文摘

脂肪tissue-derived基质细胞,称为对asc,再生应用中扮演着重要的角色。他们类似于间充质干细胞由于用不完,一般分化潜力,可塑性和显示一系列特异性和cluster-of-differentiation (CD)标记配置文件类似于其他成体干细胞。表型的变化或与CD标记分化密切相关。我们的研究的目的是展示不同的人群对asc成骨分化的不同特色。主细胞对asc批murine-derived从皮下脂肪组织中提取的细胞分类表面蛋白质分子CD90和CD105的表达用流式细胞术。每个细胞群排序CD90和分析了CD105成骨细胞培养后效力。对asc结果表明,表现出不同的人群提供不同的成骨分化的特点:无序对asc刺激与矿化结节形成骨髓基质细胞(bmsc)成骨的中、病毒转染BMP2加速形成的矿化结节CD90和/或对asc CD105积极观察CD105的表达下降后14天。未来的研究应该进行评估不同的对asc immunophenotypes开发细胞组织工程。

1。介绍

干细胞具有长期自我更新和跨多个血统力量。因此,他们有巨大的潜力在组织工程和再生医学多学科尤其是当他们被认为是丰富的,可以通过相对收获等侵入性程序从颊脂肪垫中提取脂肪中提取干细胞与骨髓干细胞。然而,许多要求,比如道德,安全性和再现性仍然迫切干细胞临床应用之前,它是必要的,部分紧急,追求理想的干细胞,这样他们可以沿着多个细胞谱系分化途径的监管和可再生的方式,安全有效地移植自体或同种异体的主机,依照现行良好生产和制造实践指南(1]。最近,干细胞研究与应用程序迅速拥有先进的人类骨髓和胚胎干细胞再生医学(ESCs)和修复虽然只是在基础研究阶段。“诱导多能性”细胞也可以作为再生医学的另一个潜在来源。也有越来越多的人关注的治疗使用脂肪tissue-derived基质细胞,称为脂肪干细胞(对asc),在再生应用中扮演着重要的角色2,3]。

脂肪组织存在皮下和内脏脂肪;皮下脂肪特别容易吸气和外科手术期间收获。它包含几个细胞类型包括脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、血管平滑肌细胞,并对asc。对asc收集在颗粒状间质血管分数(SVF)通过离心分离流动人口的成熟的脂肪细胞。他们类似于间充质干细胞(msc)由于其一般分化潜力和可塑性4,5)和显示细胞表面标记资料等其他成体干细胞类似骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)。对asc表达多种干细胞细胞相关基因通常ESCs bmsc和表达的。对asc和bmsc也都持续表达的基因,调节血管生成,矩阵重构,有丝分裂发生和分化。此外,细胞表达一系列特异性和cluster-of-differentiation (CD)标记(6- - - - - -9]。

最近的研究表明,对asc多功能,培养与适当的媒体补充(1,3),可以分化为间充质细胞类型,包括脂肪细胞(10- - - - - -14),软骨细胞、成骨细胞(11- - - - - -16),神经元细胞、细胞、心肌细胞、肝细胞、胰腺细胞,内皮细胞尽管还不清楚一个ASC可以分化成所有可能的细胞谱系。即使这些表型差异,组织修复是可能使用新鲜孤立SVF细胞(17]。表型的变化或分化密切相关的细胞表面标记,如CD的家庭。因此,识别ASC表面immunophenotype使得干细胞群的浓缩和纯化18- - - - - -20.]。例如,CD90和CD105标记的干细胞可以用来识别总SVFs和脂肪组织可能形成成骨细胞的或chondroblastic后代(21]。CD105已被确认为endoglin,粘附分子可以区分附着对asc和造血血统。然而,只有少量的研究检查了cd干细胞生长和分化的重要性(3]。

