美国),分别。鼠单克隆抗体β肌动蛋白(美国Abcam、剑桥、马)是用于加载控制。洗涤三次后,膜与HRP-conjugated探测特定的二级抗体,抗体绑定检测和发射极耦合逻辑(SuperSignal西Pico系统,皮尔斯,罗克福德,美国)。

2.5。Chemoinvasion化验

如前所述(执行一个chemoinvasion试验2]。简而言之,聚碳酸酯过滤器(13毫米直径,8μ米孔隙大小;Nucleopore,多伦多,加拿大)被涂上一层25μ基底膜基质的g(协同生物医学产品,贝德福德,妈,美国)。众议院只包含IMDM补充0.5%牛血清白蛋白(控制)或SDF-1(20或100 ng / mL,生物医学研究中心,英属哥伦比亚大学,温哥华BC,加拿大)。细胞被preincubated有或没有(控制)VPA(5毫米)3 h与趋化因子受体CXCR4在37°C或拮抗剂AMD3100(σ)或活动(CCX733)或灭活(CCX226) CXCR7拮抗剂(美国Chemocentryx山景,CA)。孵化后,细胞中被改为新鲜IMDM / 0.5% BSA和细胞被加载到参议院(1×10⁵细胞/室)和孵化一夜之间在37°C。第二天,细胞在参议院被移除;下腹过滤器与4%甲醛固定,结晶紫沾1%。迁移的细胞数在光学显微镜下通过选择三个随机领域。

2.6。分化和增殖化验

细胞在DMEM补充葡萄糖+高谷酰胺(表达载体),10%的边后卫,和其他组件有利于成骨的,chondrogenic或肌原性的分化如上所述。细胞被使用或没有(控制)在无血清IMDM VPA 3或6 h之前切换到微分媒体。

扩散试验进行了使用lumenesc - 96工具包(伊凡博士的礼物丰富,HemoGenix Inc .)科罗拉多斯普林斯,有限公司,美国)衡量细胞内三磷酸腺苷(ATP)产生的细胞。简单地说,在低血清培养基培养细胞(MSCGro HemoGenix)在96孔板(5000个细胞/ 6复制/条件)和37°C和5%孵化有限公司₂过夜。第二天,细胞被使用或没有(控制)VPA(1、5或10毫米)3或6 h。治疗后,VPA冲毁在MSCGro介质和细胞种植了一天。ATP标准曲线和样品测量根据制造商的说明进行。短暂、ATP枚举试剂被分发到井和混合溶解细胞释放ATP,充当限制荧光素/荧光素酶反应的底物。发出的荧光测量使用SpectraMax L光度计(分子设备/ MDS分析技术、桑尼维尔,美国)。数据采集和分析进行了使用将SoftMax Pro 5软件(分子设备)。相对发光单元后被转化为标准化的ATP浓度校正背景发光媒介提供的。

2.7。统计分析

算术均值和标准差计算。学生的2-tailed以及用于计算价值观和统计学意义被定义为。

3所示。结果

3.1。丙戊酸增加的基因和蛋白质表达的趋化因子受体CXCR4和CXCR7 CB MSC

调查是否CB MSC表达两SDF-1受体和确定哪些受体介导SDF-1-directed MSC迁移,信使rna提取MSC,执行中存在使用特定的引物趋化因子受体CXCR4和CXCR7。因为在短期(3 h)大鼠MSC VPA治疗更为强劲提高趋化因子受体CXCR4记录的水平相比,长期(24小时或更长时间)治疗14),我们暴露了人类CB-derived MSC VPA 3或6 h。VPA等离子治疗水平的范围从0.35毫米到1毫米,VPA已被证明不诱导细胞毒性细胞死亡在人类脂肪tissue-derived和脐CB-derived MSC治疗24小时后的剂量小于10毫米(18),我们检查的影响1、5或10毫米VPA基因表达的趋化因子受体CXCR4和CXCR7 CB MSC。