我国的许多研究表明显著影响成骨细胞的分化成熟细胞在体外或体内骨愈合异构的细胞群。因此,它是假设BMP2替代骨诱导骨形态发生蛋白家族的成员可能是有用的评估基于cd或地址的成骨的潜力,immunophenotypically排序干细胞。在这项研究中,对asc murine-derived排序的表面蛋白分子CD90和CD105的表达用流式细胞术。据我们所知,这是第一个研究检查每个排序的成骨的潜在人口有或没有骨形成protein-2 BMP2 adenoviral转染。本研究的目的是确定不同的人群对asc成骨分化的不同特色。

2。材料和方法

机构的动物保健和使用委员会批准东京医疗和牙科大学的协议设计和程序(批准号0130286)。细胞培养和分子程序进行批准和东京医疗和牙科大学的指导方针后(批准号2013 - 050)。

2.1。ASC提取

总共4.6 g的皮下脂肪组织提取的背侧和腹侧8-week-old女性印记控制区域(ICR)老鼠,之后pentobarbitone钠安乐死。当时立即消化成单个细胞用0.1% (w / v)胶原酶(美国Sigma-Aldrich I型胶原酶)在30毫升磷酸盐(和光化学、PBS, kouichi日本)为1.5 h。细胞悬液过滤是一个70年μm细胞过滤器(BD生物科学、日本),然后在1000×g离心5分钟颗粒对asc [4,5,22]。细胞颗粒在50毫升resuspended杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM,含有葡萄糖4.5 g / L和0.584 g / L谷酰胺,Sigma-Aldrich)补充10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫,Sigma-Aldrich)和1% (Sigma-Aldrich)和镀10厘米文化菜肴。细胞培养在37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的公司组成₂直到融合。

小鼠骨髓细胞被刷新从股骨使用27 G针和颗粒状很快在1000×G离心5分钟;他们又洗PBS和离心机。收获细胞培养在10毫升DMEM补充10%的边后卫和1%青霉素和链霉素对10厘米文化直到他们到达confluency菜肴。媒体对于这两种类型的细胞每3天刷新。

2.2。流式细胞术

第一章节对asc使胰蛋白酶化(1% trypsin-EDTA Sigma-Aldrich)然后在1000×g离心5分钟的1%的边后卫猝灭酶的存在。细胞颗粒在PBS resuspended 1%的边后卫,透过70μm细胞过滤器(BD生物科学),使用一个细胞计数和细胞数和光化学(kouichi)。20毫升的纯化鼠anti-mouse CD16 / CD32(鼠标BD Fc块,BD生物科学)添加到2×10⁷细胞和混合是在4°C的环境中为20分钟。细胞被分离到100年μ浓度1×10 L分数⁷细胞/毫升,然后孵化在4°C 0.5μg anti-CD90 / Thy1 (FITC。每1000000个细胞MRC OX-7] (FITC) (ab226;英国Abcam)和/或10μL anti-CD105抗体[MJ7/18](藻红蛋白;ab93567 Abcam)每40分钟1000000个细胞。抗体结合细胞随后通过35再次过滤μm细胞过滤器(BD生物科学)。细胞培养与5μL 7-AAD染色溶液(BD生物科学)10⁶细胞10分钟,然后排序根据细胞表面标记物的表达CD90和/或使用fluorescence-activated CD105细胞排序(流式细胞仪)(流式细胞仪咏叹调II;BD生物科学、日本)。收集细胞在DMEM补充1%青霉素、链霉素和10%的边后卫。对asc被分为四组:CD90 (−) / CD105 (−), CD90 (+) / CD105 (−), CD90 (−) / CD105(+),和CD90 (+) / CD105 (+);无序对asc是用作控制。

2.3。微阵列

流式细胞仪使用三组4.6 g-adipose组织后,总RNA纯化,从四种分类收集细胞群,对asc无序,bmsc使用RNeasy微工具包(美国试剂盒)。RNA被验证为质量和量化使用安捷伦2100生物分析仪和安捷伦RNA 6000 Pico工具包(美国安捷伦科技有限公司)。两个片段与18岁和28 s rrna观察清楚,和RNA完整数量的每个样本> 8.0。那时总RNA杂化一个数组,其中包含34102 mrna和检测和量化被执行。标记基因的表达与细胞增殖有关,附着力,成骨细胞、破骨细胞,和Wnt信号扫描,分类,和代表一个热图根据基因的功能和/或信号通路(集群和树视图;斯坦福大学,美国)。

2.4。准备一个人类BMP2腺病毒编码

人类BMP2编码区(1191碱基对(bp)),这是克隆最初Yutaka Maruoka博士(23),被结扎了Bam嗨限制网站pEGFP-N1(帕洛阿尔托Clontech实验室Inc .)、钙、美国)向量;使用一个向量被放大大肠杆菌细菌转化系统(TOP10F ';表达载体,生活技术,日本)。克隆被纯化和DNA提取使用EndoFree质粒马克西工具包(试剂盒)。的完整序列bmp2基因被放大使用一套底漆和15 bp同源两端的多个克隆网站的pAdenoX向量。然后将PCR产物转移到pAdenoX向量使用输液反应(Adeno-X Adenoviral系统3、Clontech)。矢量放大了恒星主管细胞和纯化使用EndoFree质粒马克西工具包后PCR殖民地筛选使用相同的引物(图执行1(一))。随后,pAdenoX向量编码人类bmp2是线性化酶与Pac我和转染到HEK293细胞使用化工转染(CalPhos哺乳动物转染设备;豆类生物、日本)。然后产生一个人类腺病毒编码的细胞bmp2,称为AdenoX-bmp2引起细胞病变效应。主adenoviral股票在PBS收集连续三次冻融循环准备原油病毒溶菌产物。HEK293细胞也retransfected与腺病毒通过直接将病毒股票添加到培养基(2.5×10⁵细胞/ 500μL在每个1.9厘米²24-well板)来获得更高的病毒滴度(Adeno-X快速效价工具包,豆类Bio)(图1 (b))。六邻体主要外套蛋白被发现后,细胞被固定和孵化与六邻体蛋白特异性抗体。然后他们被孵化HRP-conjugated抗体和抗原抗体复合物可视化使用3,3′-diaminobenzidine衬底。阳性细胞染色棕色,很容易计算在20×目标。包含形成单位(ifu) /毫升计算产生的平均阳性细胞数量/单位稀释。不同稀释的腺病毒获得使用Adeno-X快速效价的方法和用于感染HEK 293细胞。这导致5.85×10的效价⁶ifu /毫升。辅助细胞病变adenoviral股票被存储在相同的冻融循环后−20°C。

2.5。细胞培养

按细胞流式细胞仪被播种到24-well在4×10的初始密度板⁴细胞/。然后他们被培养14天在正常DMEM补充青霉素、链霉素的边后卫和1%与10%;在成骨培养基补充10⁻⁸M地塞米松,10毫米β甘油磷酸酯(g - 9891, Sigma-Aldrich)和50 ng / mL抗坏血酸(和光化学013 - 12061,kouichi);对asc或BMP2转染介质,在成骨的介质与AdenoX-bmp2转染感染复数(MOI) 5.85×10⁶ifu /毫升。模拟转染被用作控制。从所有组对asc培养14天。无序对asc和bmsc也作为描述。一组细胞受到成骨的分析通过测量碱性磷酸酶(ALP)活动,评估相关基因的蛋白表达,组织学染色(高山和mineralized-nodule染色)和逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)。另一组是在试剂盒均相试剂(表达载体)分离总RNA信使RNA使用流式细胞仪分析和第三组被重新分析。

2.6。量化蛋白质浓度和高山的活动

细胞培养7天,用PBS洗净,刮,细胞溶解在0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich),和用破坏细胞膜。样本然后在20000×g离心10分钟4°C和上层的收获来评估高山活动和测量蛋白质含量。确定蛋白质浓度,100μL与100年从每个样本准备上层清液混合μ刚做好的L bicinchoninic酸(BCA)工作试剂(QuantiPro BCA蛋白质化验设备,Sigma-Aldrich)和孵化2 h的37°C。样品被量化使用multilabel计数器(mtp - 650;电晕电、日本)的波长562 nm。