趋化因子受体CXCR4和CXCR7 mRNA在MSC检测,并增强了他们的表达增加剂量的VPA(图1(一))。趋化因子受体CXCR4表达增加40倍3 h,约60倍后6 h后VPA暴露在10毫米。CXCR7基因表达的增加存在剂量依赖的相关性并不强劲,超过2倍3 h和5倍后6 h后VPA治疗10毫米。确认是否增加mRNA水平的趋化因子受体CXCR4和CXCR7翻译成蛋白表达增加,我们对细胞表面和总蛋白表达和VPA-treated MSC,在未经处理的情况,令人惊讶的是,没有观察到upregulation表面表达的受体与VPA治疗后(图1 (b))。之前它已经表明,趋化因子受体CXCR4主要是隔离细胞(21和与CXCR7形成22]。,因此,它是合理的蛋白表达增加可能不是表面检测到细胞。然而,使用西方免疫印迹总趋化因子受体CXCR4的表达和CXCR7蛋白质被VPA证明是增强。观察趋化因子受体CXCR4水平的增加存在剂量依赖的相关性,达到对28-fold增强3 h后10毫米。更长的潜伏期(6小时)也显示,趋化因子受体CXCR4增加存在剂量依赖的相关性,但与10毫米VPA只有4.5倍。Upregulation CXCR7蛋白质的表达达到一个峰值后3 h和6 h与5毫米VPA孵化并开始下降在最高(10毫米)VPA浓度(图使用1 (c))。

3.2。VPA提高MSC对低SDF-1梯度迁移,这是抑制趋化因子受体CXCR4和CXCR7拮抗剂

来决定是否增加趋化因子受体CXCR4和CXCR7表达式转换成一个增强的功能反应,首先,我们检查了未经处理的细胞的体外trans-Matrigel迁移。CB MSC移植约2倍向低SDF-1梯度(20 ng / mL)和4倍向高SDF-1梯度(100 ng / mL)相比,介质(图2左面板)。当细胞被使用5毫米VPA对3 h加载到Boyden室之前,我们发现VPA显著增加()trans-Matrigel chemoinvasion向SDF-1梯度较低水平与未经处理的细胞迁移的chemoinvasion向高SDF-1梯度。VPA的启动效应对低SDF-1 chemoinvasion梯度明显()被强有力的特定的趋化因子受体CXCR4拮抗剂AMD3100,支持假设chemoinvasion的增加是由于直接VPA对趋化因子受体CXCR4表达的影响。我们还注意到一个重要的()抑制CXCR7拮抗剂CCX733启动效应,但不是通过灭活CXCR7拮抗剂CCX226(图2右面板)。

3.3。VPA增加MMP-2但不是MT1-MMP表达式

以前,我们已经表明,启动代理增加公司的homing-related反应通过上调表达的基底膜降解酶基质金属蛋白酶(MMPs) [23]。我们还展示了以前,MSC表达MMP-2和膜1型(MT1 mmp),但不是MMP-9 [2]。因此,我们研究是否VPA刺激MMP-2和MT1-MMP CB MSC的表达。的基因和蛋白质表达MMP-2发现使用中存在和zymography,分别。图3(一个)(前左面板)显示,孵化的细胞3 h和VPA导致轻微upregulation(1.3倍)MMP-2 mRNA的表达达到5 mM VPA。一致,proMMP-2的分泌是提高1.4倍3 h后5毫米VPA的孵化。VPA也诱导激活proMMP-2如图所示的截断的外观形式的酶(图3(一个)左面板底部)。图3(一个)面板(右上角)显示轻微upregulation(1.3倍)MMP-2 mRNA后6 h 5毫米VPA的孵化。然而,更高浓度的VPA(10毫米)引起的衰减proMMP-2分泌(图3(一个)右下角的面板)。MT1-MMP基因表达没有明显受到不同浓度的VPA CB MSC孵化时3 h(图3 (b)左面板)或6 h(图3 (b)右面板)。