定量和动态高山活动是由分析50μL样品上层清液使用一个高山检测设备和光化学(kouichi)。简而言之,样本孵化p-nitrophenyl磷酸溶液,准备根据制造商的指示。反应是停止的50μL(氢氧化钠停止解决方案,和高山活动测量使用multilabel计数器(美国Wallac 1420下午Sx)波长405 nm。高山活动规范化总蛋白浓度在每个样本。数据表示为±SD的三个复制。

2.7。高山染色

萘酚AS-MX磷酸酶(0.1毫克/毫升)和快速蓝色BB盐(0.6毫克/毫升)溶解在Tris-HCl缓冲区(0.1 M, pH值8.8)包含0.5% N, N-dimethylformamide MgCl和2毫米₂。解决方案被过滤和用作ALP-positive细胞染色(Sigma-Aldrich)的解决方案。细胞生长7天洗两次PBS和固定在3.7%福尔马林10分钟。固定细胞然后用PBS冲洗两次,孵化1毫升染色解决方案在37°C 20分钟来识别蓝色ALP-positive细胞。细胞用PBS停止染色反应。数字图像捕获使用显微镜(Biozero bz - 8000;美国日本基恩士)和ALP-positive面积测量使用图像J软件(美国国立卫生研究院的1.47版本)和计算的比值积极染色区域的总面积。

2.8。茜素红染色

矿化结节染色后14天文化在另一组井。染色的解决方案是由溶解茜素红S(1%) 1: 100年水、氢氧化铝过滤紧随其后。细胞被洗两次PBS和在甲醇浸泡10分钟。细胞在水冲洗后,他们与500年孵化μL茜素红S每口井的解决方案2分钟直到矿化结节被染成红色。反应被终止通过洗水去除染色过度沉淀和试剂。通过光学显微镜捕获的图像(Biozero bz - 8000;日本基恩士)。

量化染色,文化使退色使用10%氯化十六烷吡啶(CPC)在10毫米磷酸钠,pH值7.0,在室温下15分钟。整除的提取物稀释10倍10%中国共产党解决方案,和茜素红S的浓度决定通过测量吸光度在562海里一个多平台的读者(mtp - 650,电晕电)。

2.9。聚合酶链反应对成骨的基因的表达

I型胶原和骨钙素的表达,有关骨生成两个基因,分析了使用引物PCR对使用引物3软件设计如下:鼠标胶原蛋白I型感觉引物5′-CCCAGAGTGGAACAGCGATTAC-3′;反义引物5′-TGTCTTGCCCCATTCATTTGTC-3′;鼠标骨钙素感觉引物5′-GCAATAAGGTAGTGAACAGACTCC-3′;反义引物5′-GTTTGTAGGCGGTCTTCAAGC-3′;和鼠标GAPDH感觉引物5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′;反义引物5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。细胞被集中和均质在试剂盒试剂天0和14中提取总RNA,并使用上标互补脱氧核糖核酸合成第一链合成系统rt - pcr(表达载体)。reverse-transcribed的互补与适当的放大下底漆集最优循环条件:35周期60年代95°C的变性、退火60年代60°C, 60年代的72°C扩展。PCR产物的身份被证实用2%琼脂糖凝胶电泳。

2.10。统计分析

统计分析采用SPSS 14.0统计软件包为Windows (SPSS Inc .芝加哥,IL)。数据分析使用非参数图基的HSD(老实说显著差异),单对单的比较测试。数据被认为是显著时值≤0.05。结果表示为±标准差。