3.4。VPA对MSC增殖施加不同的影响和表达多能性的标记

VPA CB MSC的增殖的影响被测量的量进行细胞内ATP释放的可行的细胞。如图4(一)3 h后,MSC增殖显著增加暴露在低浓度的VPA(1毫米和5毫米)。更高浓度的VPA(10毫米)也引起了轻微,但没有统计学意义,增加细胞增殖。然而,当孵化了MSC VPA(5毫米,10毫米)的时间较长(6 h)观察细胞增殖减少。

pluripotency-associated基因SOX2和Oct-4持续表达的CB MSC,我们检查了VPA对使用中存在这两个基因的表达。之后我们发现3 h接触VPA SOX2的表达和Oct-4显著增加,达到5毫米VPA(超过5倍和三倍,resp。)(图4 (b))。然而,当MSC与高浓度的孵化VPA(5毫米,10毫米)的时间较长(6小时),我们发现SOX2和Oct-4(图的表达减弱4 (b))。这些结果与浓度和时间一致VPA对细胞增殖的影响。

3.5。MSC VPA浓度高的曝光时间长会使表达成骨,Chondrogenic,肌原性的标记

短期暴露的MSC(3到6小时)低浓度的VPA没有影响其分化为骨细胞,作为钙沉积由茜素红染色,或成软骨细胞,作为蛋白聚糖由阿尔新蓝染色(图5(一个))。然而,有一个明显的减少和成骨的chondrogenic分化MSC治疗时6 h浓度最高的VPA(10毫米)。

由凝胶rt - pcr VPA是否会影响我们下一个检查osterix基因表达的转录因子,对成骨细胞分化和骨形成至关重要24),骨钙素,完全由成骨细胞分泌的一种蛋白质,在骨矿化过程中发挥作用和钙离子内稳态25),和X型胶原,软骨细胞产生的一种蛋白质,参与软骨的改造26]。Osterix、骨钙素和胶原蛋白类型X是既定的CB表达的MSC, VPA(1到10毫米)稍微增加了表达Osterix 3和6 h后孵化(图5 (b))。VPA(1和5毫米)也略微增加骨钙素mRNA 3 h后6 h后但这些浓度没有影响。然而,值得注意的是,当10毫米VPA治疗骨钙蛋白表达减少。X型胶原的表达稍微增加1和10毫米VPA 3 h和后6 h后孵化VPA(图5毫米5 (b))。

我们还研究了myogenin VPA对基因表达的影响和MyoD,是参与原始间充质细胞的分化到骨骼肌和CB表达的既定的MSC。使用中存在,我们发现VPA上调myogenin和MyoD mRNA。与5毫米VPA 3 h后,4倍和2.5倍增加观察myogenin MyoD;分别,然而,它只花了1毫米VPA myogenin表达式2.5倍和MyoD增加2倍MSC治疗时6 h(图5 (c))。另一方面,减少myogenin表达观察MSC与10毫米VPA孵化时6 h;后与10毫米VPA MyoD表达式也减少了3 h(图5 (c))。

然后我们对待MSC与5毫米VPA对3 h,洗出VPA,和诱导细胞分化成骨,chondrogenic,肌原性的血统。在感应媒体3周后,我们检查了osterix的基因表达,骨钙素、胶原蛋白X, myogenin, MyoD VPA-treated细胞比未经处理的细胞。我们发现,骨钙素和osterix表达没有明显变化,而胶原蛋白类型X, myogenin, MyoD表达减少(图5 (d))。