3所示。结果

3.1。细胞扩张

一旦他们已经从脂肪组织中提取,花了72 h对asc在10厘米文化达到融合菜;胰蛋白酶是用于通道细胞。当细胞达到融合,他们使胰蛋白酶化和播种(第二段)三个井24-well板的4×10的浓度⁴细胞/。这些细胞在DMEM和迅速由播种(图48 h后达到融合2)。其余使胰蛋白酶化对asc被用于细胞分选。bmsc,异构的成纤维细胞,间充质干细胞,造血细胞,和许多不同的祖细胞在生长培养基培养扩大为7天贴壁细胞。中删除不依从细胞,和贴壁细胞使胰蛋白酶化和播种到10厘米文化菜肴。bmsc生长缓慢,10天达到融合。然后他们被播种在三个井24-well板的4×10的初始浓度⁴并允许增殖细胞。再次bmsc生长缓慢,达到文化融合后10天(图2)。其余使胰蛋白酶化bmsc使用流式细胞仪进行了分析。

3.2。流式细胞仪分析

图3流式细胞仪分析显示了结果。流式细胞仪是用来分离对asc分成四组:CD90 (+) / CD105 (−), CD90 (−) / CD105 (+), CD90 (+) / CD105(+),和CD90 (−) / CD105 (−)。在这个过程中,不能存活的细胞消除使用细胞生存能力分析(7-AAD细胞生存能力试验设备;生活技术,美国)。连续文化中的所有分类细胞存活的实验时间14天。

膜蛋白的表达模式的组间比较(图14天文化时期3)。CD90 (+) / CD105(−)细胞在DMEM CD105表达一点没有成骨的补充剂(正常介质);然而,成骨的中等高架CD105-positive细胞的数量,由BMP2恢复。相比之下,CD90 (−) / CD105(+)细胞开始表达CD90正常的媒介,而CD105表达降低成骨的中、后后续BMP2转染。CD90 (+) / CD105 (+) double-positive细胞群表达这两个标记更强烈文化中正常的媒介,而成骨的介质和BMP2转染显示减少CD105表达不改变CD90水平。最后,CD90 (−) / CD105(−)双重否定组改变其immunophenotype CD90(+)和/或CD105(+)在所有文化条件。有趣的是,研究种群的初始比例并没有改变数据在所有文化条件对asc无序(数据没有显示)。

总结这些结果,ASC标记CD90和CD105诱导期间文化在DMEM成骨的补充剂。相比之下,成骨的介质和BMP2转染导致减少CD105的表达。这表明CD105可能有一些相关细胞增殖而不是分化等活动。然而,CD90和CD105的表达在CD90 (−) / CD105(−)和无序对asc在所有培养条件(数据未显示),这表明自然感应CD90和/或CD105发生在脂肪细胞的文化。

3.3。基因聚类DNA芯片

34102个基因的表达在每个排序人口异形使用DNA微阵列。整个检查基因被分为组根据他们的生物作用和信号通路。提出了相似的基因表达模式识别和热图(图4、表2)。骨基因的表达变化进行分析的增殖,细胞粘附、成骨细胞、破骨细胞,具备干细胞。生长因子表达稍微在CD90 (−) / CD105(+)细胞,表明收购由于CD105-stimulated细胞增殖细胞附着。相反,许多adhesion-related基因表达CD90 (+) / CD105(+)和bmsc,而这些基因表达的只有弱CD90 (−) / CD105(−)人口。成骨细胞的基因高表达CD90 (+) / CD105(−)和CD90 (+) / CD105(+)细胞,而bmsc,代表成骨细胞,表达了较低水平。监测bmsc基因表达,但在一个小得多的程度上比在所有ASC组。如图4、表2Wnt健壮的表达式,与成骨细胞分化有关,被发现在CD90 (+) / CD105(+)细胞和一定程度上在CD90 (+) / CD105(−)和CD90 (−) / CD105 (+)。相比之下,CD90 (−) / CD105(−)和bmsc没有表达Wnt强烈。

3.4。有序的细胞的数量

BCA蛋白质化验显示,CD105-positive细胞,尤其是CD90 (−) / CD105(+),生产排序后的蛋白质浓度最高,表明细胞数量的人口增加了。相反,蛋白质含量最低的是发现CD105-negative人群如CD90 (−) / CD105(−),表明最小的人口的增长(图5(一个))。蛋白质浓度在统计学上不同CD90 (−) / CD105(−)和CD105-positive人群如CD90 (−) / CD105(+)和CD90 (+) / CD105 (+)。BMP2转染蛋白质浓度显著增加,即使在CD90 (+) / CD105(−)细胞,而CD90 (−) / CD105(−)(图5(一个))。此外,bmsc的数量少于对asc组排序,有或没有BMP2转染。

3.5。ALP-Positive细胞

定量分析的高山在所有组织进行染色。高山的比例正区域内文化进行了计算。所有对asc,除了CD90 (−) / CD105(−)和bmsc逐步ALP-positive细胞的数量增加和类似的文化在7天实验时间(数字5 (b)和5 (c))。当表达式对asc排序和无序之间相比,ALP-positive细胞更突出CD90 (+) / CD105 (−), CD90 (+) / CD105(+),和bmsc有或没有BMP2转染后7天的文化。定量高山活动是衡量正常化高山总额与总蛋白质。强大的高山活动和浓度检测,甚至在CD90 (−) / CD105(−)细胞转染与BMP2(图5 (d))。尽管高山活动被转染略微增加BMP2在大多数组织,这是只有在CD90还要高(−)/ CD105(−)细胞(图5 (d)),这可能导致非常低的蛋白质浓度检测到这些细胞(图5(一个))。

3.6。矿化结节

如图6,可以观察到明显的矿化结节在CD90 (+) / CD105(−)和无序对asc没有BMP2早在14天。然而,BMP2转染CD90矿化增加(+)/ CD105(−),略有CD90 (−) / CD105(+),尤其是在CD90 (+) / CD105 (+)。有趣的是,茜素红S染色对asc无序,矿物质沉积在14天,被BMP2转染不变,而CD90 (−) / CD105(−)没有表现出矿物吸附,即使转染。结节形成bmsc被BMP2减少,这可能是由于他们的潜力减少传播。

3.7。rt - pcr

PCR产物分离和分析用2%琼脂糖凝胶电泳(图7)。骨钙素,noncollagenous蛋白质中发现的骨头和牙质,被用作钙并列的标志。因此,我们分析了其表达式是否直接与茜素红染色。1型胶原蛋白的表达在CD90强(−)/ CD105(+)和CD90 (+) / CD105(+)细胞,转染BMP2。相比之下,PCR产品相应的骨钙素检测清楚BMP2-transfected CD90 (+) / CD105 (−), CD90 (−) / CD105(+),和CD90 (+) / CD105(+)细胞数量。

4所示。讨论

到目前为止,没有一个MSC-specific标记已被确认。提出了一些最低标准为人类msc、如以下几点:坚持塑料;的表达CD73, CD90、CD105;CD31的缺乏、CD34、CD45期间文化;向脂肪细胞分化的能力,软骨细胞,骨细胞(24]。鼠标msc类似于人类同行,除了它们缺乏或可以异构CD73和CD90 [25,26]。CD105 / endoglin高亲和力coreceptor转化生长因子(TGF)β1、TGF -β3 (27]。尽管CD105通常被认为是一个重要的MSC标记(24,28),一些报告显示,其表达变化取决于msc的来源(骨髓、脂肪组织、脐血、或胎盘),体外培养时间,和分化状态(29日- - - - - -32]。