4所示。讨论

MSC移植到受伤组织的能力是至关重要的在组织修复和细胞治疗和他们的应用程序受到广泛的趋化因子受体轴,包括SDF-1 / CXCR4和SDF-1 / CXCR7。调制这些交互和定向信号可以提供一个潜在的方法来提高前vivo-cultured MSC的招聘系统注入受损或病变的组织。鉴于趋化因子受体CXCR4的表达和其他归巢受体减毒在文化扩张,MSC的迁移对SDF-1减弱。最近,我们证明了超表达的趋化因子受体CXCR4使用阳离子liposome-mediated转染显著增加MSC移植到一个SDF-1梯度(9]。在这里,我们表明,短期暴露CB-derived MSC VPA的结果在一个upregulation基因和蛋白质表达的趋化因子受体CXCR4和对SDF-1 CXCR7和一个增强的趋化现象的反应。

尽管低趋化因子受体CXCR4或CXCR7细胞表面表达,MSC响应从SDF-1趋药性的信号,表明自己的配体的存在,细胞内趋化因子受体CXCR4的比例或CXCR7可以移到细胞表面。以前,我们表明,发起者的经典激活补体级联(C1q)介导的homing-related响应公司(27]。C1q也增强了MSC移植作为化学引诱物,这可能促进炎症网站的招聘和加强其SDF-1-dependent迁移通过增加表面表达的趋化因子受体CXCR4 (8]。有许多试图加强与目标刺激的趋化因子受体CXCR4表达趋化现象的应对SDF-1包括治疗MSC的鸡尾酒文化细胞因子(28)或通过慢病毒基因转移在辐照提高自导体内主机(29日]。相反,其他人则表明,慢病毒超表达的趋化因子受体CXCR4和CXCR7鼠MSC没有改善的导航和治疗潜力这些细胞在实验急性肾损伤(30.]。而表达的趋化因子受体CXCR4和CXCR7都是人类MSC,只有趋化因子受体CXCR4调和他们的迁移以响应所示肿瘤细胞基因沉默实验,和击倒CXCR7理学硕士(对迁移的影响最小16]。此外,招聘缺血性肾增加相比,hypoxic-MSC normoxic-MSC这改进招聘中和被废除的趋化因子受体CXCR4但不是CXCR7 [4]。尽管我们研究了体外启动VPA MSC迁移反应的能力的人类发展指数,促进MSC归航,提高功能恢复也评估了体内的其他调查人员使用大鼠模型脑缺血(31日]。MSC满怀VPA(2.5更易/ L, 3 h)移植到老鼠后24 h短暂性大脑中动脉阻塞(MCAO)。启动与VPA msc归航的数量增加到大脑梗塞的地区。收到VPA-primed MCAO大鼠msc显示显著改善神经系统评分,减少梗塞体积,并增加微血管密度在梗塞的半影区域,而这些有益的VPA启动被AMD3100[逆转31日]。在相同的研究中,氯化锂也增强体外迁移由MMP-9 [31日]。

穿过内皮屏障和降解细胞外基质是一个重要的一步MSC到目标站点。我们曾表明MT1-MMP理学硕士(MMP-2参与迁移、2),MMP-2 C1q-mediated MSC迁移期间增强[8]。在这里,我们表明,VPA增加MMP-2 proMMP-2基因表达和分泌和激活。我们的研究结果是一致的与其他研究表明,抑制MMP-2减少transendothelial迁移MSC (32),而MMP-2 upregulation通过炎性细胞因子促进迁移(33]。

MSC,虽然不具有真正的干细胞的标志特征,也就是说,多能性和自我更新,仍然引起临床好处通过向脂肪细胞分化的能力,成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞,neuron-like细胞。因为MSC进行复制的细胞衰老在重复亚文化通过10为我们的实验中,我们使用MSC年龄不超过6。基于表观遗传调节组蛋白和DNA,人类发展指数能够诱导分化和削弱干细胞的自我更新。在这项研究中,我们调查是否人类发展指数VPA影响分化和CB MSC的增殖。我们发现对细胞增殖的影响依赖于使用的VPA浓度和暴露的细胞。当MSC治疗3 h与VPA浓度的5毫米或更低,扩散增强;然而,孵化时间较长(6小时)的浓度高于5毫米抑制增殖。这是与人的研究结果一致表明,在小鼠成骨细胞细胞系VPA促进细胞增殖在低浓度(0.1 - 50μ3天)和减少细胞增殖和细胞毒性增加,高浓度(1毫米)34]。同样,在老鼠的间充质细胞,增殖抑制后48 h与6毫米VPA否则没有孵化效果相对于未经处理的细胞(35]。VPA对细胞增殖的影响显示也是依赖于细胞的成熟水平;未成熟细胞耐高浓度的VPA (35]。我们的结果与报告,VPA补充pluripotency-associated基因的上调表达,即Oct-4, Nanog, SOX2 [36]。这是很重要的,因为hdi值都能够加强多能性干细胞分化和体细胞重编程,而且,事实上,致癌因子替代与小分子如VPA提高重组的效率是最近描述(37]。特别是,2毫米VPA治疗1周重编程效率提高100倍以上,使用Oct4-GFP作为一名记者。VPA也使高效诱导多能干细胞而不引入致癌基因原癌基因。VPA是最强大的三个hdi值测试(包括suberoylanilidehydroxamic酸和trichostatin),它并没有导致基因变化时检查的染色体异常(38]。

MSC的潜在的治疗机制不仅包括他们的导航效率受伤网站,还分泌营养因素的能力(39),分化成多种细胞类型。组成型表达的CB MSC骨钙素和osterix,胶原蛋白类型X, MyoD, myogenin,成骨的标记,chondrogenic,骨骼肌分化,分别意味着CB MSC文化包含一个族群的细胞能够分化成这些血统。我们观察到瞬态增加这些标记物的表达在短期孵化(3 h) VPA浓度较低(< 5毫米)。然而,我们发现骨钙素的表达减少,胶原蛋白类型X, myogenin,和MyoD,尤其是在接触VPA 10毫米。

我们的结果是一致的人的结果显示,例如,成骨细胞的标记基因的表达水平(胶原蛋白1α2、骨桥蛋白和骨钙素)显著增强的6μM VPA一周(35]。在另一项研究中,抑制组蛋白脱乙酰酶活性(使用trichostatin)早期成骨细胞分化显示加速分化过程是基于骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达增加了qRTPCR和钙结合(34]。最近,trichostatin确认来提高成骨的标记物的表达,基质矿化,骨形成在小鼠胎儿肢体外植体(40]。CB-derived MSC已经证明表达组蛋白脱乙酰酶(HDAC) 1和241]。最近的证据表明,特定的这些hdac抑制可能有选择性的对成骨细胞分化的影响42]。此外,VPA也报道增加成人神经祖细胞和神经元分化增强成骨分化,但抑制星形胶质细胞,少突细胞,脂肪细胞,软骨细胞分化[37]。各种神经分化的标记,包括巢蛋白、GFAP、NeuN,和NF-M证明增加骨骨髓来源MSC使用VPA (43]。综上所述,这些研究表明,表观遗传机制发挥重要作用在调节的MSC分化不同的血统,和hdi值丙戊酸可以额外的治疗价值。

5。结论

我们的研究表明,VPA提高迁移的CB MSC对SDF-1通过增加趋化因子受体CXCR4的表达和CXCR7,以及MMP-2。短期暴露(3 h) MSC的低剂量的VPA(≤5毫米)可以用来增加受伤的招聘网站,加强他们的增殖潜力,同时保持他们分化为骨细胞的能力,软骨细胞和细胞。是因为它是一个安全的和耐受药物,我们建议VPA用于体外治疗输液前MSC不仅提高招聘受伤的组织,但也可能支持他们的分化。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

利亚Marquez-Curtis和渊源秋同样对本文亦有贡献。

确认

这项研究是由加拿大血液服务(CBS) /加拿大健康研究所研究血液的利用率和保护倡议格兰特和CBS校内授予安娜Janowska-Wieczorek。渊源邱被CBS博士后奖学金支持。

补充材料