SVF从脂肪组织主要由内皮细胞、造血细胞,对asc。大多数人类对asc CD105 (+), CD90 (+), CD34 (+), CD31(−)和DLK1 (+) (21]。相比之下,内皮细胞CD90 (−) CD34(−)和CD31 (+) (33),而造血分数的特点是CD105(−)在小鼠细胞[34]。在目前的研究中,对asc -的隔离CD105是形成人口成骨的要求。这是因为以前的研究显示,CD105(−)表现出增强的脂肪形成的和成骨的潜力也可能由于减少了TGF -β/ SMAD2信号(35,36]。然而,先前的研究在人类证明CD105增加和高度对asc的第五使表示早在(21,37- - - - - -39]。在当前的研究中,大多数在第二个通道被认为是对asc CD105 (+), CD90 (+), CD34(+)和CD31 (−)。因此,我们预测,只有一个小的人口CD105 SVF对asc (−)。然而,CD90 (−) / CD105(−)对asc是主要的人口被流式细胞仪。以前的报告表明,有一个小但不断减少CD105蛋白表达在小鼠的扩张对asc当文化成为支流,而CD105 mRNA水平增加或在通道的细胞中表达下调(40]。这支持了我们的结果从PCR(数据未显示)和流式细胞仪分析描述CD105表达的变化。因此,在使细胞膨胀,培养对asc的翻译可能会妨碍CD105自分泌或旁分泌的方式。此外,对asc CD105是主要运输车厢的本地化,并且只有少量外膜中被发现。虽然这可能会限制CD105抗原的检测,目前的研究清楚地显示一个小的人口CD105-positive细胞用流式细胞仪分析。

CD90是一种细胞外基质分子和间充质干细胞标记。加上CD105,它扮演了一个角色在允许细胞变成不朽和多功能(21]。也扮演了一个角色在骨CD146一起,胶原蛋白类型我和三世,骨桥蛋白和骨粘连蛋白(1]。因此,对asc CD90-positive具有很强的体外和体内成骨的能力41]。在最近的研究中,流式细胞仪分析显示大部分对asc表示CD90第二通道。然而,成骨的染色显示更强的染色CD90-positive组与对asc无序相比,表明的重要性这immunophenotype干细胞的分化成其他类型的细胞。

假设总蛋白量进行研究将相关细胞数量自CD105-positive种群子集产生增加蛋白质检测这里显示增加的总结细胞周期基因表达式在DNA芯片(图4、表2),这可能意味着细胞增殖;然而,仍然可能是一个飞跃的逻辑,然后总蛋白与其说代表细胞数量和细胞增殖活动只是用于成骨活动正常化。CD90 (+) / CD105(−)和CD90 (+) / CD105(+)细胞具有很强的成骨潜能,表现出矿化结节,而CD90 (−) / CD105(+)鼓励总蛋白可能间接与细胞增殖有关。这可能揭示CD90潜在作用和CD105在干细胞(35,36,41]。因此,强烈CD105的表达可能预测弱骨生成。然而,更强的染色的高山和矿化结节在CD90 (+) / CD105(+)比CD90 (−) / CD105(+)和CD90 (−) / CD105(−)人群,建议增殖由于强烈的CD105的表达。这随后CD90-stimulated分化影响的实验周期14天,在此期间CD105减毒。有趣的是,流式细胞仪分析显示,CD90表达式是在研究期间不变。一项研究报道,rat-derived间充质干细胞对骨失去能力增加通道(42]。这表明CD105的表达可能是保持在这种细胞群,虽然这不是调查。

许多报道已经证明了戏剧性的bmp对骨的影响,如成骨细胞的分化成熟细胞在体外或体内骨愈合在异构的细胞群。然而,只有少数研究基于cd评估他们在多功能的角色,immunophenotypically排序干细胞,尤其是对成骨细胞的分化40]。因此,目前尚不清楚哪些类型的细胞容易BMP-induced分化。目前的研究是第一个基于cd感染腺病毒携带BMP2 immunophenotypically排序干细胞。一般来说,媒体的成骨的影响包含地塞米松和我国在培养细胞有独立评估;因此,他们的潜在的协同或互惠对骨的影响尚未确定。在这项研究中,我们使用成骨的媒介与地塞米松补充确定外生BMP2加速骨与成骨的媒介。尽管没有戏剧性的影响BMP2高山活动被认为在7天之后,一个重要的矿化结节检测数量的增加,除了CD90 (−) / CD105(−)细胞,后14天。这表明高山活动7天前已经被激活,BMP2转染的矿化结节整体不改变矿化结节组间的相对数量。有趣的是,矿物沉积对asc无序没有受到BMP2的病毒转染。综上所述,这些数据表明,nonstem-like细胞,如CD90 (−) / CD105(−),可能在coculture调节干细胞。 For example, AdenoX-bmp2 accelerated osteoblastic differentiation, particularly in CD90-positive ASCs. Therefore, BMP2 had a lesser effect on osteogenesis in CD90-negative populations such as CD90(−)/CD105(−).

然而,适当的剂量BMP2的体内成骨细胞的成熟或骨生成应该优化。在当前的研究中,莫伊Adeno-bmp2 5.85×10⁶ifu / mL被用于病毒转染地塞米松对asc的媒介,这进一步增加了形成矿化结节通过成骨的中型和BMP2的协同效应。然而,AdenoX-bmp2的积极或消极的影响在不同的培养条件必须评估。在未来的研究中,应该执行病毒转染在生长介质或检查病毒基因转染的细胞因子或生长因子促进ASC-engineering生物学。

在目前的研究中,主要从皮下脂肪组织中提取细胞离心被称为对asc,即使他们包含许多CD90(−)和CD105(−)细胞可能不是确定为干细胞。虽然对asc隔离方法已经建立(4,5,22),大多数细胞颗粒是CD90 (−) / CD105 (−)。此外,这种双重否定的表达模式的人口,这表现出略微增加CD90和CD105表达在正常的媒介文化后,改变了显著增强CD90和减少CD105在成骨的介质和BMP2转染。事实上,这些nonstem细胞没有形成突出的矿化结节在任何媒体。此外,混合人口无序对asc没有显示尽可能多的矿化CD90-positive人口虽然重要CD90 (−) / CD105(−)细胞;这可能是由于CD90 (−) / CD105(−)细胞干扰对asc无序中其他细胞群。

这项研究报告的数据显示不同osteogenesis-related对asc immunophenotypically不同的特点。CD90,人口需要被定义为干细胞,有必要对成骨细胞的分化,而CD105和CD90很重要对成骨细胞的分化和扩张。在14天文化时期,CD105表达CD105-positive人口减少,如CD90 (−) / CD105(+)和CD90 (+) / CD105(+),成骨的中、后BMP2转染。尽管CD90-positive和CD105-negative细胞被认为是理想的骨在细胞工程(35,36),我们的微阵列分析表明,CD90 (+) / CD105对asc(+)也可能是有前途的候选人。此外,CD90 (+) / CD105(−)和CD90 (+) / CD105(+)人群中突出显示的潜力BMP2转染刺激形成的矿化结节。例如,BMP2可能允许在早期通过扩大细胞或文化分化为成骨细胞,间接,强烈的CD105的表达减少。

5。结论

对asc的成骨的能力不同的人群(表1)。此外,矿化结节形成的刺激对asc无序相媲美,bmsc的成骨的媒介,和BMP2显著增加形成的矿化结节尤其是CD90-positive人群,比如CD90 (+) / CD105(−)和CD90 (+) / CD105(+),观察CD105的表达下降。进一步的研究评估不同的对asc immunophenotypes应该执行开发细胞组织工程。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

舞妓山本,Hidemi醒来时,真嗣黑田的构思和设计实验。舞妓山本,Hidemi醒来时,贾庆林,Joshua周Shohei Kasugai,和真嗣黑田进行了实验。舞妓山本,Hidemi醒来时,贾庆林,约书亚周,真嗣黑田分析数据。舞妓山本,Hidemi醒来时,贾庆林,约书亚周,真嗣黑田导致试剂/材料/分析工具。舞妓山本,Hidemi醒来,Shohei Kasugai,真嗣黑田写了论文。

确认

作者承认美智子铃木博士研究助理在口服移植学和再生牙医学、东京医疗和牙科大学,东京,日本,技术咨询。这项研究得到了日本社会科学促进批准号23659940和全球卓越中心的资助项目前沿研究分子破坏和重建牙齿和骨骼,东京医疗和牙科大学。